全 文 ：　 收稿日期：２０１１－０４－２７　　　修回日期：２０１１－０６－１５
　＊通讯作者：解成喜，男，教授，从事分析化学工作．
第２８卷第４期
Ｖｏｌ．２８　Ｎｏ．４
分 析 科 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
２０１２年８月
Ａｕｇ

．２０１２
文章编号：１００６－６１４４（２０１２）０４－０５７７－０４
双水相提取新疆圆柏果实中的总黄酮及
抑制亚硝化反应的研究
孙娟娟，解成喜＊
（新疆大学理化测试中心，新疆乌鲁木齐８３００４６）
摘　要：本文采用超声集成丙醇－硫酸铵双水相体系提取新疆圆柏果实中总黄酮，并用
分光光度法测定其含量。探讨了丙醇－硫酸铵双水相（醇－水）体系的形成及提取条件对
总黄酮得率的影响，得到的最优条件为：醇－水比０．８∶１，硫酸铵的量８ｇ，料液比１∶５０；
超声时间４０ｍｉｎ。结果表明，该方法可有效地从新疆圆柏实中提取总黄酮，在最优条
件下提取率为１１．３３ｍｇ／ｇ。在此条件下，圆柏果实总黄酮提取液对亚硝化反应的抑制
能力接近抗坏血酸。
关键词：超声波提取；双水相分离；圆柏果实；总黄酮；亚硝化反应
中图分类号：Ｏ６５２．６　　　文献标识码：Ａ
新疆圆柏（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ　ｓａｂｉｎａ）又叫叉子圆柏、沙地柏，臭柏等［１］，其嫩枝叶、果实和枝都可入药，性味苦
涩、微寒，维医临床用于风寒头痛、风湿性关节炎等疑难病症的治疗，以及出血［２］。黄酮类化合物在植物界
中分布广泛，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗抑郁调节神经内分泌以及很强的保肝等多种生理功效［３－４］，因此，
对天然植物中黄酮的提取与测定具有很强的实用意义和应用价值。
双水相萃取技术是一种新型液－液萃取分离技术，随着该技术的不断发展，双水相萃取技术已在细胞
生物学、生物化学、生物化工等领域得到广泛应用［５－６］，而且在皂苷、黄酮、多元醇等中草药活性成分的提
取分离方面也得到了应用。本文用双水相提取新疆圆柏果实中的总黄酮，方法简单、环境温和、提取率高、
能耗低，选择的析相盐（ＮＨ４）２ＳＯ４价格便宜、室温溶解度高、温度效应低。且在模拟人体胃液（ｐＨ＝３．０，
温度为３７℃）条件下，用分光光度法测定了圆柏果实总黄酮提取液对亚硝化反应的抑制能力，为开发圆柏
果实的药用价值提供科学依据。
１　实验部分
１．１　仪器、试剂及材料
Ｔ６新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ＺＦ－２型三用紫外仪；ＦＷ－１００高
速粉碎机；ＬＡ２０４分析天平；ＫＱ５２００Ｂ超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；８０－２Ｂ型低速离心机
（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；循环水式多用真空泵。
芦丁对照品（中国药品生物制品检定所）。正丙醇、硫酸铵、９５％乙醇、甲醇、结晶氯化铝、亚硝酸钠、柠
檬酸、磷酸氢二钠、碳酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、α－萘胺、二甲胺、抗坏血酸（ＶＣ），所用试剂均为
分析纯。实验用水为二次蒸馏水。
圆柏果实购于新疆维吾尔医院，产地新疆和田，材料洗净后自然阴干，粉碎，过４０目筛，备用。
１．２　实验方法
１．２．１　标准溶液的配制　精确称取芦丁对照品２５ｍｇ，用５０％甲醇溶解并定容于２５０ｍＬ容量瓶中，摇
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第４期 孙娟娟 等：双水相提取新疆圆柏果实中的总黄酮及抑制亚硝化反应的研究 第２８卷
匀得０．１ｍｇ／ｍｌ的芦丁标准溶液。
１．２．２　标准曲线的绘制　准确移取上述芦丁标准液０．０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＬ于１０ｍＬ容量瓶中，
加３ｍＬ　３％ＡｌＣｌ３溶液，摇匀，二次蒸馏水定容，显色３０ｍｉｎ，以试剂空白作参比，在波长４１７ｎｍ处测定吸
光值。以吸光值Ａ为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度（ｃ，ｍｇ／ｍＬ）为横坐标，得回归方程：Ａ＝３０．２４７５１ｃ－
０．００４２４，ｒ＝０．９９９８，线性范围为０～２５μｇ／ｍＬ。
１．２．３　总黄酮含量的测定　精确移取１．０ｍＬ圆柏果实总黄酮提取液（２．２节）于１０ｍＬ容量瓶中，加３
ｍＬ　３％ＡｌＣｌ３溶液，摇匀，乙醇水溶液定容，显色３０ｍｉｎ，以空白试剂作参比，在波长４１７ｎｍ处测定吸光
值，按式（１）计算总黄酮含量：
Ｘ＝Ｃ×Ｖ１×Ｖ２Ｍ×Ｖ３
（１）
式中，Ｘ为样品中总黄酮提取率，ｍｇ／ｇ；ｃ为标准曲线中黄酮的浓度，ｍｇ／ｍＬ；Ｖ１为稀释体积，ｍＬ（实验中
Ｖ１＝１０ｍＬ）；Ｖ２为样品溶液的体积，ｍＬ（实验中Ｖ２＝５０ｍＬ）；Ｍ 为样品质量，ｇ；Ｖ３为取样体积，ｍＬ（实验
中Ｖ３＝１ｍＬ）。
１．２．４　圆柏果实总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定［７］　分别吸取圆柏果实总黄酮提取液０．０、０．５、１、２、３、
４、５、６、７ｍＬ于２５ｍＬ具塞管中，加入０．０５ｍｇ／ｍＬ的ＮａＮＯ２标准溶液２．０ｍＬ，ｐＨ＝３．０的柠檬酸－磷酸
氢二钠缓冲溶液１０ｍＬ，３７℃恒温１ｈ。取出后加０．４％对氨基苯磺酸溶液２．０ｍＬ，摇匀，静置５ｍｉｎ，加
０．２％盐酸萘乙二胺溶液１．０ｍＬ，蒸馏水定容，摇匀，静置１５ｍｉｎ，在３　０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ。在吸收
波长５４０ｎｍ处测定吸光度，平行测定三次。制备同浓度的抗坏血酸作对照。清除率计算公式如下：
清除率（％）＝ ［（Ａ０－Ａ）／Ａ０］×１００ （２）
式中：Ａ０为未加样品溶液时ＮａＮＯ２的吸光度值；Ａ为加入样品溶液后ＮａＮＯ２的吸光度值。
１．２．５　圆柏果实总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定［７－８］　分别吸取圆柏果实总黄酮提取液０．０、０．５、１、
２、３、４、５、６、７ｍＬ于２５ｍＬ具塞管中，加ｐＨ＝３．０的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液１０ｍＬ，１ｍｍｏｌ／Ｌ的
ＮａＮＯ２溶液１．０ｍＬ，１ｍｍｏｌ／Ｌ的二甲胺溶液１．０ｍＬ，二次蒸馏水定容，３７℃恒温１ｈ。移取上述溶液
１．０ｍＬ于培养皿中，加０．５％Ｎａ２ＣＯ３溶液０．５ｍＬ，于紫外分析仪２５４ｎｍ波长处照１５ｍｉｎ。取出加１％
对氨基苯磺酸１．５ｍＬ、０．１％α－萘胺１．５ｍＬ和二次蒸馏水０．５ｍＬ，摇匀静置１５ｍｉｎ，在３　０００ｒ／ｍｉｎ的
转速下离心１０ｍｉｎ。在吸收波长５２５ｎｍ处测定吸光值，平行测定三次。制备同浓度的抗坏血酸作对照。
阻断率计算公式如下：
阻断率（％）＝ ［（Ａ０－Ａ）／Ａ０］×１００ （３）
式中：Ａ０为未加样品溶液时ＮａＮＯ２的吸光度值；Ａ为加入样品溶液后ＮａＮ０２的吸光度值。
２　结果与讨论
２．１　丙醇－硫酸铵双水相的形成
在丙醇－水体系中加某种析相盐可形成双水相，常用的析相盐［９－１０］有（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＮＯ３、
Ｎａ３ＰＯ４、ＮａＣｌ或Ｎａ２ＳＯ４等。本实验选择价格便宜、室温溶解度高、温度效应低的（ＮＨ４）２ＳＯ４为析相盐。
研究表明［１１－１２］，当丙醇与盐水相体积之比（醇－水）不同时，分相所需的（ＮＨ４）２ＳＯ４的量不同，醇－水比越大，所
需的硫酸铵就越少，当恒定醇－水比为０．４时，加入（ＮＨ４）２ＳＯ４的量达盐水相＝２５％时才可形成稳定的双水相
体系，而醇－水比为０．８时，只需加入１６％的（ＮＨ４）２ＳＯ４即可形成稳定的双水相体系。本文通过正交实验确
定了双水相提取新疆圆柏实所需的最佳醇－水比为０．８∶１，硫酸铵只需加入８ｇ。
２．２　样品溶液的制备和正交实验设计
准确称取１．０００ｇ圆柏果实粉末。按正交试验表加入一定的醇－水比溶液，按照正交试验表上相应的
提取工艺进行提取，再将提取液过滤，分层，取上清液，用５０％乙醇定容至５０ｍＬ，按１．２．３项方法测定并
计算总黄酮的含量。通过正交实验，探讨了对提取圆柏实总黄酮影响的四个因素：醇－水比、硫酸铵的量、
料液比和超声时间。
２．３　正交实验结果
从表２中分析得醇水比、硫酸铵的量、料液比和超声时间四因素对黄酮提取率影响的主次顺序为：醇－水
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第４期 分 析 科 学 学 报 第２８卷
比＞料液比＞硫酸铵的量＞超声时间，且最佳提取工艺为醇水比０．８∶１，料液比１∶５０，硫酸铵的量为８ｇ，超声
时间４０ｍｉｎ。在此提取工艺条件下进行三次平行实验，结果得到总黄酮的平均提取率为１１．３３ｍｇ／ｇ。
表１　正交试验因素及水平
Ｔａｂｌｅ　１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
Ｌｅｖｅｌ
Ｆａｃｔｏｒｓ
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ
ａｎｄ　ｗａｔｅｒ
Ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ＡＰＳ
（ｇ）
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｌｉｑｕｉｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
（ｇ∶ｍＬ）
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ
（ｍｉｎ）
１　 ０．６∶１　 ６　 １∶４０　 ３０
２　 ０．７∶１　 ８　 １∶５０　 ４０
３　 ０．８∶１　 １０　 １∶６０　 ５０
４　 ０．９∶１　 １２　 １∶７０　 ６０
表２　正交试验结果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
Ｎｏ． Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ　 Ａｂｓｏｒｂｅｎｃｅ　 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（ｍｇ／ｇ）
１　 １　 １　 １　 １　 ０．３５１　 ５．８７
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ０．４８７　 ８．０６
３　 １　 ３　 ３　 ３　 ０．３６９　 ６．１６
４　 １　 ４　 ４　 ４　 ０．３０４　 ５．１０
５　 ２　 １　 ２　 ３　 ０．５２３　 ８．７２
６　 ２　 ２　 １　 ４　 ０．４７１　 ７．８５
７　 ２　 ３　 ４　 １　 ０．４５１　 ７．５３
８　 ２　 ４　 ３　 ２　 ０．５１１　 ８．５１
９　 ３　 １　 ３　 ４　 ０．５８４　 ９．７３
１０　 ３　 ２　 ４　 ３　 ０．５５７　 ９．２７
１１　 ３　 ３　 １　 ２　 ０．５１５　 ８．５８
１２　 ３　 ４　 ２　 １　 ０．６８１　 １１．３３
１３　 ４　 １　 ４　 ２　 ０．４６６　 ７．７７
１４　 ４　 ２　 ３　 １　 ０．４７９　 ７．９８
１５　 ４　 ３　 ２　 ４　 ０．４８３　 ８．０５
１６　 ４　 ４　 １　 ３　 ０．３６５　 ６．１１
ｋ１／４　 ６．３０　 ８．０２　 ７．１０　 ８．１８
ｋ２／４　 ８．１５　 ８．２９　 ９．０４　 ８．２３
ｋ３／４　 ９．７３　 ７．５８　 ８．１０　 ７．５７
ｋ４／４　 ７．４８　 ７．７６　 ７．４２　 ７．６８
Ｒ　 ３．４３　 ０．７１　 １．９４　 ０．６６
２．４　抑制亚硝化反应的结果
由图１和图２可知，圆柏果实总黄酮提取液对ＮａＮＯ２的清除率和对亚硝胺合成的阻断率最大分别可
达７０．９％和６５．１％，其阻断率大于同浓度下的抗坏血酸，说明圆柏果实总黄酮提取液对亚硝化反应有较
强的抑制能力。
图１　清除率结果
Ｆｉｇ．１　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｒａｔｅ
图２　阻断率结果
Ｆｉｇ．２　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｄｉｓｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ　ｒａｔｅ
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第４期 孙娟娟 等：双水相提取新疆圆柏果实中的总黄酮及抑制亚硝化反应的研究 第２８卷
３　结论
本文采用超声集成丙醇－硫酸铵双水相萃取方法提取新疆圆柏果实中的总黄酮，得最佳提取工艺为：
醇－水比０．８∶１；料液比１∶５０；硫酸铵的量８ｇ；超声时间４０ｍｉｎ。此条件下总黄酮提取率可达１１．３３ｍｇ／
ｇ。本实验充分利用了超声波的高效提取以及双水相体系的分离作用，方法环境友好，降低了提取温度，提
高了得率，而且相比于回流，缩短了提取时间，所以该方法适合从新疆圆柏实中提取总黄酮。
清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成是防癌的一种有效途径，在模拟人体胃液的条件下，圆柏实总
黄酮提取液能有效清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成，且对亚硝化反应的抑制能力接近抗坏血酸。因此，
若能将圆柏实用于保健食品的开发，前景可观，将可能产生极大的社会和经济效益。圆柏实极有可能成为
一种经济、高效、具有抗癌作用的保健品新资源。
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Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍＪｕｎｉｐｅｒｕｓ　ｓａｂｉｎａ　Ｓｅｅｄ　Ｕｓｉｎｇ
Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
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Ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
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