全 文 ：乌头汤对 RA大鼠相关细胞因子影响的研究
刘伟栋 1 ,施旭光 2 ,旷永强 1 ,赵玉涛 1 ,曾伟权 1
(1.广东省增城市中医院 ,广东 增城 511300;2.广州中医药大学中药学院 ,广东 广州 510405)
摘要 目的:探讨乌头汤的抗炎镇痛作用及其对佐剂性关节炎大鼠血清中 IL-1β、TNF-α含量的影响。方法:
采用小鼠耳肿胀法 、毛细血管通透法 、醋酸扭体法研究乌头汤的抗炎镇痛作用。用完全弗氏佐剂诱导大鼠关节炎
模型 ,并用乌头汤进行干预 , 采用放射免疫法测定大鼠血清中 IL-1β、TNF-α的含量。结果:乌头汤有较明显的抗炎
镇痛作用。不同剂量乌头汤对佐剂性关节炎大鼠血清 IL-1β、TNF-α有一定的抑制作用。
关键词 乌头汤;抗炎;AA大鼠;血清细胞因子
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2009)08-1267-03
收稿日期:2008-07-16
乌头汤是东汉著名医家张仲景创制的一首名
方 ,该方由制川乌 、黄芪 、麻黄 、芍药 、炙甘草组成 ,具
有温经散寒 、祛湿止痛的功效 ,主治寒湿痹证 。经临
床证实本方对类风湿关节炎 (rheumatoidarthritis,
RA)有确切的治疗作用〔1〕 ,动物实验证实该方具有
一定的抗急慢性炎症 、镇痛作用 ,其中抗急性炎症的
效果较好 〔2, 3〕。但关于其抗炎镇痛作用机理的研究
报道不多 。本实验拟研究不同剂量乌头汤的抗炎镇
痛作用 ,并复制 AA大鼠模型 ,观察乌头汤对 AA大
鼠血清相关细胞因子 IL-1β、TNF-α的影响 ,为乌头
汤的临床应用提供实验依据 。
1 材料与仪器
1.1 实验动物 SPF级 2 ～ 3月龄昆明种小鼠 ,体
质量 18 ～ 22 g, 雌雄兼用 , 许可证号:粤监证字
2005A005;SPF级 SD雌性大鼠 ,体质量 180 ～ 220g,
雌雄兼用 ,许可证号:SCXK粤 2003-0001,由广州中
医药大学实验动物中心提供 。
1.2 药物与试剂 制川乌 、麻黄 、白芍 、黄芪 、炙甘
草均购于广州中医药大学第一附属医院门诊部中药
房。消炎痛购于广州中医药大学门诊部西药房(厂
家:河南安阳华安制药有限公司 , 批号:050608)。
实验时按上述组方及剂量配齐药物 ,制川乌洗净后 ,
加水浸泡 60min,先煎 1h,加入其余各药同煎 1 h,
过滤 ,药渣再加水煎煮 1 h,过滤 ,合并两次滤液 ,煎
取液分别置于 60 ℃水浴中 ,浓缩至生药含量 0.5g/
mL, 4 ℃冰箱保存备用 ,用时再配制为所需浓度。
1.3 试剂与仪器 完全弗氏佐剂(Sigma公司);
IL-1β试剂盒 (IL-1β RIAKit)(批号:20050825)、
TNF-α试剂盒(TNF-αRIAKit)(批号:20050825),
均由解放军总医院科技开发中心放免所提供;TSN-
695B型 γ放免测量仪(上海日环仪器厂)LDZ4-0.8
型自动平衡离心机(北京医用离心机厂)。
2 方法
2.1 实验动物分组与给药 动物随机分为 5组:
模型对照组 ,灌胃等容积生理盐水(10 mL/kg), 1
次 /天;阳性对照组 , 灌胃吲哚美辛(消炎痛)1mg/
kg, 1次 /天;乌头汤高剂量组(乌高组),灌胃乌头汤
7 g/kg, 1次 /天;乌头汤中剂量组(乌中组),灌胃乌
头汤 3.5 g/kg, 1次 /天;乌头汤低剂量组(乌低组),
灌胃乌头汤 1.75g/kg, 1次 /天 。
2.2 乌头汤对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 取昆
明种小鼠 60只 ,雌雄各半 ,按上述分组处理给药 ,连
续给药 3 d。于末次给药后 0.5 h,将 0.02mL二甲
苯均匀涂于每只小鼠右耳耳廓两面致炎 ,左耳不涂
作为正常耳。 1 h后脱颈椎处死各小鼠 ,用直径 8
mm打孔器在左 、右耳同一部位打下同样大小圆耳
片 ,用电子天平称量质量 ,以右耳质量减去左耳质量
为肿胀度 ,分别计算耳肿胀度及肿胀抑制率。
肿胀抑制率(%)=对照组平均肿胀度 -给药组平均肿胀度对照组平均肿胀度 ×100%
2.3 乌头汤对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
取小鼠随机分组(给药方法同 “ 2.1”项),末次给药
后 1 h尾静脉注射 1%伊文思蓝 10 mL/kg,同时腹
腔注射 0.6%醋酸 10 mL/kg, 20min后脱颈椎处死 ,
打开腹腔 ,用 6 mL蒸馏水冲洗腹腔 ,吸取腹腔洗液 ,
测定光密度 D(λ)值 ,并计算药物对渗出量的抑制率。
抑制率(%)=对照组渗出量 -给药组渗出量对照组渗出量 ×100%
2.4 乌头汤对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 取
小鼠随机分组(给药方法同 “2.1”项)。末次给药 1
h后 ,各鼠腹腔注射醋酸溶液 10 mL/kg,观察并记录
20 min内各组小鼠发生扭体反应的次数。
镇痛率(%)=对照组平均扭体次数 -给药组平均扭体次数对照组平均扭体次数 ×100%
2.5 乌头汤对佐剂性关节炎大鼠血清 IL-1β、TNF-
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α的影响 按照传统的造模方法〔4〕 ,分别给每鼠右
后足趾皮下注射 0.1 mL含有卡介苗的完全弗氏佐
剂(正常组注射 0.1mL生理盐水)。在大鼠的尾根
部皮下分 2 ～ 3点注射完全弗氏佐剂 0.1 mL〔5〕。末
次给药后 ,断头取血约 2 ～ 3 mL置离心管中静置 ,
3 000r/min离心 15 min,分离血清于 -70℃保存 ,
待测血清中 IL-1β、TNF-α含量 。
2.6 统计学处理 测定数据以 x±s表示 ,数据结
果采用 SPSS11.5统计软件进行分析 ,组间比较采
用 t检验 。
3 结果
3.1 乌头汤对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 结果
如表 1所示 ,各剂量乌头汤与消炎痛均能不同程度
抑制二甲苯所致小鼠二甲苯所致的耳肿胀。
表 1 乌头汤对二甲苯致小鼠耳肿
胀的影响( x±s, n=12)
组别 剂量 /(g/kg) 左耳质量 /mg 右耳质量 /mg 鼠耳肿胀度 /mg
肿胀抑制率 /%
模型组 - 16.6±3.3 28.4±4.8 11.8±2.7 -
消炎痛组 0.01 16.9±2.8 21.8±4.0 4.9±1.3＊＊ 58.4
乌高组 7 16.5±3.1 23.6±5.1 7.1±1.1＊＊ 39.8
乌中组 3.5 16.5±3.5 25.3±5.4 8.8±1.5＊ 18.6
乌低组 1.75 17.2±4.1 26.2±5.8 9.0±1.4＊ 23.7
注:与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.2 乌头汤对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
结果如表 2所示 ,各剂量乌头汤与消炎痛均能不同
程度降低小鼠腹腔毛细血管的通透性。
表 2 乌头汤对小鼠腹腔毛细血管通
透性的影响( x±s, n=12)
组别 剂量 /(g/kg) 腹腔透出染料D(λ)值 抑制率 /%
模型组 - 0.55±0.042 -
消炎痛组 0.01 0.23±0.016＊＊ 58.1
乌高组 7 0.31±0.018＊ 43.6
乌中组 3.5 0.38±0.016＊ 30.9
乌低组 1.75 0.41±0.013＊ 25.4
注:与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.3 乌头汤对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 结
果如表 3所示 ,各剂量乌头汤与消炎痛均能使小鼠
出现扭体反应的潜伏期延长并使扭体次数减少。
3.4 乌头汤对佐剂性关节炎大鼠血清 IL-1β、TNF-
α的影响 结果如表 4所示 ,与正常对照组比较 ,模
型组大鼠血清 IL-1β、TNF-α水平显著升高;与模型
组比较 ,乌头汤各剂量组及消炎痛组大鼠血清 IL-
1β、TNF-α水平显著下降 ,表明乌头汤对佐剂性关节
炎大鼠血清细胞因子 IL-1β、TNF-α有一定的抑制作
用 。
表 3 乌头汤对醋酸扭体法小鼠疼痛
反应的影响( x±s, n=10)
组别 剂量 /(g/kg) 潜伏期 /min 扭体次数 /次 镇痛率 /%
模型组 - 1.8±0.7 25.3±7.1 -
消炎痛组 0.01 9.2±3.3＊＊ 10.2±3.2＊＊ 59.6
乌高组 7 4.0±2.6＊ 13.4±3.7＊＊ 47.0
乌中组 3.5 4.3±2.1＊ 15.3±4.1＊＊ 39.2
乌低组 1.75 4.6±2.3＊ 17.6±3.6＊＊ 30.4
注:与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
表 4 乌头汤对佐剂性关节炎大鼠血清 IL-1β 、
TNF-α含量的影响( x±s, n=8)
组别 剂量 /(g/kg) IL-1β/(ng/mL) TNF-α/(ng/mL)
正常对照组 - 0.38±0.03 1.41±0.03
模型组 - 0.66±0.04## 2.50±0.31##
乌高组 7 0.41±0.02＊＊ 1.57±0.02＊＊
乌中组 3.5 0.48±0.22＊＊ 1.75±0.03＊
乌低组 1.75 0.61±0.02 1.86±0.04＊
消炎痛组 0.01 0.40±0.11＊＊ 1.60±0.02＊＊
注:与正常对照组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊P<
0.05, ＊＊P<0.01
4 讨论
类风湿关节炎(RA)是一种慢性 、炎性 、系统性
的自身免疫性疾病 ,临床特征为局部关节疼痛 、功能
障碍 、伴有全身性轻 、中度发热等。该病在世界范围
内普遍存在 ,其病理机制目前尚不清楚 ,许多研究已
表明淋巴细胞 、中性粒细胞 、巨噬细胞 、滑膜细胞等
多种炎症细胞介导的异常细胞免疫 、体液免疫 ,导致
关节局部和全身的免疫功能紊乱 ,在 RA的病理过
程中起着重要作用。
有体液免疫与细胞免疫参与的类风湿关节炎发
病机制中 ,细胞免疫作用更突出〔6〕。根据来源不
同 ,可将细胞因子分为两大类:一类为 T淋巴细胞
产生的淋巴因子 ,包括 IL-2、IL-4、IFN、IL-5等;另一
类主要为由单核 /巨噬细胞产生的单核因子 ,包括
IL-1、IL-6、IL-8、TNF、GM-CSF等。单核因子在 RA
的急性滑膜炎症 、滑膜纤维化 、骨和软骨破坏中起重
要作用 。且各因子的作用并不是独立的 ,而是处于
细胞因子网络中 ,有的相互协同 ,有的相互拮抗 ,制
约或促进病情的发生发展 。
IL-1是重要的炎症介质 ,能促进骨髓释放中性
粒细胞 ,诱导单核细胞和多核粒细胞趋化浸润到炎
症局部 ,在局部释放溶酶体酶;能引起嗜碱粒细胞和
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肥大细胞脱颗粒 ,释放炎症介质〔7〕;IL-1是促使 RA
病理发展的重要因子 ,在类风湿性关节炎的关节腔
中可检出 IL-1。其在 RA中的作用首先表现在 RA
病变早期可协助其它细胞迁徙和刺激内皮细胞的各
种反应 , 促使滑膜细胞和软骨细胞增殖并产生
PGE2 、胶原酶和磷脂酶 A等 ,引起关节炎症。 IL-1
还能诱导成纤维细胞增殖 ,诱导上皮细胞 、成骨细胞
产生胶原蛋白 ,诱导破骨细胞 、成纤维细胞和软骨细
胞等释放胶原酶分解胶原蛋白 ,介导关节瘢痕的产
生和纤维化。故通过抑制 IL-1β的产生阻止滑膜成
纤维细胞的过度增殖是 RA治疗的可取途径之一。
在活动性 RA中 , TNF-α〔8〕参与 3种主要病理过
程:①激活血管内皮细胞 ,增强内皮细胞黏附分子的
表达 ,在关节炎时 ,血液中的白细胞正是通过与黏附
分子互相作用被汇集到关节腔的。 ②刺激结缔组织
细胞和多形核细胞产生前列腺素等小分子炎症介
质。 ③通过刺激滑膜细胞 、软骨细胞及破骨细胞 ,减
少糖蛋白合成 ,增加蛋白降解 ,并产生胶原酶及其他
中性蛋白酶 ,释放骨钙等 ,从而导致骨和软骨的破坏
及骨关节运动障碍 。此外 , TNF-α又能诱导其他细
胞因子 ,包括 IL-1、单核粒细胞刺激因子的产生 ,而
IL-1能提高 TNF-α的活性 ,两者有协同作用 ,介导
对关节组织的破坏。因此通过抑制 TNF-α的产生 ,
阻止滑膜成纤维细胞的过度增殖是 RA治疗的可取
途径之一 。
本实验结果显示 ,与正常对照组相比 ,模型组大
鼠血清中细胞因子含量显著升高(P<0.01),说明
RA过程中确实存在着 IL-1、TNF-α过度分泌的现
象;与模型组比较 ,乌头汤各剂量均能使模型组大鼠
血清中细胞因子 IL-1β、TNF-α分泌水平发生不同程
度的下调。
本实验结果表明 ,乌头汤治疗类风湿性关节炎
的机制可能是通过抑制血清中细胞因子 IL-1β、
TNF-α的分泌水平 ,从而阻止滑膜成纤维细胞的过
度增殖 ,在细胞因子网络水平上发挥免疫调控作用
而达到抗类风湿关节炎的目的 。
参 考 文 献
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《中药材 》杂志征稿内容
1 药用植物栽培 ,包括野生药材变家种 ,引种药材和异地药材的引种驯化 ,道地药材的研究 ,培育优良品种 , 防治病虫害 , 改
革耕作制度 ,提高产量 、质量 , 组织培养 ,药用真菌的栽培及 GAP基地的建设等。
2 动物药研究 ,包括药用动物的饲养和管理 ,资源 、生态 、习性的调查与观察;野生变家养与异地引种品种的驯化;用新技术 、
新方法提高动物药的产量与质量;动物药的药理 、药化和临床实验等。
3 中药材鉴别 ,加工炮制和商品养护。
4 中药资源的合理开发和利用。
5 中药化学 ,药理与临床试验。
6 国外药材的生产研究成果和动向。
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8 基础理论讲座 ,文献综述 ,专论 , 考证 ,译文 , 中药剂型改革 ,制剂 , 用药 ,药膳 , 经验以及报道中药店(房)的文章等。
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