全 文 ：doi10. 16473 / j. cnki. xblykx1972. 2016. 02. 004
滇牡丹 ω-6 脂肪酸脱氢酶基因的克隆与功能分析
*
李苏雨1，王毅2，3，原晓龙2，3，王娟2，3，杨宇明2，3
(1. 西南林业大学，云南 昆明 650224;2. 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，
云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南 昆明 650201;3. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201)
摘要:ω-6 脂肪酸脱氢酶 (FAD2)是亚油酸合成的关键酶，催化油酸脱氢形成亚油酸。以滇牡丹种子为材料，
研究根据转录组数据设计的特异引物，采用 ＲT-PCＲ方法，克隆滇牡丹 ω-6 脂肪酸脱氢酶 (FAD2)并分析其功
能。获得一个 ω-6 脂肪酸脱氢酶基因，将其命名为 PdFAD2。结果表明，该基因与芍药的同源性为 98. 7%。经氨
基酸序列比对，推断滇牡丹 FAD2 具有植物 FAD2 特有的 3 个组氨酸区，包含完整的 cDNA开放阅读框，由1 155
bp组成，编码 384 个氨基酸残基。半定量 PCＲ的结果显示，滇牡丹 FAD2 基因在花、茎、叶、种子中均有表达，
在根中只有微弱表达。研究结果为研究滇牡丹不饱和脂肪酸代谢奠定基础，也为油用滇牡丹育种提供理论依据。
关键词:ω-6 脂肪酸脱氢酶;滇牡丹;基因克隆;基因功能分析
中图分类号:S 685. 11 文献标识码:A 文章编号:1672－8246 (2016)02－0022－07
Cloning and Functional Analysis of Omega-6 Fatty Acid
Desaturase Gene from Paeonia delavayi
LI Su-yu1，WANG Yi 2，3，YUAN Xiao-long2，3，WANG Juan2，3，YANG Yu-ming2，3
(1. Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China;2. The Key Laboratory of Ｒare and
Endangered Forest Plants of State Forestry Administration，Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;
3. The Key Laboratory of Forest Plants Cultivation and Utilization，Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China)
Abstract:Omega-6 fatty acid desaturase (FAD2) is a critical enzyme in linoleic acid biosynthesis，and it converts
oleic acid to linoleic acid by desaturation． In this study，an omega-6 fatty acid desaturase was obtained from Paeonia
delavayi，which shared 98. 7% identities with that of Peaonia lactiflora，and named PdFAD2． Homology analysis
showed that deduced PdFAD2 protein has three conserved histidine motifs. Expression profiling analysis revealed that
PdFAD2 was expressed strongly in flower，stem，leaf and seed but slightly expressed in root． This result will pro-
vide basic information for unsaturated fatty acid biosynthesis research and molecular breeding in Paeonia delavayi．
Key words:omega-6 fatty acid desaturase;Paeonia delavayi;gene clone;gene function analysis
多不饱和脂肪酸 (PUFAs)能促进幼儿视网
膜、大脑和神经系统发育;还可降低人体心血管疾
病和炎症的发生几率，同时具有抑制体外培养的乳
腺、前列腺和结肠癌细胞增生，促进细胞凋亡等功
能［1 ～ 2］，多不饱和脂肪酸作为保健型油脂，还具有
降胆固醇，降血脂，减肥及抗癌等作用。多不饱和
脂肪酸主要是指含有 2 个或 2 个以上双键的长链脂
肪酸，碳原子数目一般为 18 ～ 22 个，包括:亚油
酸 (LA)，α-亚麻酸 (ALA)、二十碳五烯酸
(EPA)、二十二碳六烯酸 (DHA)、花生四烯酸
第 45 卷 第 2 期
2016 年 4 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 45 No. 2
Apr. 2016
* 收稿日期:2015－11－05
基金项目:云南省科技计划项目 (2015A005)，云南省应用基础研究重点项目 (2013FA054)，云南省中青年学术技术带头人后备人
才培养项目 (2010CI016)。
第一作者简介:李苏雨 (1990－ )，女，硕士生，主要从事植物学研究。E－mail:sue20120723@ 163． com
通讯作者简介:杨宇明 (1955－ )，男，教授，博士，主要从事竹藤和生物多样性研究。E－mail:yymbamb@ yahoo． corn． cn
(AＲA)等。其中，根据距离甲基端第 1 个双键位
置不同可以将多不饱和脂肪酸分为 ω-3、ω-6、ω-
7、ω-9 等系列［1］。其中，亚油酸是重要多不饱和
脂肪酸 (如亚麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸
及二十二碳六烯酸)，是某些生理调节物质 (如前
列腺素)的前体。而亚油酸在人体中不能自身合
成，因此人体主要从海洋鱼类和植物种子油来获
取［3］。对亚油酸的生物合成研究已经从植物延伸
到微生物［3］ (廖灵旋，2014)，国内外研究者都希
望通过对亚油酸生物合成的了解，能够改良植物种
子油脂的品质，也希望通过微生物发酵方式获得亚
油酸及其他多不饱和脂肪酸［4］。
ω-6 脂肪酸脱氢酶是亚油酸合成的关键酶，在
油酸的△12 位上加上一个双键形成亚油酸［5］。编
码 ω-6 脂肪酸脱氢酶的基因主要包括位于内质网上
的 FAD2 (delta-12-fatty acid desaturase)和位于质
体中的 FAD6［5 ～ 6］。ω-6 脂肪酸脱氢酶基因被认为
是控制高油酸特性的重要基因［7 ～ 8］。目前，已经有
许多参与脂肪酸代谢的酶基因被用于改良种子油脂
的品质，其中也包括 ω-6 脂肪酸脱氢酶［4，9］。比如
将欧洲油菜 (Brassica napus)的 ω-6 脂肪酸脱氢酶
转入棉花 (Gossypium hirsutum)中能够提高棉籽亚
油酸的含量［10］，研究人员也利用 ＲNA干扰技术使
棉花 ω-6 脂肪酸脱氢酶的调控基因失活后，明显提
高棉籽油中亚油酸含量［11］。这些研究证明 ω-6 脂
肪酸脱氢酶是植物中多不饱和酸生物合成的关键
酶，同时扮演调控多不饱和酸成分含量的作用。
滇牡丹 (Paeonia delavayi)是芍药属 (Paeo-
nia)分布最南的一个牡丹类群，是珍贵的牡丹育
种材料［12 ～ 13］。但其地理分布区狭窄，主要分布于
云南中部至西北部、四川西南部和西藏东南部，分
布区海拔从 1 900 ～ 3 600m，并且仅零散分布于该
地区。因此，1992 年 《中国植物红皮书》将滇牡
丹列为渐危种［14］，1996 年中华人民共和国野生植
物保护条例将其定为国家二级保护植物。虽然滇牡
丹作为西南地区特有种，自然分布很狭窄，但是其
栽培范围却很广，几乎遍及整个北半球［12］。对滇
牡丹之前的研究主要集中在其分类学［15］、园艺
学［16］、资源调查［17］以及保护等方面［18］。随着
2011 年中华人民共和国卫生部将牡丹籽油列入新
资源食品，课题组对滇牡丹种子油脂含量进行测
定，发现滇牡丹种子油脂中亚油酸和亚麻酸含量明
显高于普通的牡丹籽油，因此，滇牡丹作为油料植
物开发具有巨大的潜力。本文采用 ＲT-PCＲ 方法克
隆获得亚油酸合成的关键酶基因，ω-6 脂肪酸脱氢
酶，使用 Protparam、NCBI OＲF Finder 和 DNAMAN
生物学软件对其核酸和氨基酸同源序列进行生物学
分析，利用 ＲT-PCＲ方法检测基因表达情况，为未
来油用滇牡丹育种奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
滇牡丹种子，2014 年 6 月采集于云南省玉溪
市澄江县梁王山，种子采集后，迅速放入液氮中，
保存直至 ＲNA 提取。pESY-T3 克隆试剂盒及感受
态细胞 (购于北京全式金公司);LA-Taq酶、以及
Ｒeverse Transcriptase M-MLV (大连宝生物公司)。
1. 2 总 ＲNA的抽提及 cDNA第一条链合成
总 ＲNA 提取采用上海生工 Trizol 试剂。并将
提取的总 ＲNA 稀释，用紫外分光光度计测定
OD260 和 OD280 数值，计算出总 ＲNA 的浓度，并
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总 ＲNA 完整
性。对所提滇牡丹不同组织的总 ＲNA，分别采用
TAKAＲA PrimeScriptTM ＲT reagent kit with gDNA E-
raser试剂盒进行反转录，合成 cDNA第一链。
1. 3 滇牡丹 FAD2 基因的 5ＲACE
由于转录组数据分析只得到滇牡丹 FAD2 的片
段，缺少 5端的基因序列。因此，首先以滇牡丹
种子的 ＲNA 为模板，按照 5-Full ＲACE Core Set
with PrimeScriptTM ＲTase (TaKaＲa)试剂盒说明书
合成 5端完整的滇牡丹 cDNA第一链。根据获得的
HDＲ基因片段序列设计 5ＲACE 引物 (表 1)，对
滇牡丹 FAD2 基因片段的 5基因片段进行克隆。
1. 4 滇牡丹 FAD2 基因 cDNA全长扩增
依据 cDNA拼接序列，设计 FAD2 基因特异引
物 PdFAD2F0 和 PdFAD2Ｒ0 (表 1)，以滇牡丹种子
的 cDNA 为模板，PdFAD2F0 和 PdFAD2Ｒ0 为引
物，扩增滇牡丹 FAD2 基因 cDNA 开放阅读框全长
序列。反应条件为 94℃，5min;94℃，30s;58℃，
45s;72℃，90s;30 个循环;72℃延伸 7min。扩
增的 PCＲ产物胶回收后连接到 pEASY-T3 载体中。
并测序验证所克隆得到的全长 cDNA。
32第 1 期 李苏雨等:滇牡丹 ω-6 脂肪酸脱氢酶基因的克隆与功能分析
表 1 文中所用引物序列
Tab. 1 The primers sequences in the PCＲ of cloning
名称 序列(5＇－3＇) 用途
FAD2F1 ACCATGAGATATTCGACTTCT
FAD2F2 AGCCATTGGTAGTCACTAAAT
5＇ＲACE
PdFAD2F0 ATGGGTGCCGGTGGTCGTAT
PdFAD2Ｒ0 TCATTCAAACTTATTCTTGT
全长 cDNA开放阅读框克隆
cDNA OＲF Clone
PdFAD2Ft GCATTTAGTGACTACCAAT
PdFAD2Ｒt GAAGTCCCATCAAACTGAT
ＲT-PCＲ检测
ＲT-PCＲ detection
Factin TGCCATGTATGTTGCTAT
Ｒactin TCCTTGCTCATACGATCA
ＲT-PCＲ内参
ＲT-PCＲ control
1. 5 滇牡丹 FAD2 基因 cDNA 序列及其编码蛋白
氨基酸的序列分析
采用 NCBI (http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov /)
Blast工具和 DNAMAN 软件将滇牡丹 FAD2 与数据
库中其他植物 FAD2 基因进行核酸和氨基酸的同源
序列比对，由 ClusterW 程序完成多序列的比对。
并用 MEGA4. 0. 2 软件的邻位相连算法 (Neighbor-
joining)1000 次自检举 (boot straping)绘制出进
化树图像。采用 ExPASy 站点工具 Protparam (ht-
tp: / /web. expasy. org /protparam)分析其蛋白质理
化特 性，利 用 在 线 软 件 ProtScale (http: / /
web. expasy. org /protscale /)对滇牡丹 ω-6 脂肪酸脱
氢酶进行亲水性 /疏水性进一步分析，用 Tmpred软
件 (http: / /www. ch. embnet. org / software /TMPＲED
_form. html)对滇牡丹 FAD2 蛋白序列的跨膜结构
域进行分析。
1. 6 滇牡丹 FAD2 基因表达分析
以获得的 PdFAD2 基因序列为模板设计特异引
物 PdFAD2Ft和 PdFAD2Ｒt (表 1)。将样品液氮研
磨后，用 Trizol 法分别提取滇牡丹的叶、茎、根、
花、种子总 ＲNA。用琼脂糖凝胶电泳检测其 ＲNA
质量，并于 － 80℃保存 ＲNA。参照 Ｒeverse Tran-
scriptase M-MLV试剂盒 (大连宝生物工程有限公
司)合成 cDNA，并于－20℃冰箱保存。以 actin 为
内参，用特异引物 PdFAD2Ft 和 PdFAD2Ｒt 检测
PdFAD2 基因的表达情况。
2 结果与分析
2. 1 滇牡丹 FAD2 全长 cDNA的克隆与序列分析
对滇牡丹种子转录组数据分析获得 1 015bp 大
小的 FAD 基因片段，根据该片段设计特异引物，
用 ＲACE技术克隆目的基因的 5cDNA 末端。对所
获基因片段序列进行拼接，获得全长 cDNA序列为
1 791bp。利用软件分析获得 cDNA 开放阅读框，
并根据该序列设计含有起始密码子的特异引 Pd-
FAD2F0和含终止密码子的特异引 PdFAD2Ｒ0，并以
滇牡丹种子 cDNA 为模板，PCＲ 扩增获得 1 155bp
的 cDNA 完整的开放阅读框，并命名为 PdFAD2。
将该 1 155bp 片段与 FAD2 cDNA 拼接序列进行比
对分析，分析结果显示两序列一致，表明滇牡丹
FAD2 基因 cDNA 拼接序列正确。其 5含有 305bp
的非编码区，3端含有 330bp 的非编码区，这表
明，本研究成功克隆并获得完整的滇牡丹 FAD2 基
因的 cDNA序列。
2. 2 PdFAD2 氨基酸序列分析
根据滇牡丹 FAD2 基因 cDNA 全长序列推测其
编码 384 个氨基酸残基，该基因推断的蛋白与芍药
(Paeonia lactiflora)以及靛木 (Wrightia tinctoria)
FAD2 蛋白的相似性分别为 98. 7%和 84. 11%。以
滇牡丹 FAD2 氨基酸序列与来其他 4 种不同物种的
ω-6 脂肪酸脱氢酶氨基酸序列进行序列比对分析，
发现滇牡丹 FAD2 与其他植物的脂肪酸脱氢酶一
样，在其氨基酸序列中发现具有 3 个保守的组氨酸
中心位点［19 ～ 20］。HXCGH结构域从 105 位氨基酸到
112 位氨基酸 (HECGH)，HXCGH 结构域从 137
位氨基酸到 145 位氨基酸 (WKYSHＲＲHH)，
EXXXXXHXXHH结构域从 315 位氨基酸到 322 位
氨基酸 (HVAHHLFS)(图 1)。
利用 ExPASy 站点工具 Protparam 分析其蛋白
质理化特性，并推测滇牡丹 FAD2 的分子式为 C2061
H3036N524O533 S11，相对分子质量为 44 034. 6，理论
等电点为 8. 89，亲水性总平均值为－0. 084，预测
该蛋白的亲水性较低。使用在线软件 ProtScale 进
一步分析滇牡丹 FAD2 编码蛋白的亲水性 (图 2)。
预测结果显示该蛋白亲水性低，与之前的 Prot-
param预测结果一致。
42 西 部 林 业 科 学 2016 年
图 1 滇牡丹和其他物种 FAD2 氨基酸序列比对分析
注:PdFAD2 为滇牡丹 FAD2;PlFAD2 为芍药 Paeonia lactiflora (AKE44629);WtFAD2 为靛木Wrightia tinctoria (ADK47520);
HbFAD2 为橡胶树 Hevea brasiliensis (AAY87459);JcFAD2 为麻风树 Jatropha curcas (NP_001295707)。所有蛋白序列中的保
守氨基酸都用星号标记，有两个变化的氨基酸位点用点标记，3 个保守的组氨酸中心用灰色标注。
Fig. 1 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of FAD2s
52第 1 期 李苏雨等:滇牡丹 ω-6 脂肪酸脱氢酶基因的克隆与功能分析
图 2 滇牡丹 FAD2 蛋白的亲水性分析
Fig. 2 Analysis on hydrophilicity of P. delavayi FAD2
by ProtScale
采用 Tmpred 软件分析滇牡丹 PdFAD2 蛋白序
列，得出该蛋白存在 5 个跨膜区(表 2)，大量研究证
明 ω-6 脂肪酸脱氢酶(FAD2)属于脂酰脂脱饱和酶
家族，这类酶均定位于内质网或者质体膜上，是不可
溶的酶蛋白［21］。对 PdFAD2 的亲水性分析及跨膜
结构域分析，表明 PdFAD2 是一个膜结合蛋白，这符
合 ω-6 脂肪酸脱氢酶的特性，说明克隆获得的 Pd-
FAD2 是 ω-6 脂肪酸脱氢酶。
表 2 滇牡丹 FAD2 蛋白跨膜结构域预测
Tab. 2 Prediction on transmembrane domains
in P. delavayi FAD2
起始位置 终止位置 长度 /bp 曲线值 方向
52 70 19 1229 out-in
84 103 20 1746 in-out
117 137 21 1294 out-in
179 196 18 1790 in-out
247 269 23 2228 out-in
2. 3 PdFAD2 系统进化树分析
滇牡丹 FAD2 与其他植物的 FAD2 氨基酸序列
的系统进化分析表明:滇牡丹 HDＲ与牡丹科的 ω-
6 脂肪酸脱氢酶聚为一类，从系统进化树可以看出
滇牡丹 FAD2 与芍药的 FAD2 的亲缘关系较近，与
绒毛 状 烟 草 (Nicotiana tomentosiformis)、番 茄
(Solanum lycopersicum)、美丽桐 (Wrightia tincto-
ria)、红花油茶 (Camellia chekiangoleosa)的 FAD2
的亲缘关系次之，与杨树 (Populus trichocarpa)、
胡杨 (Populus euphratica)FAD2 氨基酸序列则处
于不同分支，亲缘关系较远 (图 3)。
图 3 PdFAD2 与其他不同物种间 FAD系统进化树
注:近邻相接法构建的进化系统进化树是用 MEGA4 软件基于已经在 GenBank里公布的 HDＲ构建。
Fig. 3 Phylogenetic tree of the FADs
2. 4 PdFAD2 基因的表达分析
利用 PdFAD2 基因的特异引物，通过 ＲT-PCＲ
检测 PdFAD2 在滇牡丹叶、茎、根、花以及种子的
表达量，ＲT-PCＲ 结果显示 PdFAD2 在茎和种子中
表达量最高，花和叶也有表达，而在根中只有微弱
的表达 (图 4)。这说明 PdFAD2 有一定的表达特
异性。
62 西 部 林 业 科 学 2016 年
图 4 滇牡丹 PdFAD2 在不同器官的表达情况
注:以特异引物扩增基因片段，并用 1%琼脂糖
胶检测基因转录情况。
Fig. 4 ＲT-PCＲ analysis of PdFAD2 expression
3 结论与讨论
3. 1 结论
本研究通过对转录组数据分析，获得滇牡丹
ω-6 脂肪酸脱氢酶 (FAD2)的序列，然后通过
ＲACE 以及 ＲT-PCＲ 等方法克隆获得滇牡丹 Pd-
FAD2，其基因开放阅读框全长 1 155bp，编码 384
个氨基酸;利用生物信息学分析确定 PdFAD2 属于
跨膜蛋白，与芍药的 FAD2 蛋白相似度高达
98. 7%。这说明 ω-6 脂肪酸脱氢酶在芍药属内相对
比较保守，未来高产油脂滇牡丹的培育将以对脂肪
酸相关代谢酶基因的调控为重点。对 PdFAD2 的组
织表达研究发现，PdFAD2 在花、茎、叶以及种子
中均有大量表达，而唯有在根中只有微弱表达。这
说明滇牡丹在除了种子中含有不饱和脂肪酸外，在
花、茎、叶中也可能含有不饱和脂肪酸，这为滇牡
丹的综合利用提供一定的理论依据。
3. 2 讨论
脂肪酸是植物细胞基本成分之一，脂肪酸的代
谢还与植物抗寒、抗病等抗逆性状相关［22 ～ 23］。研
究表明植物可以通过调控脂肪酸特别是细胞壁中不
饱和脂肪酸的含量来抵抗冷害。脂肪酸除了具有重
要的植物生理功能，还具有食用价值和工业价值。
许多不饱和脂肪酸可以作为普通油脂使用，同时还
具有保健作用。ω-6 脂肪酸脱氢酶是亚油酸合成的
关键酶，而亚油酸是许多重要多不饱和脂肪酸的前
体。对滇牡丹 ω-6 脂肪酸脱氢酶 (FAD2)的研究
将有利于培育高品质油用滇牡丹新品种。
本研究获得的 PdFAD2 将会是非常重要的基因
工程研究材料，可以将 PdFAD2 转入真菌中，通过
发酵获得大量的不饱和脂肪酸，同时，也可以转入
其他植物中改变种子中不饱和酸的含量，从而提高
油脂的品质。
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82 西 部 林 业 科 学 2016 年