全 文 :第 36 卷 第 5 期
2014 年 9 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol. 36,No. 5
Sep.,2014
DOI:10. 13332 / j. cnki. jbfu. 2014. 05. 022
非洲桃花心木不同地理群体遗传多样性分析
李义良1 赵奋成1 胡燕菲2 蔡 坚1 吴惠姗1 张应中1 郭文冰1
(1 广东省林业科学研究院林业研究所 2 广东药学院生命科学与生物制药学院)
摘要:应用 SRAP分子标记技术,对来自非洲的 5 个不同地理群体非洲桃花心木的遗传多样性和遗传分化进行了分
析。结果表明:筛选出 28 对 SRAP引物组合用于群体遗传分析,共扩增出条带 77 条,其中多态性条带 59 条,多态
性水平为 76. 62%;5 个群体遗传距离在 0. 036 1 ~ 0. 131 7 之间,总的 Nei’s 基因多样性指数为 0. 209 3,总的
Shannon’s信息指数分别为 0. 330 0,遗传变异主要来自群体内个体间(70. 04%),群体基因流(Nm)为 1. 185 8。
关键词:非洲桃花心木;群体;遗传多样性;SRAP标记
中图分类号:S718. 46 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2014)05--0082--05
LI Yi-liang1;ZHAO Fen-cheng1;HU Yan-fei2;CAI Jian1;WU Hui-shan1;ZHANG Ying-zhong1;GUO
Wen-bing1 . Analysis of genetic diversity from different geographical populations in Khaya
senegalensis. Journal of Beijing Forestry University(2014)36(5)82--86[Ch,26 ref.]
1 Institute of Forestry,Guangdong Academy of Forestry,Guangzhou,510520,P. R. China;
2 College of Life Science and Bio-pharmaceutical,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,
510006,P. R. China.
The genetic diversity and differentiations among five geographic populations of Khaya senegalensis
were analyzed using sequence-related amplified polymorphism (SRAP )markers in this study. 28
primers were chosen from 200 for SRAP polymorphic analysis. The results showed that 59 bands were
polymorphic,making up 76. 62% of the total 77 amplified bands. The genetic distance among different
K. senegalensis populations was 0. 036 1 - 0. 131 7. The general Neis genetic diversity index was
0. 209 3. The general Shannons information index was 0. 330 0. Genetic variation was mainly from
individuals within groups (70. 04%),and the gene flow between populations (Nm)was 1. 185 8.
Key words Khaya senegalensis;populations;genetic diversity;SRAP marker
收稿日期:2013--07--17 修回日期:2013--10--31
基金项目:“948”国家林业局引进项目(2005--4--36)、广东省农业攻关项目(2008B02030007)。
第一作者:李义良,博士,高级工程师。主要研究方向:林木遗传育种。Email :yiliangli@ sinogaf. cn 地址:510520 广州市天河区广汕一路
233 号广东省林业科学研究院林业研究所。
责任作者:赵奋成,研究员。主要研究方向:林木遗传改良。Email :zhaofc@ sinogaf. cn 地址:同上。
本刊网址:http:journal. bjfu. edu. cn
非洲桃花心木(Khaya senegalensis) ,属楝科
(Meliaceae) ,又名塞楝,常绿乔木,间有干旱季节短
期落叶现象。非洲桃花心木具有生长快、材质好等
特点,是世界公认的高价值的优良用材和胶合板材
树种。非洲桃花心木从非洲西部的塞内加尔到非洲
东部的苏丹和乌干达超过 19 个国家均有天然分布,
在分布区内用途多样,主要有原木、燃料、饲料、药品
等。由于非洲桃花心木分布地域广、气候复杂、海拔
差异大、土壤地形多样等因素导致其出现不同的生
态型,同时可能存在一定的分化。另外由于非洲桃
花心木具有可观的经济价值,天然林早期因受到了
严重的破坏性采伐,加之天然更新难,目前已成为世
界濒危物种之一。近年来在非洲桃花心木遗传变
异[1]、遗传多样性[2]、分子生态[3]等方面已开展了
相关研究,但报道还较少;因此,开展非洲桃花心木
遗传多样性、遗传分化研究将为其种源保护、引种策
略、遗传改良提供理论基础。
Li等[4]开发获得相关序列扩增多态性(SRAP)
标记以来,SRAP 标记技术因其操作简便、共显性
高、多态性高、易于分离条带及测序等优点,已应用
第 5 期 李义良等:非洲桃花心木不同地理群体遗传多样性分析
于很多物种的遗传图谱构建[5]、亲缘关系[6]、基因
定位[7]、基因克隆[8] 等方面,特别是在西葫芦
(Cucurbita pepo)[9]、甘薯(Ipomoea batatas)[10]、烟草
(Nicotiana tabacum)[11]、红松(Pinus koraiensis)[12]、
玫瑰(Rosa rugosa)[13]、胡椒(Piper sp.)[14]、割手密
(Saccharum spontaneum )[15]等植物遗传多样性和遗
传结构方面得到了广泛应用。
我国 20 世纪 60 年代引种的非洲桃花心木在海
南和广东湛江生长表现较好,但是依然存在育种材
料有限、来源不清等问题,限制了非洲桃花心木良种
选育研究。为了更好地开展非洲桃花心木良种选育
研究,进一步提高木材质量,满足生产需要,广东省
林业科学研究院于 2005 年起先后从非洲 6 个国家
引进 30 个种源,分别来自尼日尔、贝宁、马里、塞内
加尔、布基纳法索、加纳,并在广东省的阳江、肇庆、
广州、汕尾等地建立了种源试验林。赵奋成等[16]研
究表明,在广州北部山区来自布基纳法索南部的非
洲桃花心木种源生长优势较突出。
本研究以来自非洲 5 个地理群体非洲桃花心木
为材料,利用 SRAP 分子标记技术对其遗传多样性
和遗传结构进行探讨,以揭示非洲不同地域的非洲
桃花心木群体的遗传分化水平和基因交流程度,为
非洲桃花心木种质资源的保存、引种及遗传改良提
供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料的采集与 DNA提取
从非洲 5 个国家 29 个地点收集非洲桃花心木
基因资源(表 1) ,通过种子育苗后在肇庆大南山林
场建立非洲桃花心木试验林。按收集地点不同,每
个地点随机取 15 株,采集当年生嫩叶 0. 2 g 用
CTAB法提取总 DNA(天根植物 DNA提取试剂盒),
等量 DNA混合进行遗传分析,- 20 ℃保存备用。
1. 2 SRAP扩增及引物筛选
以随机抽取 6 个非洲桃花心木无性系 DNA 为
模板对 Li等[4]发表的引物序列进行筛选。PCR 反
应经过比较和优化确定的反应体系:总体积 25 μL,
其中 10 × Taq酶缓冲液,DNA 50 ng,dNTP 0. 5 mmol
L,引物 10 μmolL,DNA 聚合酶 1. 5 U。反应程序
为:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 50 s,35 ℃退火
50 s,72 ℃延伸 1 min,5 个循环;94 ℃变性 50 s,55
℃退火 50 s,72 ℃延伸 1 min,25 个循环;循环结束
后 72 ℃延伸 10 min,4 ℃保存,不同的引物组合退
火温度不同。扩增产物变性后经 3. 0%琼脂糖凝
胶电泳分离,利用紫外分析成像系统拍照记录
结果。
表 1 非洲桃花心木群体
Tab. 1 K. senegalensis populations in the study
群体 地点 纬度 经度
Park of Niger 1 12°14 14″N 02°2948″E
Park of Niger 2 12°14 13″N 02°2949″E
尼日尔 NG Park of Niger 3 12°14 18″N 02°2904″E
Park of Niger 7 12°1402″N 02°2841″E
Tamou 1 12°2719″N 02°0619″W
Kolokani 13°2046″N 08°0158″W
Kita 13°0400″N 09°2800″W
Koulikoro 15°2200″N 06°3300″W
Sagabari 12°3514″N 09°4810″W
Toukoto 12°3649″N 09°4548″W
马里 ML Faya 12°4000″N 07° 3500″W
Farako 10°5000″N 06°51 00″W
Fangalakouta 12°3924″N 10°0100″W
Filanila 13°0654″N 09°5350″W
Nantela 13°1200″N 10°2800″W
Banamba 13°3300″N 07°27 00″W
Park of Benin 4 12°1412″N 02°2945″E
贝宁 BN
Park of Benin 5 12°1413″N 02°2941″E
Park of Benin 6 12°1358″N 02°2833″E
Park of Benin 8 12°1358″N 02°2921″E
Sokone 13°2548″N 15°2700″W
塞内加尔
Tobor 12°1821″N 16°1616″W
SG
Tambacounda 13°4710″N 13°3950″W
Bambey 14°2512″N 16°1648″W
Dianamalazy 12°5041″N 15°1339″W
Guenon 10° 5754″N 00° 5404″W
布基纳法索 Kokologho 12° 1159″N 01° 5102″W
BF Arbolé 12° 4949″N 02° 0109″W
Koyinga 12° 0939″N 01° 5227″E
1. 3 SRAP标记数据分析
凝胶电泳结束后,统计带型在相同片段位置上
的谱带,按 DNA条带的有无进行记录,有带为 1,无
带为 0,获得 ISSR 数据矩阵。用得到的 ISSR 数据
矩阵,利用 POPGENE 软件[17]分析群体遗传多样性
及遗传结构。应用 WINAMOVA1. 55 分析软件[18]进
行分子方差分析,计算群体间和群体内的方差分量
并进行显著性检验,验证衡量群体间和群体内遗传
变异水平。应用 NTsys2. 01 软件[19]进行聚类分析。
2 结果与分析
2. 1 遗传多样性分析
采用 28 对 SRAP 引物(序列见表 2)对 5 个群
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北 京 林 业 大 学 学 报 第 36 卷
体 29 个地点 DNA混合样品进行 PCR 扩增,并对扩
增结果进行统计分析。结果表明,共扩增出 77 个条
带,平均每对 SRAP 引物可扩增出清晰可见的条带
2. 75 条,其中具有多态性的条带 59 条,多态性水平
为 76. 62%。
表 2 SRAP引物及序列
Tab. 2 Primer sequences used for SRAP analysis
引物 类型 引物序列(5 - 3) 引物 类型 引物序列(5 - 3)
ME2
ME3
ME6
ME11
ME12
ME13
ME15
ME16
ME17
ME18
ME19
ME20
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
Forward
TGAGTCCAAACCGGAGC
TGAGTCCAAACCGGAAT
TGAGTCCAAACCGGTAA
TGAGTCCAAACCGGAAG
TGAGTCCAAACCGGTAG
TGAGTCCAAACCGGTTG
TGAGTCCAAACCGGTCA
TGAGTCCAAACCGGGAC
TGAGTCCAAACCGGGTA
TGAGTCCAAACCGGGGT
TGAGTCCAAACCGGCAG
TGAGTCCAAACCGGCAT
EM1
EM2
EM3
EM4
EM5
EM6
EM7
EM8
EM10
EM11
EM13
EM14
EM15
EM17
EM18
EM19
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
Reverse
GACTGCGACGAATTAAT
GACTGCGACGAATTTGC
GACTGCGACGAATTGAC
GACTGCGACGAATTTGA
GACTGCGACGAATTAAC
GACTGCGACGAATTGCA
GACTGCGACGAATTCAA
GACTGCGACGAATTAGC
GACTGCGACGAATTTAG
GACTGCGACGAATTTCG
GACTGCGACGAATTGGT
GACTGCGACGAATTCAG
GACTGCGACGAATTCTG
GACTGCGACGAATTCCA
GACTGCGACGAATTTCC
GACTGCGTACGAATTGTC
从表 3 可以看出,非洲桃花心木各地理群体多
态性位点百分率在 20. 78% ~ 53. 25%之间,均低于
总群体的多态性位点百分率。多态性位点与多态性
位点百分率成正比,多态性位点数最多(41 个)的尼
日尔群体同样具有最高多态性位点百分率
(53. 25%),属于高度多态群体;布基纳法索群体多
态性位点数最少(16 个) ,相对应其多态性位点百分
率也最低(20. 78%) ,属于低度多态群体;马里群
体、塞内加尔群体、贝宁群体为中度多态群体。各群
体的 Shannon 信息指数在 0. 131 4 ~ 0. 321 4 之间,
Nei’s 基因多样性指数在 0. 091 6 ~ 0. 222 6 之间。
Nei’s基因多样性指数与 Shannon 信息指数的结果
一致,均以尼日尔群体最高,布基纳法索群体最低。
表 3 非洲桃花心木不同地理群体遗传变异
Tab. 3 Genetic variation statistics among geographical
populations of K. senegalensis in Africa
群体
多态位
点数
多态性位点
百分率%
Nei’s基因
多样性指数
Shannon信息
指数
NG 41 53. 25 0. 222 6 0. 321 4
BN 20 25. 97 0. 091 7 0. 137 7
ML 38 49. 35 0. 188 9 0. 277 9
SG 24 31. 17 0. 126 8 0. 186 3
BF 16 20. 78 0. 091 6 0. 131 4
总群体 59 76. 62 0. 209 3 0. 330 0
在总体水平上,Nei’s 基因多样性指数为 0. 209 3,
Shannon信息指数为 0. 330 0,多态性位点百分率为
76. 62%。在群体水平上,各群体的遗传多样性水平
存在较大差异。
2. 2 亲缘关系与遗传分化分析
基于 Nei’s遗传距离对 5 个地理群体分析结果
表明,群体间的遗传距离在 0. 036 1 ~ 0. 131 7 之间,
遗传距离相对较小,说明 5 个群体间的亲缘关系较
近。其中群体间遗传距离最小(0. 036 1)的是马里
群体与塞内加尔群体,遗传距离最大(0. 131 7)是尼
日尔群体与布基纳法索群体。根据各个群体间的遗
传距离,计算平均遗传距离为 0. 072 5。另外群体间
遗传相似度在 0. 876 6 ~ 0. 964 6 之间,与遗传距离
相反,最小(0. 876 6)的是尼日尔群体和布基纳法索
群体,最大(0. 964 6)的是马里群体和塞内加尔群体
(表 4)。
遗传分化结果表明,5 个非洲桃花心木地理群
体的平均遗传分化系数(Gst)为 0. 299 6,即群体间
的遗传变异占总遗传变异的 29. 96%,群体内的遗
传变异占总遗传变异的 70. 04%。分子方差分析
(AMOVA)结果同样证实绝大部分的遗传变异存在
于群体内(90. 08%),群体间的基因流(Nm)为
1. 185 8。表明群体间遗传分化较小,遗传变异以群
体内个体变异为主。
48
第 5 期 李义良等:非洲桃花心木不同地理群体遗传多样性分析
表 4 非洲桃花心木 5 个群体的遗传相似度(对角线上)
和遗传距离(对角线下)
Tab. 4 Nei’s genetic identity and distance (above and
below the diagonal,respectively)among five populations
of K. senegalensis
群体 NG BN ML SG BF
NG 0. 926 3 0. 950 9 0. 921 0 0. 876 6
BN 0. 076 5 0. 948 7 0. 936 1 0. 905 5
ML 0. 050 4 0. 052 7 0. 964 6 0. 927 7
SG 0. 082 3 0. 066 0 0. 036 1 0. 926 4
BF 0. 131 7 0. 099 2 0. 075 1 0. 076 5
2. 3 聚类分析
根据各群体之间的遗传距离,利用 NTsys2. 01
软件绘制了 5 个非洲桃花心木群体的遗传关系聚类
图(图 1)。由图 1中可以看出,在遗传距离为 0. 263 0
水平上将 5 个群体分为 3 类:马里群体、塞内加尔群
体、贝宁群体为第Ⅰ类;第Ⅱ类为尼日尔群体;第Ⅲ
类为布基纳法索群体。聚类结果与地理分布一致
性不明显,进一步表明较高基因流防止不同地理
群体的遗传分化,遗传变异主要以群体内个体变
异为主。
图 1 非洲桃花心木 5 个群体基于 Nei’s遗传距离的
UPGMA聚类图
Fig. 1 UPGMA dendrogram for 5 populations of K. senegalensis
in Africa based on Nei’s genetic distance
3 结论与讨论
3. 1 遗传多样性
物种遗传多样性越高,对环境变化的适应能力
就越强,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。
本研究中 5 个非洲桃花心木总群体的 Nei’s基因多
样性为 0. 209 3,Shannon 信息指数为 0. 330 0,多态
位点百分率为 76. 62%。对各群体而言,5 个群体的
3 项参数水平只有尼日尔群体在 Nei’s 基因多样性
(0. 222 6)参数上高于总群体,其他 4 个群体均低于
总群体;群体间存在较大差异,其中马里群体(分别
为 0. 188 9、0. 277 9、49. 35%)和塞内加尔群体(分
别为 0. 126 8、0. 186 3、31. 17%)处于中间水平,布
基纳法索群体(分别为 0. 091 6、0. 131 4、20. 78%)
和贝宁群体(分别为 0. 091 7、0. 137 7、25. 97%)相
对其他群体较低。Karan[1]等利用 SSR标记对 73 个
非洲桃花心木的遗传多样性和遗传结构进行分析,
结果表明,来自非洲西部的种源遗传多样性高,我们
的研究结果也存在同样规律。另外研究表明,群体
样本数量和遗传多样性水平间存在明显的相关
性[20],且分布范围广泛的物种具有更高的遗传多样
性[21],因此本研究中布基纳法索群体和贝宁群体取
样数目较少(每个群体 4 份材料) ,表现出较低的多
样性。今后在引进非洲桃花心木时应加大材料的收
集范围和样本数量,以保障非洲桃花心木的遗传多
样性水平。
3. 2 遗传分化
基因分化系数和遗传距离均表示不同种群间遗
传差异的程度[22],基因流则表示不同种群间由个体
的迁移所产生的基因流动,它会增加种群内部的遗
传变化[23]。Wright[24]指出,如果群体间基因流指数
Nm > 1,基因流能有效防止不同地区群体间遗传分
化的产生;反之,群体可能走向遗传分化。Thorp[25]
认为同一物种不同群体遗传距离的变化范围为
0. 03 ~ 0. 20(遗传相似系数为 0. 80 ~ 0. 97) ,本研究
中 5 个群体的遗传距离相对较小,为 0. 036 1 ~
0. 131 7(遗传相似系数在 0. 876 6 ~ 0. 964 6),仍视
为一个物种,可能与群体基因流(Nm = 1. 185 8)相
对较高有关。群体遗传分化结果表明,非洲桃花心
木群体间的基因分化系数(Gst)为 0. 299 6,表明其
中有 29. 96%遗传变异来自于群体间,而 70. 04%的
遗传变异都来自于群体内的个体间,AMOVA 分析
同样 证 实 绝 大 部 分 的 遗 传 存 在 于 群 体 内
(90. 08%),表明群体内个体选优具有较大潜力。
3. 3 遗传关系
从 5 个群体的聚类结果来看,非洲桃花心木群
体虽然呈现出一定的地理分布规律,即地理来源相
近的群体优先聚在一起,如马里群体和塞内加尔群
体首先聚在一起,但是其他群体并不存在这种规律。
原因可能有以下几个方面:1)非洲桃花心木天然分
布区大约在北纬 8° ~ 15°(延伸到包括 6°的尼日利
亚),构成一条横贯西非至东非几乎与赤道平行的
长形带状,分布区海拔在 0 ~ 1 800 m,年降雨量 700 ~
1 750 mm,干旱季节 2 ~ 8 个月[26],地理分布范围
广、气候复杂、海拔差异大、土壤地形多样等因素可
能导致不同生态小种或类型的形成;2)天然分布区
不同国家引种国间由于基因保存或栽培需要使基
因资源得到交流;3)采集样品分布范围相对较小,
数量有限;4)与引物数量少或种源间亲缘关系较近
58
北 京 林 业 大 学 学 报 第 36 卷
有关;5)物种进化过程中发生了基因突变,且突变
个体适应性强,基因得以保存。这些因素都可能是
导致聚类发生变化的原因。
非洲桃花心木天然分布于非洲热带地区,是世
界珍贵用材树种之一。本文对非洲桃花心木群体遗
传多样性进行了初步分析,发现群体间具有较为丰
富的遗传多样性,并初步确认 5 个地理群体间存在
较近的亲缘关系。在开展非洲桃花心木种质收集时
应加大样品采集范围、样本数量,并考虑当地的气
候、海拨、地形等因素的影响。
参 考 文 献
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( 责任编辑 董晓燕 赵 勃)
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