全 文 ：4 个滇牡丹天然居群遗传多样性的 ISSＲ分析
*
刘 通1，冯 丹2，陈少瑜2，赵一鹤2
(1. 西南林业大学 环境科学与工程学院，云南 昆明 650224;2. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201)
摘要:以云南省香格里拉县 4 个滇牡丹天然居群为研究对象，采用 ISSＲ分子标记技术，对 98 份材料进行遗传多
样性分析，用多态性高、稳定性强的 10 条引物进行扩增，共获得 96 条扩增产物，其中多态性条带有 82 条，多
态性百分比为 85. 42 %;滇牡丹总体基因多样性为 0. 343 8，Shannon 指数为 0. 500 9;通过 Nei’s 和聚类分析，
居群间的遗传分化系数为 0. 797 3，居群间的遗传变异占总遗传变异的 79. 73 %，而居群内的遗传变异只有
20. 27 %，表明滇牡丹居群间的遗传分化较大，遗传变异主要存在于居群间。因此，滇牡丹虽然为分布区狭窄的
特有种，但是与一些典型稀有和濒危的物种相比，遗传多样性并不低，滇牡丹的分布区域和种群数量呈现狭窄
化、缩小化的趋势，主要原因是受人为过度采挖，生境受到破坏所致。
关键词:滇牡丹;居群;遗传多样性;ISSＲ分子标记
中图分类号:S 685. 11 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2014)03 － 0031 － 06
ISSＲ Analysis of Genetic Diversity among 4 Natural
Populations of Paeonia delavayi
LIU Tong1，FENG Dan2，CHEN Shao-yu2，ZHAO Yi-he2
(1. Environmental Science and Engineering College of Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China;
2. Yannan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China)
Abstract:ISSＲ molecular marker technology was used to analyze genetic diversity of 4 natural populations of 98
Paeonia delavayi individuals from shangri-la in Yunnan． 10 primers with high polymorphism and steady expansion
were selected and 96 bands were identified，of which 82 bands were polymorphic，the polymorphism percentage
was 85. 42 % . The total genetic diversity of 98 Paeonia delavayi was 0. 343 8，and the Shannon index was
0. 500 9． Through the Nei’s and Cluster analysis， the gene differentiation coefficient among populations was
0. 797 3，the genetic variation among populations was 79. 73 %，the genetic variation within populations was only
20. 27 % ． All of these indicates that the different populations of Paeonia delavayi had a larger genetic differentia-
tion，and the main genetic variation was existed among populations． The study also showed that although Paeonia
delavayi was an endemic species，compared with some typical rare and endangered species，its genetic diversity
was not low． The reason of its narrowing distribution tendency was mainly caused by over collection and habitat dis-
turbance from human activities．
Key words:Paeonia delavayi;population;genetic diversity;ISSＲ molecular marker
第 43 卷 第 3 期
2014 年 6 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 43 No. 3
Jun. 2014
* 收稿日期:2014 － 02 － 15
基金项目:云南省社会事业发展专项 (2010CA010)，国家林业局公益性专项 (201204110)。
第一作者简介:刘 通 (1988 －)，男，河南漯河人，硕士研究生，主要从事恢复生态学研究。
通讯作者简介:赵一鹤 (1970 －)，男，云南大理人，副研究员，博士，主要从事特种经济林资源培育与开发利用研究。
DOI:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2014.03.008
滇牡丹 (Paeonia delavayi)是芍药科 (Paeoni-
aceae)芍药属 (Paeonia)植物，主要分布于云南
中部至西北部、四川西南部和西藏东南部，根可药
用，根皮 (丹皮)有降压、镇静、镇痛、退热、
止血、降糖、抗菌等作用［1 ～ 2］。滇牡丹是我国特有
的珍稀濒危物种，1987 年被列为国家三级保护植
物［3］。滇牡丹在芍药属的起源、演化、地理分布
研究方面有重要的学术价值［4］，同时也是培育新
品种的重要育种材料［5］。
许多学者在滇牡丹的分类、多样性调查、生物
生态学、形态解剖学、分子生物学等方面做过一些
研究［6 ～ 8］，表明滇牡丹的生存环境、形态和核型方
面也表现出多样化。但从分子水平对滇牡丹遗传多
样性的研究目前报道较少。
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，从
某种程度上说它是生态系统多样性和物种多样性的
基础和核心，其最直接的表现形式是遗传变异水平
的高低。珍稀濒危植物的出现往往是以下几个方面
的原因造成的:一是该植物的遗传多样性低，或者
是由于遗传漂变、近亲繁殖与自交，使得遗传多样
性大量丧失;二是与它本身的交配能力和繁殖能力
有关;三是该植物所处的环境遭到自然、人为的破
坏。随着现代科学技术的快速发展，遗传学的研究
由以前的形态学水平已经上升到现在的基因水平、
分子水平。这些以分子标记技术为主的研究途径能
使人们在较短的时间里准确、快速地了解植物的遗
传变异、遗传结构状况［9］。由于生态环境的恶化
和人为的干扰破坏，滇牡丹的野外分布范围正在逐
渐缩小。本项研究采用 ISSＲ技术［10 ～ 12］对 4 个滇牡
丹居群进行遗传多样性分析，以期对滇牡丹种质资
源进行评价，为对其濒危机制的研究以及科学合理
保护策略的制定提供科学依据。
1 试验地概况
研究地位于滇西北香格里拉县，属温带高原半
湿润季风气候，平均海拔 3 318 m，年平均气温
5. 9 ℃，最冷月平均气温 － 0. 4 ℃，最热月平均气
温 13. 3 ℃，无霜期 123. 8 天，年降水量 648. 6
mm，年蒸发量 1 616. 8 mm，年日照时数 2 155. 9
h，年平均相对湿度 69 %，10℃以上积温 1 539. 2
℃，土壤主要为山地棕壤。森林是以高山松 (Pi-
nus densata)、云杉 (Picea asperata)、冷杉 (Abies
fabri)等针叶树为优势种的群落类型，滇牡丹主要
分布在林缘及峡谷灌丛地带。该地区是目前调查发
现的滇牡丹最集中、花色最丰富、面积最大的分布
区域［13］。
2 材料与方法
2. 1 实验材料
在云南省香格里拉县 4 个滇牡丹天然居群中，
每间隔 5 m左右标记采样单株，每株采集生长正常
叶片 4 ～ 5 片，共 98 个样品，样品采集后用无水硅
胶干燥，放入自封袋中密封，并置于 － 80 ℃环境
保存。各居群生境条件及采样情况见表 1。
表 1 4 个天然居群 98 个样品来源地及其生境条件
Tab. 1 The source and habitat of 4 natural populations of 98 individuals
居群
样本数
/个 经纬度
海拔
/m 生境条件
高山植物园(PopA) 6 N27°5426. 9″ E99°3819. 8″ 3 324 植物园内部，基本无人为干扰，有乔灌木覆盖
香格里拉滑雪场(PopB) 31 N27°5751. 1″ E99°3505. 0″ 3 383 道路两旁，无植被覆盖
哈拉(PopC) 31 N27°5655. 3″ E99°3517. 9″ 3 349 农田附近，基本由草本覆盖，较集中
尼西(PopD) 30 N28°0040. 5″ E99°3223. 2″ 2 918 道路两旁，农田附近，有灌草覆盖，较集中
2. 2 实验方法
2. 2. 1 基因组 DNA提取
取样品叶片 1 ～ 2 片，约 0. 3 g，采用改良的
CTAB 法［14］提取叶片基因组总 DNA，用 1 %的琼
脂糖凝胶电泳检测其完整性和纯度，以 λDNA (浓
度为 2 ng /μL)对照，调节样品模板 DNA浓度至 5
ng /uL备用。
2. 2. 2 ISSＲ扩增
经正交条件优化［15 ～ 16］，PCＲ反应体系总体积为
25 μL，其中 5 ng /μL 模板 DNA 1 μL，2 mmol /μL
引物 3. 75 μL，混合 MIX (购自天根公司)12. 5
μL，不足的用 ddH2O 补足。PCＲ 扩增反应条件:
94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 45 s，50 ～ 60 ℃退
火 45 s，72 ℃延伸 90 s，35 循环;72 ℃延伸 10
23 西 部 林 业 科 学 2014 年
min，4 ℃保存。扩增产物用 1. 5 %的琼脂糖凝胶
电泳，电泳缓冲液为 0. 5 × TBE，电泳结束后在紫
外成像仪上观察、拍照。
2. 2. 3 引物筛选
本实验所用引物购自天根生化科技 (北京)
有限公司，源自于英属哥伦比亚大学 University of
British Columbia (简称 UBC 大学)公布的 100 条
ISSＲ引物。通过查阅滇牡丹及其近缘科属 ISSＲ-
PCＲ实验的相关文献，初步筛选出文献中能扩增
的 ISSＲ引物 36 条。对这 36 条引物进行退火温度
及扩增条件的优化实验，筛选出多态性高、稳定性
好的引物用以所有样品的扩增。
2. 3 统计及多样性分析方法
电泳结果根据 DNA Marker (由天根公司提供
D2000)判读扩增条带的有无及大小，同一位点有
条带赋值“1”，无条带赋值“0”。采用 Excel软件
对电泳结果进行数据转化，构建 0 /1 的数据矩阵。
利用 POPGENE软件对数据进行分析获得所需的多
态性位点等遗传参数，包括多态百分率 (PPB)、
基因多样性 (h)、Shannon’s指数 (I)、总基因多
样度 (Ht)、居群内的基因多样度 (Hs)、居群间
的遗传分化系数 (Gst)、居群间的基因流 (Nm)
等遗传分化指数，运用 NTSTS软件进行 UPGMA法
聚类分析，构建树状图［17］。
3 结果与分析
3. 1 引物扩增结果及其多态性
采用 36 条随机引物对 98 份样品进行扩增筛
选，其中 10 条引物能扩增出清晰带型、多态性较
好的扩增产物 (表 2)，扩增条带分布在 300 ～
2 000 bp之间［18］ (图 1)。其中 UBC807 扩增出最
多的 15 条条带，而 UBC814 扩增出的条带最少，
只有 4 条。10 条引物中多态性最高的引物为
UBC807、UBC808、UBC811，多态百分率为 100 %;
引物 UBC814 扩增结果多态百分率最低为 50 %。
说明 ISSＲ能够揭示滇牡丹材料间较高的多态性。
表 2 ISSＲ-PCＲ扩增结果的统计
Tab. 2 Amplification results of ISSＲ-PCＲ
引物 序列 退火温度 /℃ 扩增条带数 多态性条带数 多态性条带比例 /%
UBC807 (AG)8T 50 15 15 100
UBC808 (AG)8C 51 8 8 100
UBC810 (GA)8T 51 11 10 90. 91
UBC811 (GA)8C 52 10 10 100
UBC812 (GA)8A 50 8 7 87. 50
UBC814 (CT)8A 52 4 2 50. 00
UBC825 (AC)8T 55 12 9 75. 00
UBC827 (AC)8G 52 9 6 66. 67
UBC836 (AG)8YA 57 10 8 80. 00
UBC891 HVH(TG)7 60 9 7 77. 78
平均 9. 6 8. 2 85. 42
总计 96 82 85. 42
3. 2 滇牡丹的遗传多样性水平
不同居群的多样性指数见表 3。10 条引物对
98 份样品的扩增条带分布在 300 ～ 2 000 bp 之间，
共扩增 96 条带，其中多态性条带 82 条，多态百分
率 (PPB)为 85. 42 %，平均每条引物可以扩增出
9. 6条条带。等位基因数 (na)1. 854 2，有效等位
基因数 (ne)1. 616 8，基因多样性 (h)0. 343 8，
Shannon’s指数 (I)0. 500 9。表明滇牡丹多态性
较高，遗传变异和进化水平较高。
4 个居群中，遗传变异水平大小顺序为 PopB
＞ PopC ＞ PopD ＞ PopA，其中 PopA 的多态性最低
(PPB %仅为 51. 04 %，h 为 0. 239 5，I 为 0. 337 6)，
远远低于居群的平均水平。造成此现象原因可能是
PopA的样品个体相较于其他居群数量少，偶然因
素及误差对实验结果的影响比较大。
33第 3 期 刘 通等:4 个滇牡丹天然居群遗传多样性的 ISSＲ分析
引物 807 对部分样品的扩增结果 引物 808 对部分样品的扩增结果
引物 810 对部分样品的扩增结果 引物 825 对部分样品的扩增结果
图 1 部分引物对一些样品的扩增结果
Fig. 1 Amplification result of some primers to some individual samples
表 3 不同居群的多样性
Tab. 3 Genetic diversity of different populations
名称 na* ne* h* I* PPB /% *
PopA 1. 510 4 1. 456 4 0. 239 5 0. 337 6 51. 04
PopB 1. 645 8 1. 555 8 0. 296 3 0. 420 0 64. 58
PopC 1. 614 6 1. 489 9 0. 267 2 0. 383 5 61. 46
PopD 1. 593 8 1. 456 4 0. 252 7 0. 364 8 59. 38
居群水平 1. 591 2 1. 489 6 0. 263 9 0. 376 5 59. 12
种水平 1. 854 2 1. 616 8 0. 343 8 0. 500 9 85. 42
注:* na = Observed number of alleles 等位基因数，* ne = Effective
number of alleles〔Kimura and Crow (1964)〕有效等位基因数，* h
= Nei’s (1973)gene diversity 基因多样性，* I = Shannon’s Infor-
mation index〔Lewontin (1972)〕Shannon指数，* PPB% = percent-
age of polymorphic bands多态百分率。
3. 3 滇牡丹的遗传结构
遗传结构是通过物种居群内和居群间的遗传分
化来体现的，基因流的大小也可以反映居群遗传结
构的大小，一般来说，基因流大的物种，种群间遗
传分化小，大的基因流可以阻止居群间的遗传分
化［19］;反之，居群间的遗传分化大［20］。自然界的
居群往往不是处于理想状态，其居群遗传结构受到
多种生物学、生态学过程的影响，如繁育系统、分
布范围、种子传播机制等［21］。Slatkin认为 Nm ＜ 1，
表明居群间差异显著，基因流不足以抵制居群内因
遗传漂变而引起的居群分化［22］。本研究中，根据
nei’s 分析，滇牡丹的总基因多样度 (Ht)为
0. 380 6，居群内的基因多样度 (Hs)为 0. 233 9，
居群间的基因流 (Nm)为 0. 385 4，说明基因流不
足可能是滇牡丹居群间遗传结构分化的主要原因之
一。
居群间的遗传分化系数 (Gst)为 0. 797 3，居
群间的遗传变异占总遗传变异的 79. 73 %，而居群
内的遗传变异只有 20. 27 %，表明滇牡丹居群间的
遗传分化较大，遗传变异主要存在于居群间。
3. 4 聚类分析
通过 Popgene 和 NTSYS 软件的计算分析居群
间的遗传距离 (表 4)，并构建树状图 (图 2)。由
图 2 可以看出，4 个居群根据遗传距离分析亲缘关
系:PopC与 PopD 遗传距离最小，亲缘关系最密
切;PopB的遗传距离仅次于 PopC 与 PopD，表现
出与 PopC、PopD 之间较远的亲缘关系;PopA 与
其他居群间的遗传分化较大，亲缘关系最小。
43 西 部 林 业 科 学 2014 年
表 4 4 个居群的遗传距离
Tab. 4 The genetic distance of 4 populations
遗传距离 居群 长度
3 PopA 10. 261 88
3 2 6. 568 30
2 PopB 3. 693 59
2 1 0. 172 51
1 PopC 3. 521 08
1 PopD 3. 521 08
图 2 4 个居群的聚类分析树状图
Fig. 2 Dendrogram of 4 populations based on Nei’s
genetic distance
4 结论与讨论
4. 1 滇牡丹的遗传多样性
遗传多样性是物种或居群长期进化的产物，也
是其生存、发展和进化的基础［23］。一个物种或居
群遗传多样性水平越高，往往对环境变化的适应能
力就越强。普遍认为稀有的或分布狭窄的物种遗传
多样性水平偏低［24］。然而，近年来有研究发现一
些特有和濒危物种仍然保持着高水平的遗传变异。
滇牡丹虽然为分布区狭窄的特有种，但是与一些典
型稀有和濒危的物种相比，遗传多样性并不低，比
一些典型濒危植物的多态位点百分率要高得多，如
贵州苏铁 (Cycas guizhouensis)只有 35. 90 %，银
杉 (Cathaya argyrophylla)仅为 32 %。本项实验用
从 36条引物中筛选出来的 10 条 ISSＲ引物对滇牡丹
基因组 DNA进行扩增，在所有 96 个有效扩增位点
中多态性位点有 82个，多态性百分率 85. 42 %，基
因多样性为 0. 343 8，Shannon指数为 0. 500 9。从以
上数据可知，滇牡丹的遗传多样性高，与龚洵等从
地理分布、生境、形态、繁殖生物学特性、迁地保
护效果等方面对滇牡丹的多样性进行的研究推
断［4，24］相符合，而与目前调查的滇牡丹分布状况相
悖。结合本实验采样地的具体情况及其周边人群的
分布状况分析，造成滇牡丹濒危的原因可能是人为
干扰，如开垦农田、牛畜啃食、人为采摘等。
4. 2 遗传分化
滇牡丹的总基因多样度为 0. 380 6，居群内的基
因多样度为 0. 233 9，居群间的基因流为 0. 385 4，
居群间的遗传变异占总遗传变异的 79. 73 %，而居
群内的遗传变异只有 20. 27 %，表明滇牡丹居群间
的遗传分化较大，遗传变异主要存在于居群间。其
原因分析如下:
(1)牡丹类植物主要靠飞行能力较弱的昆虫
传粉，且种子较大，种子散布主要依靠重力［25］。
在居群水平上，繁育系统是影响遗传分化的重要因
素，由弱飞行能力的动物授粉和靠种子迁移的植物
居群之间的遗传分化显著［26］。
(2)滇牡丹的无性繁殖能力较强，使居群间
进行基因交流较为困难。滇牡丹进入某一环境时，
最初种子是自然散播，植株随机分布，后来随环境
条件的改变，种子萌发所需的外部条件无法得到满
足，不能进行有性生殖，开始无性繁殖，形成集群
分布［27］。
(3)滇牡丹的分布区域属于横断山区的东南边
缘，海拔 1 900 ～ 3 600 m，是横断山区高山深谷地
形典型区域。随着海拔的升高，气候、植被和土壤
等条件也呈现明显的垂直变化。滇牡丹自然分布在
石质山地石缝周围、灌木丛、乔木林内天窗区域、
林地边缘和林内道路的两边，分布格局为随机分布
与集群分布并存，这可能是滇牡丹对环境的适应。
这种特殊的地形和生境，造成滇牡丹居群间个体迁
移率小，基因流偏小，从而形成了居群间较大的遗
传分化。
4. 3 居群间的遗传关系
从聚类分析树状图可以得出，PopC与 PopD遗
传距离最小，亲缘关系最密切;PopB 的遗传距离
仅次于 PopC与 PopD，表现出与 PopC、PopD 之间
较远的亲缘关系;PopA 与其他居群间的遗传距离
最远，亲缘关系最小。而 4 个天然居群的地理分布
为:PopB 和 PopC 相隔最近，PopD 的距离稍远，
PopA距离其他居群最远，与其遗传距离有一定的
差异。PopA 地处于植物园内部，分布仅受地形、
气候等自然因素的影响，无人为等干扰因素，居群
内部个体之间基因交流仅存在于或大多存在于距离
较近的个体之间;PopB 在道路两旁，水分条件较
53第 3 期 刘 通等:4 个滇牡丹天然居群遗传多样性的 ISSＲ分析
差，植物种类单一，群落结构简单，可能受到外界
环境条件干扰，较易产生基因交流;PopC 、PopD
位于农田附近，经常受到人、畜干扰，且植被覆盖
情况较好，有昆虫、鸟、兽等活动，对个体之间的
遗传交流存在较大影响，易产生遗传相似性较高的
个体;PopB和 PopC之间的分布距离最近，但遗传
距离大于 PopC 和 PopD 之间的遗传距离，其原因
可能为，两个居群所处的生境不同，受到的外界影
响有所差别，形成了不同的表型，表型是遗传与环
境相互作用的结果，经过长期对环境的适应，两个
居群的分化方向有了差别。
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