全 文 ：禺毛茛 SRAP反应体系优化及引物筛选
赵中伟 1, 2 , 李同建 1 , 徐　婧1 , 廖　亮 1 , 徐玲玲 1
(1.九江学院生命科学学院 ,江西九江 332000;2.江西农业大学园林与艺术学院 ,江西南昌 330045)
　　摘要:以禺毛茛叶片 DNA为模板 ,采用正交试验设计 , 以 10×Buffer、Mg2+、dNTP和引物 4种因素 3个水平 , 对禺
毛茛 SRAP反应体系进行研究 , 并比较了不同浓度模板 DNA、Taq酶用量对扩增效果的影响 ,建立了禺毛茛的 SRAP最
佳反应体系。结果表明 ,禺毛茛 SRAP-PCR最佳反应体系为:20 μl反应体系中 , 10×Bufer2.5 μl, 25 mmol/LMg2+
2.5 μl, 2mmol/LdNTPs1.5 μl, 5 μmol/L引物 1.0μl,模板量为 100 ～ 200ng, Taq酶 0.5 U。运用该体系对 10份禺毛
茛进行验证 ,证明该体系稳定可靠 ,并从 100个 SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰 、多态性丰富的 36个引物组
合。这一优化的体系及多态性引物组合为利用 SRAP标记技术进行毛茛属植物分子遗传学研究提供了科学依据。
　　关键词:禺毛茛;SRAP标记;体系优化;引物筛选
　　中图分类号:R282.7　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)04-0028-03
收稿日期:2009-02-11
基金项目:国家自然科学基金(编号:30860027)。
作者简介:赵中伟(1982—),男 ,河北石家庄人 , 硕士研究生 ,从事植
物分子生物学研究。
通讯作者:徐玲玲。 E-mail:lingl239@163.com。
　　SRAP标记(sequence-relatedamplifiedpolymorphism,序
列相关扩增多态性)是 2001年由 Li和 Quiros[ 1]开发的一种
基于 PCR的新型分子标记技术 。 Budak等 [ 2 ]以野牛草为材
料比较了 RAPD、SSR、ISSR和 SRAP4种分子标记技术 ,发现
SRAP有最丰富的多态性和最强的区分能力;Ferriol等 [3 ]在南
瓜中从 SRAP中获得的信息比从 AFLP与形态标记获得的信
息更吻合其进化历史 。 Riaz等 [4 ]发现 SRAP标记在桃和油桃
品种鉴定中比 SSR标记更有效 。 SRAP技术具有操作简便 、
快速 、多态性丰富 、重复性好 、不需预知物种序列信息以及成
本较低等优点 ,目前已广泛应用于遗传图谱构建 、基因定位及
QTL分析 [ 5 -7 ] 、遗传多样性分析 [ 3, 8-11 ] 、品种鉴定 [ 12 -13] 、杂种
优势预测 [ 14-15 ] 、比较基因组学 [ 16]等诸多领域 ,但 SRAP标记
技术应用于药用植物还初见报道 [ 10, 17 -18] 。
毛茛属(Ranunculus)植物多为一年生或多年生草本 ,一
般有小毒 ,具有清热解毒的功效 。除猫爪草 (R.ternatus)以
块根入药外 ,大多数以全草入药 ,可治疗多种疾病 。毛茛属药
用植物的临床应用表明 ,该属药用植物有一定的疗效 。现代
药理对中药材猫爪草 、石龙芮(R.sceleratus)、禺毛茛(R.can-
toniensis)、扬子毛茛(R.sieboldii)的研究表明 ,这些植物具有
抗结核菌 、抗急性炎症及较强的抗肿瘤作用 [ 19 -21] 。
本研究采用 SRAP新型分子标记技术 ,利用禺毛茛 DNA
作试验材料 ,建立并优化了毛茛属药材 SRAP技术分析体系 ,
将 SRAP分子标记技术应用到毛茛属植物的遗传多样性研
究 ,构建其亲缘关系的分子系统树 ,为从分子水平鉴定毛茛属
不同药材种质资源及道地药材提供参考 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料禺毛茛采自江西九江市南湖公园 ,每 1份采集
样本的植株之间至少相隔 5 m,以尽量保证包含不同的基因
型 。取禺毛茛新鲜嫩叶于硅胶中 , -70℃冰箱保存 。
1.2　方法
1.2.1　DNA提取 　取硅胶干燥的禺毛茛嫩叶 ,采用改良的
CTAB法 [ 22 ]提取总 DNA。
1.2.2　SRAP-PCR扩增体系的优化 　SRAP引物采用 Li
等 [ 1 ]及 Riaz等 [ 4]发表的引物序列 ,包括 10条正向引物和 10
条反向引物(表 1),委托上海生工生物工程有限公司合成 。
PCR反应程序采用 Li等 [ 1 ]应用于蔬菜上的反应程序:94 ℃
预变性 5 min, 94 ℃变性 1min, 35 ℃退火 1 min, 72℃延伸 1
min, 5个循环;94℃变性 1 min, 50 ℃退火 1min, 72 ℃延伸 1
min, 35个循环;72 ℃延伸 10 min, 4℃保存 。采用 L9(34 )正
交试验设计 [ 23 ] ,对 SRAP反应体系(20μl)中的 10×Buffer用
量 、Mg2+浓度 、dNTPs浓度 、引物浓度进行 4因素 3水平的筛
选分析(表 2、表 3),共 9个处理 。扩增产物用 0.6%聚丙烯
酰胺凝胶垂直电泳检测 ,银染显影 ,拍照记录条带 。
表 1　禺毛茛 SRAP引物序列
编号 正向引物 编号 反向引物
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em5 GACTGCGTACGAATTAAC
Me6 TGAGTCCAAACCGGTAA Em6 GACTGCGTACGAATTGCT
Me7 TGAGTCCAAACCGGTCC Em7 GACTGCGTACGAATTCAA
Me8 TGAGTCCAAACCGGTGC Em8 GACTGCGTACGAATTAGC
Me9 TGAGTCCAAACCGGACA Em9 GACTGCGTACGAATTACG
Me10 TGAGTCCAAACCGGACG Em10 GACTGCGTACGAATTTAG
1.2.3　模板 DNA浓度优化 　应用上述体系最佳组合 ,在
20 μl体系中 ,设定 5个模板 DNA浓度 ,即 1 000、200、100、50、
25 ng/20μl,其他成分按最佳组合加入 ,引物随机选取 Em10
和 Me5组合 ,对反应体系中的模板 DNA浓度进行优化 。
1.2.4　Taq酶用量优化　在 20 μl体系中 ,设定 3个 Taq酶
用量梯度 ,即 1.00、0.75、0.50 U/20μl,其他成分按最佳组合
加入 ,引物随机选取 Em10和 Me5组合 ,对反应体系中的 Taq
—28— 江苏农业科学　2009年第 4期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.04.064
表 2　禺毛茛 SRAP-PCR体系的因素和水平
水平
用量(μl)
10×Bufer 25mmol/LMg2+
2mmol/L
dNTPs
5μmol/L
Primers
1 2.0 1.5 1.5 0.5
2 2.5 2.0 2.0 1.0
3 3.0 2.5 2.5 1.5
表 3　禺毛茛 SRAP-PCR反应 L9(34)正交试验设计
处理
序号
用量(μl)
10×Bufer 25mmol/LMg2+
2mmol/L
dNTPs
5μmol/L
Primers
1 2.0 1.5 1.5 0.5
2 2.0 2.0 2.0 1.0
3 2.0 2.5 2.5 1.5
4 2.5 1.5 2.0 1.5
5 2.5 2.0 2.5 0.5
6 2.5 2.5 1.5 1.0
7 3.0 1.5 2.5 1.0
8 3.0 2.0 1.5 1.5
9 3.0 2.5 2.0 0.5
酶用量进行优化 。
1.2.5　多态性 SRAP引物组合的筛选 　根据上述试验结果
确定的 SRAP-PCR最佳反应体系 ,选取 10条正向引物及 10
条反向引物(表 1)自由组合成 100个 SRAP引物组合 ,对 10
份禺毛茛材料进行多态性 SRAP引物组合的筛选 。
2　结果与分析
2.1　正交试验结果
禺毛茛 SRAP-PCR体系优化的正交试验结果如图 1所
示 。参照何正文等 [ 23 ]的方法 ,依据谱带的强弱及多少对扩增
结果进行直观分析 ,处理 8因杂带较多 ,不宜采用 。处理 3和
处理 6带型清晰 ,亮度高 ,且杂带少 ,扩增效果最好;但比较分
析 2个处理不同组分浓度差异 ,处理 6的 20 μl反应体系中
dNTPs及引物浓度都比处理 3少 ,综合考虑试验的效果和成
本 ,最终选择处理 6作为禺毛茛基因组 SRAP-PCR的最佳
扩增反应体系 ,即 20 μl反应体系中含有 10×Buffer2.5μl、
25 mmol/LMg2 + 2.5μl、2mmol/LdNTPs1.5μl、5μmol/L引
物 1.0 μl。
参照郑轶琦等 [ 24 ]的方法 ,对各组分浓度组合的正交试验
结果进行了统计分析(表 4),其中 T代表某水平下某因子参
与反应所产生的扩增条带的总和;X代表某因子在某水平参
表 4　禺毛茛正交试验结果分析
项目 10×Bufer Mg2+ dNTPs 引物
T1 110 80 137 77
T2 101 115 104 116T3 120 136 90 139
X1 6.1 4.4 7.6 4.3
X2 5.6 6.4 5.8 6.4X3 6.7 7.6 5 7.7
R 1.1 3.2 2.6 3.4
　　注:T为总条带数 , X为平均条带数 , R为极差。
与反应所产生的扩增条带的平均值;R为某因子的极差 ,即某
因子在不同水平下最大平均值与最小平均值之差 。 R值的大
小反映了该因子对试验结果影响的大小 , R值越大 ,影响越显
著 。结果显示在选定的 3个水平范围内 , 10 ×Bufer、Mg2+、
dNTPs和引物 4个因素对结果的影响由大到小依次为:引物
>Mg2 + >dNTPs>10×Bufer。 X值反映了影响因素各水平对
反应体系的影响情况 , X值越大 ,反应水平越好 ,从 X值结果
看 , 10×Bufer以水平 3好 , Mg2 +以水平 3好 , dNTPs以水平 1
好 ,引物以水平 2和 3较好 ,即 10 ×Bufer3.0 μl、25mmol/L
Mg2 + 2.5 μl、2mmol/LdNTPs1.5 μl、5 μmol/L引物 1.0 μl,
该处理水平与直观分析得出的最佳处理 6最接近 ,仅 10 ×
Bufer的用量有差异 ,其他各组分浓度均一致 。根据各因素
的 R值可以知道 Bufer对反应的影响最小 ,因此该结果与直
观分析结果基本一致 ,进一步确定处理 6为最优体系组合 。
2.2　模板不同浓度对 SRAP-PCR的影响
不同浓度模板 DNA对 SRAP-PCR的影响结果见图 2。
从图 2中可以看出 ,模板 DNA浓度为 50 ng和 25 ng的反应
条带不清晰且条带数不多 ,有些多态性条带无法显现 ,扩增产
物量较少;模板 DNA浓度为 200 ng和 100 ng的反应条带清
晰且条带数较多 ,扩增产物量较多;模板 DNA浓度为 1 000
ng的反应大多数电泳条带清晰 ,但有些带缺少 。综合考虑 ,
模板 DNA浓度在 100 ～ 200 ng可以用于禺毛茛 SRAP-PCR。
2.3　Taq酶浓度对 SRAP-PCR的影响
Taq酶在 PCR中的用量受体积、酶活性 、酶耐热性等因素
的制约 ,使用高浓度的酶不仅造成材料浪费 ,而且会导致非特
异性的扩增产物积累;酶的用量偏低会使新链合成效率下降 ,
导致扩增产物减少 ,因此酶的用量很重要 。由图 3可见 , Taq
酶的用量在 0.75 ～ 1U非特异性扩增产物比较多 ,条带比较
多 ,而用 0.5 U的 Taq酶 ,扩增的条带比较清晰且非特异性的
扩增产物较少 ,因此 Taq酶的用量以 0.5 U为宜 。
2.4　多态性 SRAP引物组合的筛选
用 100对引物组合对 10份禺毛茛进行 SRAP扩增 ,筛
选出 36对多态性引物组合 (表 5)。36对引物组合共扩增出
—29—赵中伟等:禺毛茛 SRAP反应体系优化及引物筛选
表 5　36对多态性引物组合的扩增结果
引物
组合
扩增
带数
多态性
带数
多态性比
例(%)
引物
组合
扩增
带数
多态性
带数
多态性
比例(%)
Me1+Em1 97 77 79.3 Me5+Em5 93 83 89.2
Me1+Em2 120 80 66.7 Me5+Em7 61 51 83.6
Me1+Em4 80 50 62.5 Me5+Em10 126 116 92.1
Me1+Em5 90 50 55.5 Me6+Em1 62 42 67.7
Me1+Em6 102 92 90.2 Me6+Em2 90 60 66.7
Me1+Em8 160 100 62.5 Me6+Em3 66 36 54.5
Me1+Em9 103 53 51.4 Me6+Em5 88 78 88.6
Me2+Em9 50 30 60.0 Me6+Em8 64 54 84.4
Me3+Em3 114 104 91.2 Me7+Em10 141 71 50.4
Me3+Em4 58 38 65.5 Me8+Em6 162 92 56.8
Me3+Em6 103 93 90.3 Me9+Em2 35 25 71.0
Me3+Em7 76 56 73.4 Me9+Em3 160 50 53.8
Me3+Em8 90 60 66.7 Me9+Em6 134 74 55.2
Me4+Em6 81 41 50.6 Me10+Em2 178 108 60.7
Me4+Em8 41 31 75.6 Me10+Em3 78 58 74.4
Me5+Em2 132 72 54.5 Me10+Em4 136 76 55.9
Me5+Em3 43 33 76.7 Me10+Em5 143 73 51.0
Me5+Em4 52 42 80.8 Me10+Em6 89 79 88.8
3 498条带 ,每个引物组合产生 35 ～ 178条 , Me10+Em2组合
扩增条带最多 (178条 ), Me9 +Em2组合扩增条带最少
(35条),平均每个引物组合产生 94.17条 。其中多态性条带
有 2 328条 ,每个引物组合产生 31 ～ 116条多态性带 ,平均每
个引物组合产生 64.66条多态性带 。每个引物组合产生的多
态性带的比例为 50.6% ～ 92.1%,平均为 68.7%,其中多态
性在 90.0%以上的组合有 4对 。
3　小结
在 PCR反应体系中各个因素间都会发生相互作用 ,而正
交试验设计进行 PCR反应体系优化的方法可以综合考察各
因素之间的相互作用。本研究应用正交试验设计对禺毛茛
SRAP-PCR反应体系进行优化 ,通过优化比较得出了适合禺
毛茛的反应体系 ,即:20 μl反应体系中 , 10×Bufer2.5 μl,
25 mmol/LMg2 + 2.5μl, 2mmol/LdNTPs1.5μl, 5μmol/L引
物 1.0 μl,模板量为 100 ～ 200ng, Taq酶 0.5 U。应用该反应
体系对自由组合的 100个引物进行了体系验证 ,结果表明该
反应体系稳定可靠 ,可用于毛茛属植物 SRAP分子标记研究 。
本研究还对 100对供试引物组合进行了多态性筛选 ,共得到
多态性引物组合 36个 ,多态性比例都在 50%以上 ,其中有 4
对在 90%以上 。该反应体系及 36个多态性引物组合可用于
毛茛属植物的遗传多样性与亲缘关系的研究 ,为毛茛属植物
药材的分类鉴定和道地性鉴定提供可靠的依据 。
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(下转第 31页)
—30— 江苏农业科学　2009年第 4期
棉花解旋酶基因克隆及生物信息学分析
张正黎 , 蔡应繁 , 李文涛 , 常志超 , 朱小燕
(重庆邮电大学生物信息学院 ,重庆 400065)
　　摘要:从棉花 cDNA文库中克隆了棉花解旋酶全长基因 , GenBank登记号:EU373038, 并对其编码的氨基酸序列
进行分析。结果显示 ,基因长度为 3 491 bp, 编码 930个氨基酸 , 其编码的蛋白质预测等电点和分子质量分别为 5.98
和 103.994 ku。蛋白质氨基酸序列分析表明 , 所获得的基因编码蛋白的氨基酸序列与 GenBank中拟南芥同源性为
74%与水稻同源性为 60%,与葡萄同源性为 79%。
　　关键词:棉花;解旋酶基因;克隆;序列分析
　　中图分类号:Q789　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)04-0031-03
(上接第 30页)
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　　解旋酶(helicase)是 NTP水解断裂核酸双链体(douplex)
间氢键及其互补碱基对间其他非共价键相互作用能量的驱动
蛋白(motorprotein),它广泛存在于原核生物和真核生物中 ,
但并不是所有的解旋酶的功能都是相同的 ,这些酶大部分具
有类似的属性及作用机制 [ 1] 。据报道 ,百合 DNA解旋酶在减
数分裂前期显著升高 ,在高等植物 DNA重组中发挥作用 [ 2] 。
在叶绿体 DNA中 ,复制启始于形成 2个 D-环(displacement
loop),这 2个环通过 DNA解旋作用相向扩展并形成 1个圆
收稿日期:2008-12-30
基金项目:国家自然科学基金(编号:30440032, 30771311);重庆市自
然科学基金(编号:cstc2007BB1328)。
作者简介:张正黎(1979—),女 ,四川人 ,讲师 ,研究方向为分子生物
学。 Tel:(023)62460536;E-mail:zhangzl@cqupt.edu.cn。
通讯作者:蔡应繁 ,博士 ,教授。 E-mail:caiyf3000@yahoo.com.cn。
锥形的复制叉结构(cairnsreplicativeforkedstructure)。该复
制叉结构通过 DNA解旋作用向 2个方向拓展 ,接着形成叶绿
体 DNA分子 。由于叶绿体 DNA解旋酶 Il的复制叉结构 ,所
以它在叶绿体 DNA复制中起作用 [3 ] 。本研究从棉花 cDNA
文库中克隆全长解旋酶基因 ,并利用生物信息学软件对其进
行结构分析 ,为深入研究 DNA解旋酶参与棉花腺体形成的作
用机制奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
棉花腺体发育相关 cDNA均一化文库为本实验室 [ 4]所
建 ,建库所用供试材料为湘棉 -18。
1.2　试剂与仪器
DNAMarkerDL2000购自天为公司 ,其他常规试剂 、耗材
—31—江苏农业科学　2009年第 4期