全 文 ：段 青，吴丽芳，李金泽，等． 洋桔梗花药培养的影响因素［J］． 江苏农业科学，2013，41(9) :28 － 31．
洋桔梗花药培养的影响因素
段 青，吴丽芳，李金泽，杨春梅，崔光芬，赵培飞，王祥宁
(云南省农业科学院花卉研究所 /云南省花卉育种重点实验室 /云南省花卉工程技术研究中心，云南昆明 650205)
摘要:以洋桔梗 48 个品种为材料，探讨低温预处理、基因型、培养基等因素对洋桔梗花药培养的影响。结果表明:
低温预处理能明显提高洋桔梗愈伤组织的诱导率，在 4 ℃条件下最佳处理时间是 48 h;洋桔梗花药培养胚状体的诱导
率与供体植株的基因型有很大的关系，供体基因型不同，胚状体诱导率差异较大;诱导洋桔梗花药产生愈伤组织的最
佳培养基为 MS + 2，4 － D 2． 0 mg /L + KT 1． 0 mg /L + NAA 0． 2 mg /L + 6 － BA 1． 0 mg /L;不同分化培养基对洋桔梗花药
愈伤组织分化率的影响效果不同，最佳分化培养基为 MS + 2，4 － D 1． 50 mg /L + KT 1． 0 mg /L + 6 － BA 1． 0 mg /L +
NAA 0． 2 mg /L，分化率达 15． 6%。
关键词:洋桔梗;花药培养;影响因素
中图分类号:S681． 904 + ． 3 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)09 － 0028 － 04
收稿日期:2013 － 03 － 18
基金项目:云南省花卉育种重点实验室开放基金(编号:FKL －
201002)。
作者简介:段 青(1984—) ，女，云南景谷人，硕士，研究实习员，主要
从事花卉育种研究。E － mail:duanqing123@ 126． com。
通信作者:吴丽芳，硕士，研究员，主要从事花卉新品种培育及产业化
开发应用研究。E － mail:wlf6601@ 163． com。
洋桔梗(Eustoma russellianum)别称丽钵花、土耳其桔德
州蓝铃，为龙胆科宿根草本花卉，原产于美国南部至墨西哥之
间的石灰岩地带。由于洋桔梗的花形别致，花色清新娇媚，颇
具现代感，能配合逐渐洋化的起居环境而大受人们喜爱，其销
售需求量在日本、欧洲、美国和我国台湾等地急速上升，是目
前国际上十分流行的盆花和切花种类之一［1］，已成为荷兰鲜
花拍卖市场十大切花之一［2］。截至 2012 年，我国洋桔梗切花
种植面积已达 266． 7 hm2，国内各地的鲜切花种植户对这个
发展迅猛的新品种表现出浓厚的兴趣，已初步形成产业规模，
但国内生产的洋桔梗近 60%的苗依然依靠进口，缺乏具有自
主知识产权的品种和技术壁垒已经成为制约洋桔梗切花大规
模推广的首要难题［3］。只有积极开展洋桔梗育种研究，拥有
自主知识产权品种，才能让洋桔梗产业具有更大的发展空间。
洋桔梗的相关研究以栽培、组织快繁、保鲜与遗传转化等
报道居多，涉及到花药培养的研究［4 － 5］较少。作为人工诱导
单倍体的有效技术，花药离体培养是生物技术在农作物育种
中应用最广泛、最有成效的方法之一，在快速获得纯合体、高
效利用种质资源和提高选育效率中有一定的理论和应用价
值［6］。本研究以 48 个洋桔梗品种为材料进行花药培养，探讨
各因素对洋桔梗花药培养的影响，为洋桔梗单倍体育种提供
理论和实践基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
本研究所用的 48 个不同的洋桔梗品种均采自云南省通
海县，均由云南省农业科学院花卉研究所李金泽老师提供，其
生性特征见表 1。
1． 2 试验方法
于 2011 年 11 月至 2012 年 3 月期间采摘花萼与花冠等
长或花冠稍长于花萼的新鲜花蕾(此时花蕾的小孢子大部分
处于单核靠边期) ，用自封袋装好，装入冰盒，带回实验室，于
冰箱 4 ℃下低温预处理。自来水冲洗花蕾 5 ～ 10 min，在超净
工作台上先用 75%乙醇擦拭花蕾表面，然后用 0． 1% HgCl2
消毒 8 ～ 10 min，再用无菌水冲洗 3 次，用无菌滤纸吸干花蕾
表面水分，剥开花蕾，取出花药，去除花丝，接种到愈伤组织诱
导培养基上，每个培养瓶接种 10 枚花药。在 25 ℃条件下进
行暗培养，将产生愈伤组织和胚状体的花药转入分化培养基
中，在光照为 1 500 lx、温度为 25 ℃的条件下继续培养，直至
分化成苗。
1． 2． 1 花药的采集与低温预处理 于 2011 年 11 月至 2012
年 3 月期间采摘花萼与花冠等长或花冠稍长于花萼的新鲜花
蕾(此时花蕾的小孢子大部分处于单核靠边期) ，用自封袋装
好，装入冰盒，带回实验室，放入 4 ℃冰箱中分别低温处理 0、
24、48、72 h。选 1 枚花药，经醋酸洋红染色，在显微镜下观察
其发育时期，选择小孢子处于单核靠边期的花药作为培养的
外植体。
1． 2． 2 消毒与接种 用自来水冲洗花蕾 5 ～ 10 min，在超净
工作台上先用 75%乙醇擦拭花蕾表面，然后用 0． 1% HgCl2
消毒 8 ～ 10 min，再用无菌水冲洗 3 次，用无菌滤纸吸干花蕾
表面水分，剥开花蕾，取出花药，去除花丝，接种到愈伤组织诱
导培养基上，每个培养瓶接种 10 枚花药。在 25 ℃条件下进
行暗培养，将产生愈伤组织和胚状体的花药转入分化培养基
中，在光照强度为 1 500 lx、温度为 25 ℃的条件下继续培养，
直至分化成苗。
1． 2． 3 培养基的配制 以 MS 为基本培养基，pH 值 5． 8 ～
6. 0，添加琼脂 6 g /L、蔗糖 30 或 50 g /L(下列培养基中未标明
蔗糖浓度的即为 30 g /L) ，再分别添加不同浓度的激素
2，4 － D、KT、6 － BA 和 NAA，配制不同的愈伤组织诱导和分
化培养基。
1． 2． 3． 1 愈伤组织培养基的配制 设计正交试验L9(3
4) ，
—82— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 9 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.09.125
表 1 48 个花药培养试验材料洋桔梗品种的生性特征
品种 生性特征
代猛绿 中晚生，重瓣，绿色
代猛粉 中晚生，重瓣，粉色
厚紫单 早生，重瓣，深紫色
玛绿紫 中生，重瓣，紫色
玛丽绿 中生，重瓣，绿色
波浪绿色 中生，重瓣，绿色
美国紫色 中晚生，重瓣，紫色
茶色变异 早生，单瓣，茶绿色
圣剑 中生，重瓣，白底紫边
雪莱香槟 中晚生，重瓣，桔黄红
雪莱粉色 中晚生，重瓣，粉色
雪莱白色 中晚生，重瓣，白色
mixⅠ 重瓣
mixC 重瓣
mixD 重瓣
Evd 重瓣
Ｒosita1 晚生，重瓣
Echo 早生，重瓣，蓝色
Wonderrous 早生，单瓣，紫色
Ceremony36 晚生，重瓣，雪白色
Ceremony37 晚生，重瓣，粉色
Cessena39 晚生，重瓣，白色
Cessena40 晚生，重瓣，绿色
Cessena41 晚生，重瓣，蓝色
Avila 早生，重瓣，深玫红
Wonderrous 早生，单瓣，浅棕色
Flamenco 中生，单瓣，紫边
Bolero 早生，重瓣，白底紫边
grandiflorum Sample1 中生，重瓣，白色
ＲUFFLE DBL 2 中生，重瓣，绿色
05 NK － 70 PELLETED(神话) 重瓣，白底粉边
Ｒosita 2(露茜塔 2) 早生，重瓣，玫瑰粉
Ｒosita3(露茜塔 3) 中生，重瓣，白色
Bolero 早生，重瓣，淡紫色
Brealis(极光) 重瓣，白底粉边
grandiflorum Sample2 晚生，重瓣，绿色
Ｒosita 4(露茜塔 4) 重瓣，白色
borealis(极光) 重瓣，杏黄色
grandiflorum Sample3 中生，重瓣，白色
07 － NK － 51(51 号) 晚生，重瓣，白底紫边
Fioretti 早生，单瓣，白底紫边
grandiflorum Sample4 早生，重瓣，绿色
Ceremony02 晚生，重瓣，白色
Ceremony08 晚生，重瓣，彩粉
白金 02 早生，重瓣，白底紫边
Ceremony09 晚生，重瓣，黑心粉色
701 晚生，重瓣，白底紫边
702 晚生，重瓣，白底分辨
各因素及水平具体组合见表 2。
1． 2． 3． 2 不同分化培养基的配制 分化培养基 6 组，分别为
MS +2，4 － D 2． 0 mg /L +蔗糖 50 g /L、MS + KT 2． 0 mg /L +
NAA 0． 2 mg /L、MS + 2，4 － D 2． 0 mg /L + 6 － BA 1． 0 mg /L、
MS +6 － BA 2． 0 mg /L + NAA 0． 2 mg /L、MS + KT 2． 0 mg /L +
6 － BA 1． 0 mg /L、MS + 2，4 － D 1． 50 mg /L + KT 1． 0 mg /L +
表 2 愈伤组织培养基正交试验 L9(34)设计方案
试验号
各因素浓度(mg /L)
A:2，4 － D B:KT C:NAA D:6 － BA
1 0 0 0． 5 1． 0
2 0 1． 0 0 0
3 0 2． 0 0． 2 2． 0
4 1． 0 0 0． 2 0
5 1． 0 1． 0 0． 5 2． 0
6 1． 0 2． 0 0 1． 0
7 2． 0 0 0 2． 0
8 2． 0 1． 0 0． 2 1． 0
9 2． 0 2． 0 0． 5 0
6 － BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 2 mg /L。
1． 2． 4 再生植株的染色体观察 采用根尖染色体计数法［7］，
切取洋桔梗根尖，放入 0． 05% 秋水仙素溶液中预处理
1 ～ 3 h，用流水冲洗，然后用卡诺固定液(V无水乙醇 ∶ V冰醋酸 =
3 ∶ 1，现配制)固定 12 ～ 24 h，用 95%乙醇洗 2 次，转入 70%
乙醇中保存备用。1 mol /L HCl 解离 10 min，流水冲洗并吸
干，于载玻片上捣烂，滴加 1 ～ 2 滴石炭酸品红染色 10 ～
15 min，再在显微镜(Nikon E800 型)下压片镜检，观察染色体
倍数并拍照记录。
2 结果与分析
2． 1 低温预处理对洋桔梗花药诱导率的影响
以 702、玛丽紫、玛丽绿、雪莱粉色、波浪绿色、茶色变异、
Echo、Wonderrous、Ceremony － 36、Bolero 等 10 个品种为材料，
放入 4 ℃冰箱中处理 0、24、48、72 h，然后接种于相同的培养
基中，在相同的培养条件下培养，每瓶接种 8 枚花药，每个处
理 3 个重复，30 d后观察低温预处理对愈伤组织诱导率的影
响，结果见表 3。
从表 3 可以看出，随着低温处理时间的延长，各品种诱导
出的愈伤组织先增多后减少，处理 48 h 时，产生的愈伤组织
最多，而不经低温预处理的愈伤组织最少，说明低温预处理能
明显提高洋桔梗愈伤组织的诱导率;但时间过长或过短，都不
利于愈伤组织的发生。在 4 ℃下，48 h是最佳的处理时间。
2． 2 不同基因型对洋桔梗花药培养的影响
以代猛粉、美国紫色、雪莱香槟等 40 个不同基因型品种
为试验材料，接种于同一培养基上，每个处理接种 2 瓶以上，
每瓶接 6 ～ 8 枚花药，给予相同的培养条件，以研究供体植株
不同基因型的对胚状体诱导率的影响。
从表 4 可以看出，将 40 个不同基因型的洋桔梗花药接种
在同一培养基上，玛丽绿、波浪绿色等 12 个品种产生了胚状
体，诱导率最高的是玛丽绿，为 41． 7%;701 次之，为 37． 5%;
而大部分品种均不能诱导出胚状体。说明洋桔梗花药培养胚
状体的诱导率与供体植株的基因型有很大的关系，供体基因
型不同，胚状体诱导率结果差异较大。
2． 3 不同激素种类及浓度对洋桔梗花药培养的影响
2． 3． 1 对愈伤组织诱导的影响 将材料玛丽绿、波浪绿色、
702、701、代猛粉 5 个品种的花药放入 4 ℃冰箱中低温预处理
48 h，然后分别接种在1 ～ 9号愈伤组织诱导培养基中，每个
—92—江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 9 期
表 3 低温预处理对花药愈伤组织诱导率的影响
低温预处理时间
(h)
愈伤组织的数量(个)
702 玛丽紫 玛丽绿 雪莱粉色 波浪绿色 茶色变异 Echo Wonderrous Ceremony － 36 Bolero
0 8 5 13 4 6 2 0 2 1 0
24 12 10 15 9 9 5 2 6 3 2
48 16 15 18 13 14 8 7 10 6 6
72 14 15 16 12 13 7 5 9 6 3
表 4 不同基因型对胚状体诱导率的影响
基因型
接种
瓶数
花药数
(枚)
出胚数
(个)
诱导率
(%)
05 NK － 70 PELLETED 3 22 1 4． 5
Wonderrous 3 24 0 0
Flamenco 3 24 0 0
Bolero 3 24 0 0
玛丽绿 6 48 20 41． 7
Ceremony37 3 18 0 0
Cessena39 3 24 0 0
Cessena40 3 23 0 0
Cessena41 2 16 0 0
Avila 2 15 0 0
雪莱香槟 3 24 1 4． 2
雪莱粉色 3 22 1 4． 5
雪莱白色 4 26 2 7． 7
代猛绿 4 27 1 3． 7
代猛粉 3 24 1 4． 2
厚紫单 3 24 0 0
玛绿紫 3 24 1 4． 2
波浪绿色 4 32 3 9． 4
美国紫色 4 28 2 7． 1
茶色变异 2 16 0 0
圣剑 2 14 0 0
Ｒosita2 3 22 0 0
Bolero 3 22 0 0
Brealis 3 24 0 0
grandiflorum Sample1 4 28 0 0
grandiflorum Sample2 2 16 0 0
grandiflorum Sample3 3 24 0 0
ＲUFFLE DBL 2 3 23 0 0
Ｒosita3 3 24 0 0
07 － NK － 51 2 15 0 0
ＲOSITA 2 16 0 0
borealis 3 21 0 0
Fioretti 3 24 0 0
Ceremony02 3 23 0 0
grandiflorum Sample4 2 14 0 0
白金 02 2 15 0 0
Ceremony08 3 24 0 0
701 4 32 12 37． 5
702 4 28 3 10． 7
Ceremony09 3 24 0 0
品种接种 2 瓶，每瓶接 6 ～ 8 枚花药，每个处理共接种 10 瓶。
培养基中的蔗糖为 30 g /L、琼脂 6 g /L，pH 值为 5． 8 ～ 6． 0。
接种后暗培养 10 d，然后转入温度为 25 ℃、光强 1 000 lx、光
照时间 16 h /d的条件下培养 20 d，统计愈伤组织数量，结果
见表 5。
表 5 不同培养基对洋桔梗花药诱导愈伤组织效果的影响
试验
号
各因素浓度(mg /L)
A:
2，4 － D
B:
KT
C:
NAA
D:
6 － BA
接种花
药数
(枚)
愈伤
组织数
(个)
诱导率
(%)
1 0 0 0． 5 1． 0 80 9 11． 3
2 0 1． 0 0 0 73 21 28． 8
3 0 2． 0 0． 2 2． 0 78 20 29． 5
4 1． 0 0 0． 2 0 78 26 33． 3
5 1． 0 1 0． 5 2． 0 66 24 36． 4
6 1． 0 2． 0 0 1． 0 79 35 44． 3
7 2． 0 0 0 2． 0 80 22 25． 0
8 2 1． 0 0． 2 1． 0 80 53 66． 3
9 2 2． 0 0． 5 0 70 41 58． 6
k1 23． 2 23． 2 32． 7 40． 2
k2 38． 0 43． 8 43． 0 40． 6
k3 50． 0 44． 1 35． 4 30． 3
Ｒ 26． 8 20． 9 10． 3 10． 3
将 5 个品种接种于 9 组培养基上都能诱导出愈伤组织。
在花药接种 4 ～ 5 d后，部分花药由绿色、淡绿色变为黄褐色、
褐色，8 ～ 12 d后花药逐渐开裂，并从裂口处长出愈伤组织，愈
伤组织的生长在 15 ～ 30 d时为高峰期。
由表 5 可见，由洋桔梗花药诱导愈伤组织时，诱导率最高
的是处理 8，即 MS +2，4 － D 2． 0 mg /L + KT 1． 0 mg /L + NAA
0． 2 mg /L + 6 － BA 1． 0 mg /L，诱导率高达 66． 3%;最低的是
处理 1，即 MS +6 － BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L，诱导率仅
为 11． 3%。由极差分析结果得出，洋桔梗花药诱导愈伤组织
的极差大小顺序为 ＲA ＞ ＲB ＞ ＲC = ＲD，可见影响洋桔梗花药
诱导愈伤组织的因素从大到小的顺序是 A ＞ B ＞ C = D，即
2，4 － D因素对本试验的影响最大，KT 次之，NAA 和 6 － BA
最小。其中 A因素的 k3 最大，即 2，4 － D的浓度为 2． 0 mg /L
最好;B因素的 k3 略高于 k2，但相差不大，从成本方面考虑
KT的最佳浓度为 1． 0 mg /L;C 因素的 k2 最大，即 NAA 的浓
度为 0． 2 mg /L 最好;D 因素的 k2 最大，即 6 － BA 的浓度为
1． 0 mg /L最好。由此可以确定诱导洋桔梗花药产生愈伤组
织的最佳培养基，为 MS +2，4 － D 2． 0 mg /L + KT 1. 0 mg /L +
NAA 0． 2 mg /L + 6 － BA 1． 0 mg /L。
2． 3． 2 对愈伤组织分化的影响 上述 5 个品种的愈伤组织
长到 1． 5 ～ 2． 0 cm 时，将愈伤组织转入到不同的分化培养基
中。蔗糖浓度为 30 g /L、琼脂为 6 g /L、pH 值为 5． 8 ～ 6． 0。
放入温度 25 ℃、光照强度 1 000 lx、光照时间 16 h /d 的培养
室培养 30 d，统计愈伤组织分化数量。由表 6 可知，6 种分化
—03— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 9 期
表 6 不同分化培养基对花药愈伤组织分化的影响
分化培养基
愈伤组织
数(个)
分化数
(个)
分化率
(%)
MS +2，4 － D 2． 0 mg /L +蔗糖 50 g /L 45 0 0
MS + KT 2． 0 mg /L + NAA 0． 2 mg /L 45 3 6． 7
MS + 2，4 － D 2． 0 mg /L + 6 － BA 1． 0 mg /L 45 1 2． 2
MS + 6 － BA 2． 0 mg /L + NAA 0． 2 mg /L 45 0 0
MS + KT 2． 0 mg /L + 6 － BA 1． 0 mg /L 45 2 4． 4
MS + 2，4 － D 1． 50 mg /L + KT 1． 0 mg /L + 45 7 15． 6
6 － BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 2 mg /L
培养基中 MS + 2，4 － D 1． 50 mg /L + KT 1． 0 mg /L + 6 － BA
1. 0 mg /L + NAA 0． 2 mg /L 效果最好，分化率达 15． 6%。说
明当 2，4 － D、KT、6 － BA和 NAA 配合使用时，较易诱导愈伤
组织分化。
2． 4 再生植株的获得及倍性鉴定
将长出的白色愈伤组织(图 1 － A)转入分化培养中，部
分愈伤组织开始转绿，有些愈伤组织出现芽的分化(图 1 －
B) ，继而形成再生植株(图 1 － C)。
采用染色体直接计数法对由胚状体获得的 13 株再生植
株进行鉴定，其中2株为单倍体，其染色体为 2n = x = 36条
(图 2 － A) ，由品种波浪绿色和玛丽绿产生;其余 11 株的染色
体数目均为 72 条(图 2 － B) ，为二倍体植株。
3 结论与讨论
Nitsch等首次报道了低温预处理毛叶曼陀罗花序可提高
单倍体植株的诱导频率［8］，在小麦、大麦、玉米和水稻等作物
中也陆续发现了这种效应。本研究结果表明，对洋桔梗花药
进行低温不同时间预处理可提高胚状体诱导率，其中以 4 ℃
下处理 48 h的效果最佳。
基因型是影响花药培养成功的关键因素之一。在相同培
养条件下，不同基因型植株花药对培养的反应不同。李凤云
等研究了 77 份马铃薯亲本材料，结果表明马铃薯对基因型有
很大依赖，不同基因型马铃薯诱导率范围是 0． 16% ～ 9． 5%，
胚状体发生率范围是 0． 31% ～ 15． 63%［9］。本研究结果进一
步表明，不同基因型洋桔梗花药培养力有显著差异。玛丽绿、
波浪绿色等 12 个品种产生了胚状体，诱导率最高的是玛丽
绿，为 41． 7%;701 次之，为 37． 5%;而大部分品种均不能诱
导出胚状体。说明洋桔梗花药培养胚状体的诱导率与供体植
株的基因型有很大的关系。
花药培养时，培养基中加入适当浓度的激素有利于愈伤
组织和胚状体的形成。枸杞花药培养若干影响因子的研究表
明，植物生长调节剂和基本培养基对枸杞花药培养的影响很
大，6 － BA 1． 0 mg /L与 NAA 0． 1 mg /L 组合有利于胚状体的
产生，6 － BA 1． 0 mg /L与 2，4 － D 0． 5 mg /L组合适合于愈伤
组织的诱导［10］。本试验结果表明，在一定浓度范围内添加不
同的激素，其愈伤组织诱导率和分化率均不同，且所有激素的
质量浓度均控制在 2． 0 mg /L范围内。
影响洋桔梗花药培养的因素很多，除了本研究所述的低
温预处理、基因型、激素种类和浓度外，供试材料的生长状况、
环境条件、接种密度等对其都有影响，阐明整个花药培养调控
的机理和条件仍需进一步研究和探索。
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