全 文 :2007 年 12 月第 14 卷第 12 期 中国中医药信息杂志 ·21·
竹节参总皂苷对脑缺血再灌注模型海马组织
一氧化氮合酶的影响
赵 晖 1,2,邹海艳 1,徐 萌 1,闫晓媛 1,薛 璞 1
(1.首都医科大学中医药学院,北京 100013;2.北京中医药大学中药学院,北京 100102)
摘要:目的 观察竹节参总皂苷(total rhizoma panacis japonica saponins,tRPJS)对反复脑缺血再灌注小鼠
及局灶性脑缺血再灌注大鼠海马组织一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的影响,探讨药物抗脑缺血损
伤的作用机制。方法 插线法阻塞大脑中动脉(MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,采用反复夹闭双侧颈总动脉
的方法造成小鼠脑缺血再灌注模型,研究 tRPJS 对这两种脑缺血再灌注损伤模型海马组织 NOS、iNOS 的影响。结果
tRPJS 能显著降低脑缺血再灌注损伤小鼠和局灶性脑缺血大鼠海马组织 NOS、iNOS 的含量(P <0.05)。结论 tRPJS
抗脑缺血损伤与降低海马组织 NOS、iNOS 的活性有关。
关键词:竹节参总皂苷;脑缺血;一氧化氮合酶
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2007)12-0021-02
Effects of Total Rhizoma Panacis Japonica Saponins on Nitric Oxide Synthase of Hippocampus
Region in the Mouse Repetitious Cerebral Ischemia Reperfusion and the Rat Focal Cerebral
Ischemia ZHAO Hui1,2, ZOU Hai-yan1, XU Meng1, et al (1.College of TCM, Capital University of Medical Sciences,
Beijing 100013, China;2.School of Chinese pharmacy, Beijing University of TCM, Beijing 100102, China)
Abstract:Objective To study the mechanism of protective effects of total rhizoma panacis japonica
saponins (tRPJS) on the cerebral ischemia injury. Methods The middle cerebral artery occlusion model
(MCAO) in rats and cerebral ischemia-reperfusion models in mice were used to investigate the influence of
tRPJS on the nitric oxide synthase (NOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity in
hippocampus region. Results tRPJS significantly decreased the contents of NOS and iNOS in hippocampus
region of MCAO rat and cerebral ischemia reinfusion mouse. Conclusion tRPJS has significantly protective
effects by decreasing NOS and iNOS.
Key words:total thizoma panacis japonica saponins;cerebral ischemia;nitric oxide synthase
大量研究表明,一氧化氮(NO)在急性脑缺血损伤中具有神
经保护和神经毒性两种不同作用[1]。NO 的双重作用除与自身复
杂的理化、生物学特性有关外,一氧化氮合酶(NOS)作为 NO 合
成过程中的重要限速酶,是决定其双重作用的关键因素。目前,
诱导型 NOS(iNOS)被认为是一种“病理型的酶”,在免疫刺激
后表达,持续产生的 NO 与细胞毒作用有关[2]。海马是脑组织中
对缺血、缺氧最敏感的区域之一,NOS 及 iNOS 活力的变化与
海马神经元的损伤具有相关性。通过检测反复脑缺血再灌注
小鼠及局灶性脑缺血再灌注大鼠这两种脑缺血损伤模型的海
马组织 NOS 及 iNOS 活力的变化,探讨竹节参总皂苷(total
rhizoma panacis japonica saponins,tRPJS)抗脑缺血损伤的
作用机理。
1 实验材料
1.1 动物
ICL 雄性小鼠,清洁级,体重 25~30 g,首都医科大学动物
中心提供,合格证号:scxkc(京)72000-0012;SD 雄性大鼠,清
洁级,体重 280~300 g,北京维通利华实验动物技术有限公司
提供,合格证号:SCXK11-00-0008。
基金项目:北京市优秀人才资助项目(20051D0501823)
1.2 药物与试剂
tPRJS,首都医科大学中医药学院中药化学实验室提供,临
用前以生理盐水稀释至所需浓度。NOS 测定试剂盒、蛋白质测
定试剂盒(考马斯亮兰法)均购自南京建成生物工程研究所。
1.3 仪器
752N 型分光光度计,上海精密科学仪器有限公司生产;
TGL-16g 型高速台式离心机,上海医用分析仪器厂生产;
AEG-220 电子分析天平,日本 Shimadzu 公司;DY89-1 型电动玻
璃匀浆机,宁波新芝生物科技股份有限公司。
2 实验方法
2.1 反复脑缺血再灌注小鼠模型的制备
小鼠麻醉,仰卧固定,颈正中切口,分离双侧颈总动脉及伴
行神经,用动脉夹夹闭双侧颈总动脉,缺血 20 min 后松开双侧
动脉夹,恢复脑血流 20 min,如此反复操作 3 次,最后恢复供血,
缝合皮肤。假手术组小鼠麻醉后,仅暴露双侧颈总动脉,不进行
脑缺血再灌注。术中、术后室温控制在 24~25 ℃。动物麻醉
清醒后(术后约 60 min)进行神经功能损害评分[3],如分值在 2
分或 2分以上则认为模型制作成功并纳入实验研究。
2.2 局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的制备
参照 Koizumi 法[4]制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。大鼠
·22· Chinese Journal of Information on TCM Dec.2007 Vol.14 No.12
麻醉,仰卧固定,颈正中切口,依次暴露右侧颈总、颈外和颈内
动脉,结扎颈总动脉、颈外动脉,于颈总动脉分叉下方剪一切口,
将预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线(长 4 cm,直径 0.25 mm)置
于颈内动脉 17~18 mm,到有轻微阻力感为止,扎紧动脉残端,
缝合皮肤,缺血 2 h 后,将尼龙线轻轻拨出再灌。假手术组大鼠
麻醉后,仅暴露颈内外动脉分支,不闭塞大脑中动脉。术中、术
后室温严格控制在 24~25 ℃,大鼠体温维持在 36.5~
37.5 ℃。采用 Bederson 等[5]介绍的神经功能评分法对麻醉清
醒后(术后约 70 min)的大鼠进行评分,如分值在 2分或 2分以
上则认为模型制作成功并纳入实验研究。
2.3 分组及给药
反复脑缺血再灌小鼠模型制备成功后,将实验动物随机分
为5组,即假手术对照组、模型组及tRPJS组(260、130、65 mg/kg)。
用药组先腹腔注射给药 2 d,第 3 天给药后 20 min 施行手术,
术后每 8 h 给药 1次。假手术对照组、模型组腹腔注射等量的
生理盐水。局灶性脑缺血再灌大鼠模型制备完成后,将实验动
物随机分为 5 组,即假手术对照组、模型组及 tRPJS 组(200、
100、50 mg/kg)。用药组先腹腔注射给药 2 d,第 3 d 给药后
20 min 施行手术,术后每 8 h 给药 1次。假手术对照组、模型
组腹腔注射等量的生理盐水。
2.4 脑组织匀浆的制备
反复脑缺血再灌小鼠术后24 h断头处死,迅速放入冰盒中
分离各组小鼠的海马组织。局灶性脑缺血再灌大鼠再灌 22 h
后断头处死,在冰浴中分离大鼠缺血侧海马(右侧)。分离后的
海马组织均称重后放入预冰的生理盐水中,冰浴中制成 10%的
组织匀浆,3 000 r/min 离心 10 min,取上清。按 NOS 及蛋白质
测定试剂盒说明书分别进行测定。
2.5 统计学方法
实验数据以—x±s 表示,均使用 SPSS 10.0 统计软件,进行方
差分析。
3 结果(见表 1、表 2)
表 1 tRPJS 对反复脑缺血再灌注小鼠海马组织 NOS、iNOS
含量的影响(—x±s,U/mg)
组别 n 剂量(mg/kg) NOS iNOS
假手术组 8 1.79±0.38 0.91±0.10
模型组 8 10.03±0.84* 7.13±0.49*
tRPJS 组 8 260 8.08±0.42# 5.56±0.53#
8 130 8.51±0.50# 5.93±0.64#
8 65 9.39±0.17# 6.05±0.60#
注:与假手术组比较,*P <0.05;与模型组比较,#P <0.05(下同)。
表 2 tRPJS 对局灶性脑缺血大鼠海马组织 NOS、iNOS 的影
响(—x±s,U/mg)
组别 n 剂量(mg/kg) NOS iNOS
假手术组 8 1.50±0.35 0.89±0.10
模型组 8 9.40±0.64* 8.03±0.76*
tRPJS 组 8 200 7.70±0.44# 6.93±0.97#
8 100 8.26±0.66# 7.43±0.75#
8 50 8.64±0.40# 7.93±0.71#
4 讨论
NO 作为信使分子对脑缺血疾病的作用研究已相当广泛,
在脑缺血早期短暂的 NO 增高,可以通过扩张血管维持脑血流,
防止血小板和白细胞的聚集与粘附及下调 N-甲基-D-天冬氨
酸(NMDA)受体而起到神经保护作用。但在脑缺血亚急性期,随
着 NO 的大量产生,缺血脑组织通过 NMDA 受体介导谷氨酸神经
毒性作用,发挥 NO 的细胞毒作用[6]。正是由于 NO 作用的双重
性,研究脑缺血过程中不同功能的NOS及其产物NO的作用将有
助于临床脑缺血损伤的治疗。目前比较一致的看法是,缺血早
期 NO 主要由原生型 NOS(cNOS)合成,它对维持血管内皮功能、
抗白细胞粘附和维持脑微循环通畅有益,过早抑制 cNOS 合成
NO 可加重缺血性脑损伤;脑缺血和(或)再灌注 12 h~4 d 时
脑组织NO主要由诱生型(iNOS)合成,由iNOS所产生的NO可能
直接或者通过其衍生物导致能量耗竭,促进 DNA 的损害,抑制
DNA 的合成,诱导细胞程序性死亡,增加缺血后兴奋性神经递
质的释放而加重缺血性损害,应用 iNOS 抑制剂可明显减轻脑
损伤。本实验观察到,反复脑缺血再灌小鼠及局灶性脑缺血再
灌大鼠在缺血损伤 24 h 后,海马组织 NOS 明显升高,特别是
iNOS 与假手术组相比升高显著。这就进一步证实 iNOS 的活性
增高、NO 的过度生成与缺血性损伤有密切关系。tRPJS 是从五
加科植物竹节参Panax Japonicus C.A Meyer根茎中提取的主要
有效活性部位,其主要成分包括竹节人参皂苷(chikusetsu-
sapnin)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,人参皂苷(ginsenoside) Rd、Re、Rg1、Rg2 ,
三七皂苷 R2(notoginsenosideR2)。本室前期的药理实验证
明,tRPJS 对脑缺血动物模型有很好的保护作用,利用反复脑
缺血再灌注小鼠及局灶性脑缺血再灌大鼠这两种脑缺血损伤
模型,我们发现,tRPJS 能明显降低脑缺血损伤动物海马组织
NOS、iNOS 的活性(P <0.05),表明 tRPJS 保护脑缺血损伤的机
理与阻抑 NOS、iNOS 的过度表达有关。
参考文献:
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(收稿日期:2007-02-28,编辑:华强)