全 文 ：河北农业科学 , 2010, 14 (11):68-72
JournalofHebeiAgriculturalSciences
　
编辑　杜晓东
SRAP标记技术在谷子及其近缘野生种青狗尾草的应用分析
李海权 1 , 智　慧 1, 2 , 王永芳 1 , 李　伟 1 , 刘小静1 , 刁现民 1, 2
(1.河北省农林科学院谷子研究所 , 国家谷子改良中心 , 河北省杂粮研究实验室 , 河北 石家庄　050031;2.中国农业科学院作
物科学研究所 , 北京　100081)
摘要:青狗尾草 (Setariaviridis)被认为是谷子 (S.italica)的祖先种 , 因此研究青狗尾草与谷子品种间的亲缘
关系 , 对于野生有益基因的发掘利用有着深远意义。以来源于不同国家的谷子和青狗尾草共 24个品种为试材 ,
分析 SRAP技术在谷子和青狗尾草中的适用性研究。结果表明:(1)用 24个标记组合共产生 127条多态性带 ,
平均每个标记组合产生 5.29条多态扩增带。每对引物组合产生的多态性带的比例为 16.67% ～ 37.90%, 平均
为 28.30%。说明供试青狗尾草和谷子具有较为丰富的遗传多样性。 (2)对所有材料进行聚类分析 , 遗传相似
系数为 0.56 ～ 0.90, 平均遗传相似系数为 0.79。相似系数为 0.56时 , 可以将 24份材料分成 2大类群:第一类
群全部为青狗尾草 , 第二类群则包括谷子和部分青狗尾草材料。综上所述 , SRAP技术能够有效地对谷子和青
狗尾草属进行多态性分析。
关键词:SRAP标记技术;谷子;青狗尾草;多态性分析;聚类分析
中图分类号:S515文　　　文献标识码:A　　　文章编号:1008-1631 (2010)11-0068-05
ApplicationofSRAPTechnologyonFoxtailMiletandItsWildRelativeGreenFoxtail
LIHai-quan1 , ZHIHui1, 2 , WANGYong-fang1 , LIWei1 , LIUXiao-jing1 , DIAOXian-min1 , 2
(1.InstituteofMiletCropsofHebeiAcademyofAgricultureandForestrySciences, NationalMiletImprovementCenter,
CerealCropsResearchLaboratoryofHebeiProvince, Shijiazhuang　050031, China;2.InstituteofCropSciences, Chinese
AcademyofAgriculturalSciences, Beijing　100081, China)
Abstract:Wildgreenfoxtail(Setariaviridis)wasregardedastheancestoroffoxtailmilet(S.italica).The
phynogenticrelationshipbetweengreenfoxtailandfoxtailmiletvarietieswasofprofoundsignificance.24 accesionsof
foxtailmiletandgreenfoxtailwereanalyzedbySRAPtechnology.Theresultsshowedthat127 polymorphicbandswere
amplifiedwith24 pairsofprimers.Theaverageproportionofpolymorphicbandwitheachpairofprimerswas28.30%,
thatwastosay, greenfoxtailandfoxtailmiletwererichingeneticdiversity.Thegeneticsimilaritycoeficientsamongeach
accessionrangedfrom0.56 to0.90withtheaverageof0.79.Clusteranalysisrevealedthat24accessionsweredividedinto
twogroups, onegroupincludedgreenfoxtailvarieties, andtheotherincludedpartofgreenfoxtailvarietiesandfoxtail
milet.
Keywords:SRAPtechnology;Foxtailmilet;Greenfoxtail;Polymorphicanalysis;Clusteranalysis
收稿日期: 2010-09-11
基金项目:国家自然科学基金重点项目 (30630045);国家自然科学
基金项目 (30771166);河北省自然科学基金项目
(C2009001295);河北省自然科学基金作物抗逆抗病虫基
地专项 (08B026);河 北省农 林科学 院青 年基金
(A09030101)
作者简介:李海权 (1977-), 男 , 河北乐亭人 , 助理研究员 , 硕士 ,
主要从事谷子生物技术和分子育种研究。
　　谷子 (Setariaitalica)属禾本科 (Graminea)黍亚
科 (Panicoideae)黍系 (Panicatae)黍族 (Paniceae)
狗尾草亚族 (Setavineae)狗尾草属 (Setaria), 是世界
起源较早的古老作物之一 , 我国不仅是谷子的主产国 ,
也是谷子的起源中心 , 其中青狗尾草 (S.viridis)与谷
子的亲缘关系近 , 被认为是谷子的祖先种 [ 1] 。因此 , 研
究与谷子亲缘关系较近的青狗尾草材料 , 对于野生有益
基因的发掘利用具有参考意义。但相对于水稻 、 玉米和
小麦来讲 , 应用在谷子上的分子标记研究相对缺乏 , 目
前只有 RFLP、 RAPD、 AFLP等标记在狗尾草属上应用
过 , 而 SSR分子标记尚属于开发阶段 , 数量比较少。
美国加州大学蔬菜作物系的 Li与 Quiros博士于
2001年提出了一种新型分子标记 SRAP(Sequence-relat-
edamplifiedpolymorphism)[ 2] 。该标记是通过独特的引
物设计对 ORFs(OpenReadingFrames)进行扩增。上
游引物长 17 bp, 5端的前 10bp是一段填充序列 , 紧接
着是 CCGG, 组成核心序列及 3端 3个选择碱基 , 对外
显子进行特异扩增。下游引物长 18bp, 5端的前 11bp
是一段填充序列 , 紧接着是 AATT, 组成核心序列及
3端 3个选择碱基 , 对内含子区域 、 启动子区域进行特
异扩增。因不同个体和物种的内含子 、 启动子及间隔区
长度不同而产生多态性。该标记具有检测简单;重复性
DOI :10.16318/j.cnki.hbnykx.2010.11.027
第 11期 李海权等:SRAP标记技术在谷子及其近缘野生种青狗尾草的应用分析
好;每对引物都能够产生适度的多态性标记 , 而且其中
一部分是共显性标记;能够比较容易地分离目的标记并
测序等特点。此标记已在棉花 (Gosypiumspp.)、 水稻
(Oryzasativa)、 青 稞 (Hordeum vulgareL.var.nudum
Hook.F)、 西瓜 (Citrulusschrad.)、 甜菜 (Betavulgar-
is)、 油菜籽 (Brassicanapus)、 大蒜 (Aliumsativum)、
番茄 (Solanumlycopersicum)和黄瓜 (Cucumissativus
L.)等多种作物研究得到良好结果 [ 9 ～ 14] 。但 SRAP技术
在谷子和青狗尾草中的应用未见报道。本研究选用部分
谷子品种和青狗尾草为试材 , 运用 SRAP技术对其进行
多态性分析 , 以探讨 SRAP技术对狗尾草属遗传多态性
的适用性 , 旨为狗尾草属分子水平研究拓展有利的分析
工具。
1　材料与方法
1.1　材料
选用来源于中国 、 法国 、 德国 、 日本等各地起源的
谷子和青狗尾草共 24个品种为试材 (表 1)。这些材料
来源广泛 , 地区跨度大 , 遗传基础丰富。 24份材料全部
在河北省农林科学院国家谷子改良中心试验基地种植。
表 1　青狗尾草和谷子试材的名称及来源Table1　Thenameandoriginof24 accessions
序号 品种名称或编号 种名 来源 代码
1 G004 S.viridis Hebei, China Vir04-CH-HB
2 G013 S.viridis Guizhou, China Vir13-CH-GZh
3 G023 S.viridis Gansu, China Vir27-CH-GS
4 G027 S.viridis Yunnan, China Vir23-CH-YN
5 Qing36 S.viridis Neimenggu, China VirQ36-CH-NMG
6 Qing37 S.viridis Heilongjiang, China VirQ37-CH-HLJ
7 09012 S.viridis Russia Vir12-RUS
8 09001 S.viridis Uzbekistan Vir01-UZB
9 09006 S.viridis France Vir06-FRA
10 09007 S.viridis Oklahoma, America Vir07-OKL
11 09011 S.viridis Japan Vir11-JAP
12 09018 S.viridis Germany Vir18-GER
13 等身齐 S.italica Gansu, China ItaDSQ-CH-GS
14 翻身谷 S.italica Jilin, China ItaFSG-CH-JL
15 压塌车 S.italica Shanxi, China ItaYTC-CH-SX
16 大青苗 S.italica Heilongjiang, China ItaDQM-CH-HLJ
17 光光头 S.italica Henan, China ItaGGT-CH-HN
18 竹叶青 S.italica Neimenggu, China ItaZYQ-CH-NMG
19 05016 S.italica Germany Ita16-GER
20 05031a S.italica Hungary Ita31-HUN
21 罗马尼亚 6号 S.italica Roumania Ita06-ROU
22 KrastBorn S.italica Holand ItaKB-HOL
23 05026 S.italica France Ita26-FRA
24 Mohabaojia S.italica France ItaMo-FRA
2.2　方法
2.2.1　试验方法
2.2.1.1　DNA提取。基因组 DNA提取方法为 CTAB
法。通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA
质量。稀释至所需浓度后 , -20℃保存。
2.2.1.2　PCR扩增及其电泳分析。按照 GLi等 [ 2]提出
的 SRAP引物设计原则设计引物 , 序列 (表 2)由上海
生物工程技术服务有限公司合成。 PCR反应体系为:总
反应体积为 20μL, 其中含 MgCl2 2mmol/L、 dNTPs
2 000μmol/L、 Tag酶 0.15U (购自 TAKARA)、 模板
DNA50ng、 正向引物 50ng和反向引物 50ng, 不足部分
用 ddH2O补足。 PCR反应于 IBM9700扩增仪上进行。
热循环程序为:94℃变性 1min, 35℃复性 1min,
72℃延伸 1min, 共 5个循环;94℃变性 1min, 50℃复
性 1min, 72℃延伸 1min, 共 35个循环;72℃延伸
5min, 4℃保存。
扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶 (6%, 7mol/L尿素)
电泳检测 , 电泳分离 , 固定 、 银染 、 显影和定影等步骤
参照林忠旭等 [ 18]方法。
2.2.1.3　随机引物的筛选。用 2个有代表性的品种 ,
对 110对 SRAP标记组合进行筛选。用多态性好 、 易于
区分的引物组合 , 检测供试的谷子和青狗尾草材料。
2.2.1.4　遗传多样性的 SRAP分析。用筛选到的引物组
合 , 对各品种的 DNA样品进行 PCR扩增。仅统计有差
异 、 易于识别的多态性条带 , 有带记为 1, 无带记为 0。
2.2.2　数据分析　数据分析采用 Jsccards相似系数 , 使
用 NTSYS-PC2.10软件 , 非加权组平均法 (UPGMA)聚
类。相似系数计算公式为:Sij=a/ (a+b+c)。其中 ,
a表示 2份样品共有条带数 , b表示 i样品特有条带数 ,
c表示 j样品特有条带数。
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河北农业科学 2010年
表 2　试验采用的 SRAP引物序列Table2　ThesequencesofSRAPprimers
正向引物 正向引物序列 反向引物 反向引物序列
M1 TGAGTCCAAACCGGATA E1 GACTGCGTACGAATTAAT
M2 TGAGTCCAAACCGGAGC E2 GACTGCGTACGAATTTGC
M3 TGAGTCCAAACCGGAAT E3 GACTGCGTACGAATTGAC
M4 TGAGTCCAAACCGGACC E4 GACTGCGTACGAATTTGA
M5 TGAGTCCAAACCGGAAG E5 GACTGCGTACGAATTAAC
M6 TGAGTCCAAACCGGACA E6 GACTGCGTACGAATTGCA
M7 TGAGTCCAAACCGGACG E7 GACTGCGTACGAATTCAA
M8 TGAGTCCAAACCGGACT E8 GACTGCGTACGAATTCAC
M9 TGAGTCCAAACCGGAGG E9 GACTGCGTACGAATTCAG
M10 TGAGTCCAAACCGGAAA E10 GACTGCGTACGAATTCAT
E11 GACTGCGTACGAATTCTA
3　结果与分析
3.1　SRAP-PCR引物筛选结果
本研究以谷子基因 DNA为模板 , 以程序 94℃
5min; 94℃ 1min, 35℃ 1min, 72℃ 10min
(5cycles); 94℃ 1min, 47℃ 1min, 72℃ 15min
(35cycles);72℃ 10min, 对 110个 SRAP标记组合进
行筛选 (图 1)。选择多态性好条带清晰的引物 , 应用
于狗尾草和青狗尾草的分析。共筛选出 24个多态性良
好的引物组合。
图 1　部分 SRAP引物筛选结果Fig.1　TheamplificationresultsofsomeSRAPprimers
　　运用 24个标记组合对谷子和青狗尾草进行应用性
分析 , 统计结果 (表 3)显示 , 每个标记组合产生 13 ～
29个比较清晰的扩增带 , 24个标记组合共产生 448条 ,
平均每个标记组合产生 18.67条。每个标记组合产生
3 ～ 11条多态性带 (图 2), 24个标记组合共产生 127条
多态性带 , 平均每个标记组合产生 5.29个多态性条带。
每对引物组合产生的多态性带的比例为 16.67% ～
37.90%, 平均为 28.30%。
3.2　谷子和青狗尾草的 24份材料聚类分析
根据 24对引物组合扩增的 127个多态性条带 , 对
24个谷子和青狗尾草材料进行分析 , 按照相似系数构
建进化树 (图 3)。 24个谷子和青狗尾草材料的遗传相
似系数为 0.56 ～ 0.90, 平均遗传相似系数为 0.79。相
似系数为 0.56时 , 可以将 24份材料分成 2大类群:第
一类群全部为青狗尾草 , 第二类群则包括谷子和部分青
狗尾草材料。第一类群里来源于甘肃 、 河北和云南的青
狗尾草首先聚在一起 , 来源于国外 (乌兹别克斯坦 、 日
本和美国)的青狗尾草聚在一起;第二类群里来源于陕
西 、 内蒙古和黑龙江的谷子首先聚在一起 , 甘肃和河南
的谷子聚在一起。
4　结论与讨论
4.1　SRAP可行性分析
SRAP作为一项新发展的技术 , 近年来已广泛应用
在棉花等多种作物的研究工作中 [ 9 ～ 14] 。作者首次将
SRAP技术应用于狗尾草属的研究 , 结果显示了极大的
优越性和可行性 , 尤其是扩增的条带多而且清晰 , 易于
分辨。特别是 SRAP引物同样具有通用性 , 上游引物和
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第 11期 李海权等:SRAP标记技术在谷子及其近缘野生种青狗尾草的应用分析
表 3　SRAP引物组合 、 扩增带数及多态性带数Table3　ThetotalbandsandpolymorphicbandsofSRAPprimercombinations
序号 引物组合 总带数(条) 多态性带数(条) 多态性比例(%)
1 M1E3 23 5 21.74
2 M1E11 25 7 28.00
3 M2E6 13 3 23.80
4 M3E2 16 6 37.50
5 M3E5 14 5 35.70
6 M5E1 15 4 26.67
7 M5E2 23 6 24.74
8 M5E3 16 5 35.64
9 M5E7 29 11 37.90
10 M5E9 14 4 28.60
11 M5E10 17 4 23.53
12 M6E9 14 3 21.43
13 M6E10 27 10 37.00
14 M6E11 15 3 21.43
15 M8E4 16 4 25.00
16 M8E7 18 3 16.67
17 M8E9 25 7 28.00
18 M8E11 19 6 31.20
19 M9E2 16 6 37.50
20 M9E5 27 8 29.60
21 M9E7 18 5 27.80
22 M9E10 16 4 25.00
23 M10E2 13 3 23.80
24 M10E7 19 6 31.80
总数 448 127 28.50
平均 18.67 5.29 28.30
图 2　引物 M5E7扩增的 SRAP图谱Fig.2　TheamplificationresultswithM5E7＊　M— 100 bp的标准分子量 , 品种代码见表 1。
下游引物可以两两任意搭配 , 提高了引物的利用效率 ,
且一般都可以扩增出条带。由于采用 PCR扩增 , 不需
要像 RFLP标记那样要求高纯度和高浓度的 DNA以及使
用放射性同位素 , 不需要像 SSR标记那样花费人力 、 物
力进行引物开发 , 比 RAPD标记稳定 , 不需要像 AFLP
那样需要预扩增和连接 , 但扩增结果的多态性可与
AFLP标记相媲美。林忠旭等 [ 15]应用 SRAP和 SSR进行
棉花品种的遗传多样性分析 , 二者可以很好地结合以便
更全面地分析整个基因组 DNA。作者认为 , SRAP与
图 3　24个谷子和狗尾草的 SRAP标记聚类图Fig.3　Thedendrogramofgeneticrelationshipamong24 accessionsdetectedbySRAP＊　品种代码见表 1。
SSR相互结合可以更全面地分析整个基因组 DNA,
SRAP在操作技术等各方面优于 RAPD, 是对 SSR的补
充 , SRAP标记是一项高效的分子标记技术。
4.2　SRAP在谷子和青狗尾草中的应用
·71·
河北农业科学 2010年
本研究中每对引物组合的多态性带数 (5.29个 )
与 Budak 等 [ 4] 对 野 牛 草 (Bufalogras.Buchloe
dactyloides.)品种研究的多态性带数 8个以及 Ferriol
等 [ 3] 对西葫芦 (CucurbitapepoL.)和笋瓜 (Cucu-
mismaximaduch.)研究的 5.14个相近。但不同研究中 ,
扩增带的多态性比例差异较大 , 如 Budak等 [ 4]对野牛草
的研究中多态性比例为 95%, Feriol等 [ 3]对西葫芦和笋
瓜的研究中为 72.7%, 而本研究中仅为 28.3%。这可
能与所研究的谷子与青狗尾草亲缘关系比较近有关。
根据 24对引物组合扩增的 127个多态性条带对
24个谷子和青狗尾草材料进行分析 , 结果显示 , 在第一
类群中 , 各材料的遗传相似性系数为 0.56 ～ 0.80, 其遗
传相似性系数趋势比较平缓;而在第二类群中 , 各材料
的遗传相似性系数为 0.64 ～ 0.90, 其遗传相似性系数比
狗尾草相似性系数高 , 且各材料间遗传相似性系数变异
比较大 , 这可能与谷子和青狗尾草的遗传背景有关。而
谷子在长期的自然演化和人工选择下 , 为适应在环境各
异的条件下生存 , 致使其材料间具有较大的差异 , 又因
谷子的总体育种方向是适宜于不同生态学环境人类的生
产操作 , 使得其遗传相似性系数又比较高。
本研究首次在谷子及其近缘野生种青狗尾草中运用
SRAP技术 , 结果表明 , SRAP技术能够有效地对狗尾草
属进行多态性分析。 SRAP技术是一种经济 、 有效和可
靠的分子标记技术 , 可作为谷子分子水平研究的又一有
力研究途径。
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