全 文 ：第 ３９卷　 第 １期
２０１５年 １月
南京林业大学学报 （自然科学版 ）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．３９， Ｎｏ．１
Ｊａｎ．， ２０１５
ｄｏｉ：１０．３９６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０１５．０１．００４
　 收稿日期：２０１４－１１－０３　 　 　 　 修回日期：２０１４－１２－０８
　 基金项目：国家林业局“９４８”项目（２０１１－ ０４－ ６９）；江苏省科技支撑计划（ＢＥ２０１４４０５）；江苏高校优势学科建设工程资助项目
（ＰＡＰＤ）
　 第一作者：吴静，硕士。 ∗通信作者：叶建仁，教授。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｊｒｙｅ＠ ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
　 引文格式：吴静，朱丽华，许建秀，等． 抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织的诱导及增殖［Ｊ］ ． 南京林业大学学报：自然科学版，２０１５，３９
（１）：１７－２１．
抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织的诱导及增殖
吴　 静，朱丽华，许建秀，吴小芹，叶建仁∗
（南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏　 南京　 ２１００３７）
摘要：以抗松材线虫病赤松未成熟合子胚为外植体，研究了合子胚发育阶段、激素种类及浓度以及碳源等对胚性
愈伤组织诱导的影响。 结果表明：发育至 ２～ ４ 阶段的合子胚为胚性愈伤组织诱导的适宜外植体，２，４－Ｄ 和 ６－
ＢＡ是最优激素组合，麦芽糖比蔗糖、葡萄糖更有利于胚性愈伤组织的诱导。 抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织诱
导率总体较低，以 ＤＣＲ为基本培养基，添加 ２ ｍｇ ／ Ｌ ２，４－Ｄ和 １ ｍｇ ／ Ｌ ６－ＢＡ时诱导率最高为 ５．０％，诱导的胚性
愈伤组织在增殖培养基上能够稳定增殖。
关键词：抗病赤松；未成熟合子胚；胚性愈伤组织；ＤＣＲ培养基
中图分类号：Ｓ７６３；Ｑ８１３　 　 　 　 　 　 　 文献标志码：Ａ 文章编号：１０００－２００６（２０１５）０１－００１７－０５
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｉｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ
ＷＵ Ｊｉｎｇ， ＺＨＵ Ｌｉｈｕａ，ＸＵ Ｊｉａｎｘｉｕ， ＷＵ Ｘｉａｏｑｉｎ， ＹＥ Ｊｉａｎｒｅｎ∗
（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ｉｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，
Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ． Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ⁃
ｉｎｇ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｄｅｐｅｎｄｅｄ ｈｅａｖｉ⁃
ｌｙ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅ， ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｘｉｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ， ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ． Ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏ⁃
ｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｗｏｒｋｅｄ ｂｅｓｔ ｗｈｅｎ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｍｅｇａ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｔ ｓｔａｇｅ ２－４ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｗａｓ ２ ｍｇ ／ Ｌ ２，４－Ｄ ａｎｄ １ ｍｇ ／ Ｌ ６－ＢＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ５％． Ｍａｌｔｏｓｅ ｗａｓ ｂｅｔ⁃
ｔｅｒ ｔｈａｎ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｇ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｔｏ ａ
ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｅｍａｔｏｄｅ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ； ｉｍｍａｔｕｒｅ ｚｙｇｏｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ； ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ； ＤＣＲ ｍｅｄｉｕｍ
　 　 赤松（Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ）主要分布于日本、朝鲜、
俄罗斯东南部及我国东北部，是沿海丘陵区的主要
造林树种之一。 由于高度感染松材线虫病，赤松天
然林及人工林均遭到严重破坏。 日本自 １９７８ 年起
开展抗松材线虫病赤松选育工作并建立了抗病种
子园［１］。 由于种苗繁殖手段的局限性，选育的抗
性赤松种苗难以满足大面积造林需求。 为了快速
大量繁殖已选优良抗病基因型植株，在短周期内实
现生产增益，开展赤松离体组织培养技术研究尤为
重要。
植物体细胞胚胎发生技术具有繁殖系数大、生
产周期短、结构完整、再生率高、不受自然环境影响
等优点［２］，在苗木快速繁殖、种质资源保存及人工
种子等方面具有重要意义和广阔的应用前景［３］。
自从欧洲云杉未成熟胚培养获得体细胞胚再生植
株以来，有关针叶树种体细胞胚胎发生的研究备受
关注，目前已对云杉属、落叶松属、松属等进行了广
泛研究［４－５］，已知的 １１５个松属树种（或变种）中至
少 ２４种可进行体细胞胚胎发生。 Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ［６］首次
对日本赤松体细胞胚胎发生进行研究，建立了胚性
细胞系。 随后，国外学者对赤松体细胞胚胎发生体
系及影响体细胞胚成熟、萌发及转化的影响因子进
行了优化［７－１０］。 国内目前也有对赤松组织培养器
官发生植株再生的相关研究［１１］，体细胞胚胎发生
南 京 林 业 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版 ） 第 ３９卷
技术研究尚少见报道。 完整的体细胞胚胎发生过
程包括胚性愈伤组织的诱导、增殖以及体细胞胚的
成熟和萌发等阶段。 笔者以抗松材线虫病赤松
（以下简称抗病赤松）未成熟合子胚为外植体，研
究了球果采集时期、不同激素组合及碳源对其胚性
愈伤组织诱导的影响，旨在为抗病赤松快速大规模
繁殖及种质资源保存提供技术支持。
１　 材料与方法
１．１　 外植体来源
抗病赤松未成熟球果采集于江苏句容林场抗
松材线虫病赤松种质资源库（２００４ 年 ２ 月从日本
引种建立）。 在基因库中选定 ７ 个家系（１＃、２＃、
１３＃、１８＃、２０＃、２２＃、２５＃），于 ２０１３ 年 ６ 月中旬到 ７
月中旬每周采集 １次球果，采集后立即保存于 ４ ℃
冰箱备用。
１．２　 外植体的处理
将抗病赤松未成熟球果的珠鳞剥离后取出种
子，放入灭菌的小三角瓶中，在超净工作台上用无
菌纱布包好，以 ７５％乙醇进行表面消毒 ３０ ｓ，再用
０􀆰 １％ ＨｇＣｌ２灭菌 ３ ｍｉｎ，无菌水冲洗 ３ 次后用无菌
滤纸吸去纱布表面多余的水分，最后用镊子剥去种
壳和内种皮，取雌配子体水平放置于诱导培养基
上。 每个处理接雌配子体 ２０ 个，重复 ３ 次。 ８ 周
左右统计胚性和非胚性愈伤组织诱导率。
１．３　 不同因素对胚性愈伤组织诱导的影响试验
　 　 １）合子胚发育阶段。 为研究抗性赤松胚型愈
伤组织诱导率与合子胚发育阶段的相关性， 确定
最适宜体胚诱导的球果采集时间， 对 ６ 个采集期
所采集球果的合子胚发育阶段进行检测。 每个家
系、每个采集期随机抽取 ４ 个球果， 每个球果剥取
５个未成熟种子， 在体视镜（Ｌｅｉｃａ ＭＺ１６）下观察合
子胚的发育阶段并拍照。 参照火炬松合子胚发育
阶段划分标准［４］判断不同家系、不同采集期合子
胚的发育阶段。
将 ６批采集的未成熟合子胚接种于以 ＤＣＲ为
基本培养基（以下除非特别说明，培养基中均添加
１ ｇ ／ Ｌ肌醇，４５０ ｍｇ ／ Ｌ谷氨酰胺（Ｇｌｎ），５００ ｍｇ ／ Ｌ 水
解酪蛋白（ＣＨ），２５０ ｍｇ ／ Ｌ ２⁃（Ｎ⁃吗啡啉），乙磺酸
（ＭＥＳ）），分别添加 ４ ｍｇ ／ Ｌ ２，４－Ｄ、１ ｍｇ ／ Ｌ ＫＴ、３０
ｇ ／ Ｌ麦芽糖和 ５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ琼脂粉，ｐＨ ５􀆰 ８。
２）不同激素组合。 将 ２０１３ 年 ６ 月 ２７ 日采集
的 １３＃种子置于添加不同浓度 ２，４－Ｄ、６－ＢＡ、ＫＴ 和
ＮＡＡ 的 ＤＣＲ的培养基中，其中 ２，４－Ｄ质量浓度设
置为 ２、４、６ ｍｇ ／ Ｌ，６－ＢＡ 质量浓度设置为 ０．５、１、２
ｍｇ ／ Ｌ，ＫＴ质量浓度设置为 ０、０􀆰 ５、１ ｍｇ ／ Ｌ，ＮＡＡ 浓
度设置为 ０、０．１、０．５ ｍｇ ／ Ｌ。 采用 Ｌ９（３４） ４ 因素 ３
水平正交试验，共 ９种处理。 所有处理添加 ３０ ｇ ／ Ｌ
的麦芽糖和 ５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ琼脂粉。
３）碳源。 将 ２０１３ 年 ６ 月 ２７ 日采集的 ２２＃种
子置于添加 ２ ｍｇ ／ Ｌ ２，４－Ｄ 和 １ ｍｇ ／ Ｌ ６－ＢＡ 激素
组合的 ＤＣＲ 培养基中，分别添加 ３０ ｇ ／ Ｌ 的麦芽
糖、蔗糖、葡萄糖和 ５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ的琼脂粉，ｐＨ为 ５􀆰 ８。
１．４　 胚性愈伤组织的增殖及其细胞结构观察
将诱导的胚性愈伤组织转入 ＤＣＲ 基本培养
基，附加 ０．５ ｍｇ ／ Ｌ ２，４－Ｄ、０．２５ ｍｇ ／ Ｌ ６－ＢＡ、５ ｍｇ ／ Ｌ
ＶＣ、１５ ｇ ／ Ｌ 麦芽糖及 ６ ｇ ／ Ｌ 琼脂粉，每２～３周继代
１次。 胚性愈伤组织的细胞学观察采用 １％醋酸洋
红和 ０． ０５％ 伊文思蓝染色，在显微镜 （ Ｌｅｉｃａ
ＤＭＬＢ２） 下观察并拍照。
１．５　 培养条件和数据处理
愈伤组织培养温度为（２３±１） ℃，诱导及继代
增殖全过程均在暗培养条件下完成。
胚性愈伤组织诱导率＝胚性愈伤组织数 ／接种
外植体数× １００％；非胚性愈伤组织诱导率 ＝非胚
性愈伤组织数 ／接种外植体数×１００％。
数据采用 Ｅｘｃｅｌ程序进行处理。
２　 结果与分析
２．１　 抗病赤松合子胚发育阶段镜检结果
根据 Ｐｕｌｌｍａｎ 等［４］的火炬松合子胚发育阶段
划分标准，将抗病赤松合子胚的发育划分为 ８个阶
段（图 １）：第 １ 阶段（Ｓｔａｇｅ１）为合子胚丝状，胚头
不明显（图 １ａ）；第 ２ 阶段（Ｓｔａｇｅ２）为合子胚透明，
可见明显胚头，胚头逐渐形成圆筒状（图 １ｂ）；第 ３
阶段（Ｓｔａｇｅ３）为合子胚胚头逐渐变成半透明，形成
圆筒状，胚柄较透明（图 １ｃ）；第 ４ 阶段（Ｓｔａｇｅ４）为
合子胚胚头逐渐变成白色不透明，顶端凸起，成圆
弧形，胚体增粗，较透明 （图 １ｄ ）；第 ５ 阶段
（Ｓｔａｇｅ５）为合子胚胚头端可见突起的顶端分生组
织，形似子弹头状，胚体不透明、增粗（图 １ｅ）；第 ６
阶段（Ｓｔａｇｅ６）为合子胚胚头端子叶组织发育，在顶
端分生组织下方可见突起的子叶 （图 １ｆ）；第 ７ 阶
段（Ｓｔａｇｅ７）为子叶伸长，高于顶端分生组织 （图
１ｇ）；第 ８阶段（Ｓｔａｇｅ８）为子叶继续伸长，子叶之间
可见明显的缝隙，胚轴收缩（图 １ｈ）。
８１
　 第 １期 吴　 静，等：抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织的诱导及增殖
图 １　 抗病赤松合子胚不同发育阶段
Ｆｉｇ．１　 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｚｙｇｏｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ ｉｎ
Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ
　 　 注：ａ．第 １阶段；ｂ．第 ２阶段；ｃ．第 ３阶段；ｄ．第 ４阶段；ｅ．第 ５
阶段；ｆ．第 ６阶段；ｇ．第 ７阶段；ｈ．第 ８阶段。
　 　 对 ７个家系 ６ 个采集期的合子胚进行随机抽
样检测，检测结果表明同一时期不同家系合子胚发
育阶段有一定的差异，同一球果不同部位的合子胚
发育阶段也有一定的差异。 这可能与球果的授粉
时间，以及接受光照条件不一样有关。 不同采集期
未成熟合子胚的形态特征有所差异， 例如：
２０１３－０６－１３时为 Ｓｔａｇｅ１，２０１３－０６－２０时为 Ｓｔａｇｅ１－
Ｓｔａｇｅ２，２０１３－０６－２７ 时为 Ｓｔａｇｅ２－Ｓｔａｇｅ３，２０１３－０７－
０４ 时为 Ｓｔａｇｅ２⁃Ｓｔａｇｅ４，２０１３－ ０７ － １１ 时为 Ｓｔａｇｅ４ －
Ｓｔａｇｅ６，２０１３－０７－１８时为 Ｓｔａｇｅ６－Ｓｔａｇｅ８。
２．２　 球果采集时期对抗病赤松胚性愈伤组织诱导
的影响
　 　 将未成熟雌配子体接种于诱导培养基中培养
（图 ２ａ），２～４周后发现，有的雌配子体珠孔端有白
色透明黏性愈伤组织挤出（图 ２ｂ），１０ 周左右在珠
孔周围增殖成白色、透明具有黏性的块状胚性愈伤
组织（图 ２ｃ）；有的雌配子体珠孔端或者雌配子体
表面形成结构紧实的物质，８ 周左右形成黄色或褐
色没有粘性的非胚性愈伤组织；大部分雌配子体无
响应。
图 ２　 抗病赤松胚性愈伤组织的诱导与增殖
Ｆｉｇ．２　 Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｉｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐ． ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ
　 　 注：ａ．诱导培养基上的雌配子体；ｂ．诱导初期珠孔端挤出黏性物质；ｃ．诱导后期珠孔周围形成块状物质；ｄ． 胚性愈伤组织的增殖；ｅ．胚
性胚柄细胞团。
图 ３　 抗病赤松胚性愈伤组织诱导率与球果收集期
的相关性
Ｆｉｇ．３　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｃｏｎｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄａｔｅ
　 　 抗病赤松胚性愈伤组织诱导率与球果收集期
的相关性见图 ３。 图 ３统计结果表明，合子胚发育
阶段对胚性愈伤组织诱导有着至关重要的作用。
从图 ３还可见，４个家系均在 ６月 ２０日、６ 月 ２７ 日
和 ７月 ４日采集期获得较高的诱导率，这两个采集
期的球果主要为发育至第 ２ ～ ４ 阶段的合子胚，其
中 １３＃家系在 ６月 ２７日采集期，即合子胚的第 ２ ～
３阶段获得率为 ５％，且胚性愈伤组织状态好，由此
可见第 ２～４阶段的合子胚是松属树种胚性愈伤组
织诱导最佳阶段。 随着合子胚发育逐渐成熟，胚性
愈伤组织的诱导率下降；后期诱导出来的胚性愈伤
组织在继代过程中增殖力减弱甚至丧失。
２．３　 不同激素组合对抗病赤松胚性愈伤组织诱导
的影响
　 　 外植体置于不同诱导培养基上 ８ 周后的统计
结果表明，２，４－Ｄ与 ６－ＢＡ 组合较有利于赤松胚性
愈伤组织的诱导，２，４－Ｄ 质量浓度为 ２ ｍｇ ／ Ｌ 时胚
性愈伤组织诱导率最高，２，４－Ｄ与 ６－ＢＡ的最佳配
比为２ ∶１，随着 ２，４－Ｄ 浓度逐渐升高，其诱导率反
而降低（表 １）。 所以抗病赤松胚性愈伤组织诱导
９１
南 京 林 业 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版 ） 第 ３９卷
的最优激素组合为 ２ ｍｇ ／ Ｌ ２，４－Ｄ与 １ ｍｇ ／ Ｌ ６－ＢＡ
组合，该组合诱导出的胚性愈伤组织状态较好，且
在后期的继代培养中能够稳定增殖。
表 １　 不同激素组合对抗病赤松胚性愈伤组织诱导的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ
试验号
Ｎｏ．
激素质量浓度 ／ （ｍｇ·Ｌ－１）
ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
２，４－Ｄ ６－ＢＡ ＫＴ ＮＡＡ
外植体数
ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｅｘｐｌａｎｔ
诱导率 ／ ％
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ
胚性愈伤组织
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ
非胚性愈伤组织
ｎｏｎｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ
Ⅰ ２ ０．５ ０．５ ０．５ ６０ ０ ３．３３
Ⅱ ２ １．０ ０ ０ ６０ ５．００ １．６７
Ⅲ ２ ２．０ １．０ ０．１ ６０ ０ ０
Ⅳ ４ ０．５ ０ ０．１ ６０ ０ ０
Ⅴ ４ １．０ １．０ ０．５ ６０ ０ １．６７
Ⅵ ４ ２．０ ０．５ ０．０ ６０ １．６７ ５．００
Ⅶ ６ ０．５ １．０ ０ ６０ ０ ０
Ⅷ ６ １．０ ０．５ ０．１ ６０ ０ １．６７
Ⅸ ６ ２．０ ０ ０．５ ６０ ０ ３．３３
２．４　 碳源对抗病赤松胚性愈伤组织诱导的影响
碳源对抗病赤松愈伤组织诱导的影响见表 ２。
由表 ２可知，以麦芽糖为碳源的培养基能诱导出胚
性愈伤组织和非胚性愈伤组织，以蔗糖为碳源的培
养基仅诱导出非胚性愈伤组织，而以葡萄糖为碳源
的培养基未能诱导出任何愈伤组织，以麦芽糖为碳
源的培养基上胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的
诱导率均为最高，可见麦芽糖更适合作为抗性赤松
胚性愈伤组织诱导的碳源。
表 ２　 碳源对抗病赤松愈伤组织诱导的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ
ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｉｎ Ｐ． ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ
碳源
ｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅ
外植体数
ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｅｘｐｌａｎｔ
诱导率 ／ ％
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ
胚性愈伤组织
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｌｕｓ
非胚性愈伤组织
ｎｏｎｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｌｕｓ
麦芽糖 ３０ ３．３３ １０．００
蔗　 糖 ３０ ０ ３．３３
葡萄糖 ３０ ０ ０
２．５　 抗病赤松胚性愈伤组织的维持与增殖
继代实验结果表明，前 ６ 次继代，胚性愈伤组
织增殖速度缓慢，第 ７ 次继代后增殖速度加快，此
后进入稳定的增殖状态。 继代时将块状的胚性愈
伤组织分成 ２ ～ ３ 块，之后白色透明丝状黏性的胚
性愈伤组织不断在表面增殖，２ ～ ３ 周后块状的胚
性愈伤组织增殖变大（图 ２ｄ）。 细胞学观察表明，
胚性胚柄团由长的胚柄细胞和圆的胚性细胞组成
（图 ２ｅ），通常胚性细胞被醋酸洋红溶液染成红色，
胚柄细胞被伊文思蓝溶液染成蓝色。
３　 讨　 论
胚性愈伤组织的获得是体细胞胚胎发生的关
键，影响胚性愈伤组织诱导的因素主要有外植体类
型及其发育状况、基本培养基及其中添加的激素种
类和浓度以及碳源等［３，６，１２－１３］。 松属树种中，一般
采用未成熟合子胚为外植体［１４］，并且随着合子胚
的发育，其诱导率逐渐降低，合子胚发育的第 ２ ～ ４
阶段是最佳诱导时期［１５－１６］。 此次试验以抗性赤松
未成熟合子胚为外植体，胚性愈伤组织诱导率很
低，仅为 ５％，诱导出胚性愈伤组织的外植体为 ２ ～
４阶段的合子胚。 类似的结果在马褂木［１７］、湿地
松［１８］、落叶松［１９］等树种体细胞胚胎发生中亦有
报道。
植物激素的种类和浓度对松柏类植物胚性愈
伤组织的诱导有着至关重要的作用。 其中 ２，４－Ｄ、
ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＫＴ 等常用于针叶树种体细胞胚胎发
生初期，尤其 ２，４－Ｄ 是诱导体细胞胚胎发生的必
须条件［２０］。 胚性愈伤组织诱导一般在含有较高浓
度的生长素和细胞分裂素的固体培养基上进行，
２，４－Ｄ对胚性愈伤组织诱导的影响大于 ６－ＢＡ，但
激素浓度随树种和基因型有很大的差异［２１］。 此次
试验亦表明，对赤松而言，２ ｍｇ ／ Ｌ ２，４－Ｄ和 １ ｍｇ ／ Ｌ
６－ＢＡ是最佳激素组合。
碳源对胚性愈伤组织诱导有着不可忽视的作
用。 Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ［６］在对日本赤松体胚发生的研究中
以蔗糖为碳源，并成功地获得再生植株。 而
Ｇｕｐｔａ［２２］的研究结果表明，麦芽糖在针叶树种的体
细胞胚胎发生中有重要作用。 此次实验中，麦芽糖
０２
　 第 １期 吴　 静，等：抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织的诱导及增殖
比蔗糖、葡萄糖更适合于抗性赤松胚性愈伤组织的
诱导。
已有研究表明，２，４－Ｄ对胚性组织的诱导是不
可缺少的，但在增殖阶段应该及时去掉或降低
２，４－Ｄ浓度，这样既有利于胚性组织的增殖，也能
使后期更多的胚性细胞团转化为胚性胚柄细胞
团［２３］。 此次试验亦证明，抗病赤松胚性愈伤组织
在降低了 ２，４－Ｄ 和 ６－ＢＡ 浓度的增殖培养基上能
稳定增殖。
参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：
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（责任编辑　 刘昌来）
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