全 文 ：植 物 学 报 一9 9 2 , 3 3 ( 6 ) : 4 1 7一 4 2 0
沌 tC o B o t a n f二。 5 , n i e o
筱麦花药培养和单倍性悬浮细胞
培养物的建立
孙敬三 路铁刚 M
( 中国科学院 值物研究所 , 北京 10 0 0 4 4) 又D N 理 P l a ” 考
R S 6 n d a h l
I冶二 h n o l o g ) C o r P . , 乙zs A )
摘 要
对花粉处于单核中期的筱麦 ( A , : 。 。 。 da ) 花药进行了离体培养 , 发现外源激素对筱麦
花粉愈伤组织的形成不但没有促进作用 , 反而有明显的抑制作用 。 在不含任何激素只含 1%
活性碳的 M s 培养基上得到了最高的花粉愈伤组织诱导率 ( 1 4 7 % ) 。 但愈伤组织的分化率
极低 ,在 1 26 块愈伤组织中只有 4 块具分化苗的能力 ,其中 3 块分化出绿色植株 , l 块分化出
白色植株 。 对分别来自 3 块愈伤组织的 3 株绿苗进行了根尖染色体检查 , 结果显示 , 3 裸绿
色植株中 2 株为单倍体 ( Z n 0 3二 ~ 2 1) , l 株为二倍体 ( 2n 二 6 : 二 4 2 ) 。 将花粉愈伤组织
置于液体培养基中进行悬浮培养 ,得到了分散好 ,生长快的悬浮细胞墙养物 。 悬浮细胞经 1 年
左右的继代培养仍基本保持着单倍体特性 。
关健词 筱麦 ; 花药培养 ; 单倍体 ;悬浮细胞培养
A N T H E R C U L T U R E O F N A K E D O A T A N D T H E E S T A B L I
·
S H E M E N T O F IT S H A P L O ID S U S P E N S IO N C E L L
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A b s t r a c t
T h i s P a P e r r e P o r t e d t h e P r od u e t i o n o f h a Pl o i d P l a n t s t h r o u g h a
n t h e r e u lt u r e in n a k e d
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( Zn = 3 x = 2 1) a n d on e w a s d i p l o i d ( Zn 一 6 x = 42 ) , T h e e e l l s u s P e n s i o n e u l t u r es w e r e es t a bl i -
s h e d f r om p
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本文于 l , , 0年 , 月收到 , 同年 10 月收到修改稿 。
植 物 学 报 3 3卷
` ta b l ed u ri n go n ey a e ru sb u el u tre s
·
Mo sto fth e e el se xa m i n ed w e e rha P l o id
.
Key w o rd s汉。 e” a n uj a ; An tah reul tu e r; H a p l oi d ; S u s钾n si o n eul u te r
筱麦 , ( A , 。。 。 d。 ) 是我国西北 、 华北和西南高寒地区的重要粮食和饲料作物 , 其
营养价值在各种谷物中名列前茅【, ,。 筱麦品种资源贫乏 , 类型单一 , 通过常规的品种间杂
交 ,难于突破原有性状 , 创造新的类型 。 因此 , 从 70 年代开始 ,很多育种工作者先后开展
了筱麦 (裸燕麦 )和普通燕麦 (皮燕麦 A . 招 lt’ 。 ) 的种间杂交 ,并取得了一定进展 。 然而
筱麦和普通燕麦的远缘杂种后代分离严重 , 稳定很慢 ,特别是带壳性状 , 经多年选育也难
于获得纯合品系 ,影响了筱麦育种的开展。 为了克服这一难题 ,国内有些单位曾尝试进行
筱麦的花药培养 ,希望通过单倍体育种的途径解决这一问题 ,但未得到成功 。 国外曾对普
通燕麦的花药培养进行过研究 , 获得了大量花粉愈伤组织 , 但只分化出一株 单 倍 体 植
株` , ,。 预示着燕麦属植物的花药培养比较困难 , 需要进行更多的研究 。 本文报道筱麦的
花药培养和单倍性悬浮细胞系的建立 。
材 料 和 方 法
试验用筱麦为适应性强 ,经济性状优良的推广农家品种 “ 三分三 ” 。 取种植于温室或
大田的孕穗期的穗子 , 剪去叶片 ,先后用湿纱布 (或湿纸巾 )和塑料薄膜 (或铝铂 )包裹 , 置
于 6一 8℃ 的冰箱中 , 低温处理 9 天。 接种前取发育阶段不同的花药进行涂片镜检 , 以确
定不同发育阶段花粉相应的花药外部形态指标 。这一测试是很必要的 ,因为筱麦为圆锥花
序 ,其穗子的发育以及每个穗枝梗上小穗的发育顺序都是 由上而下 , 而每一小穗中的小花
的发育顺序则与此相反 ,即基部的小花发育最快 ,然后顺序向上 ,顶部小花发育最为迟缓 二
因此同一穗子的各小花的发育很不一致 , 需要找出所要接种花粉发育时期相应的花药形
态指标 , 以保证接种材料的相对一致性 。 剥取花药前用 70 沁 酒精擦拭苞叶叶鞘两遍 , 然
后在无菌条件下选取处于单核中期的花药 , 接种于含有不同种类和不 同浓度的植物激素
的 M S 培养基上 。 接种后的花药置于 25 ℃ 的人工气侯箱中进行黑暗培养 。 用于花粉愈
伤组织继代培养的培养基组成为 M S + 2 m g / L Z , 4一 D 十 3多 蔗糖 , 两周继代培养一次 。
用于植株分化的培养基为 M S 十 0 . l m g / L N A A 十 o . s m g / L B A十 3书 蔗糖 。 将继代培养
3 个月的花粉愈伤组织转人 M S十 2 m g / L Z , 4一 D 十 2 0 m g / L C H (酪阮水解物 )十 3%
蔗糖的液体培养基中进行悬浮培养 , 悬浮物 4一 5 天继代一次 。 再生植株根尖和悬浮细胞
的染 色体计数 , 用本实验室常用的孚尔根核反应 + 醋酸洋红压片法「, ,进行 。
结 果 和 讨 论
筱麦花药接种在洋菜培养基上之后 ,很长时间没有任何反应 ,两个半月之后才发现有 -
愈伤组织从药室中陆续长出 (图版 I , 1 ) , 绝大多数愈伤组织呈细小的颗粒状 , 类似玉米花
药培养中出现的类型 n 愈伤组织 z[] (下称类型 n 愈伤组织 ) ,但比后者更为细小和易于分
散 。 这类愈伤组织转人含有 2 m g / L Z , 4一 D 的 M S 培养基上进行继代培养时 ,生长迅速 ,
大约 1周时间其鲜重就可加倍 。 此外 , 筱麦花粉愈伤组织中还有少量 (约 4界 )类似 玉米
中类型 I 的愈伤组织 z[J ,这种愈伤组织的组织化程度较高 ,质地稍硬 ,不易分散 , 难于继代
。 期 孙敬三等 : 筱麦花药培养和单倍性悬浮细胞培养物的建立
培养 (下称类型 l 愈伤组织 )。 在最初的实验中就已发现 , 筱麦花药在含有植物激素的培
养基上反应极差 ,而在不含激素 、 含有活性碳的培养基上得到了一定的出愈率 ( 7 . 5多) (见
中国植物学会 5 周年年会《学术论文摘要汇编》 4 09 页 , 19 8 8年 ) 。 由此推测 , 外源植物
激素在筱麦花药培养 中可能不是必需的 。 在其后的实验中专门试验了 2 , 4一 D 和活性碳
对筱麦花药形成愈伤组织的影响 ,实验结果列于表 l 。 从表 1可以看出 ,在培养基中添加
2
, 4一 D 对筱麦花粉愈伤组织的形成不但没有任何促进作用 , 反而有明显的抑制作用 , 只
有在无任何激素或加有 2 , 4一 D 同时又加有活性碳的培养基上 ,才有愈伤组织的形成。 显
然在这种加有活性碳的培养基中 ,外源激素已被活性碳所吸附 , 无法对培养的花药发挥作
用 。 活性碳可以有效的吸附培养基中的生长调节物质的现象 , 已被不少组织培养工作者
所注意 `5,6 ,s] 。 最近又对活性碳吸附生长调节物质的能力进行了定量测定 , 证明培养基中
只要加有极少量的活性碳 ,就可以完全吸附常用浓度的外源激素 ,使所加外源激素完全不
起作用 〔’ `。 本实验所揭示的外源激素对筱麦离体花药的这种负效应 , 和其他禾本科 植物
T a b l e 1 E f f e e t o t
2, 4
一
D 和活 性碳 ( A C ) 对筱麦花药形成愈伤组织的影响 *
2
,
4 一 D o n d ` c t i v a : e d c h a r ` o a l ( A C ) i n t h o m e d i u m o n a n t h e
i n i t i a t i o n o f n a k e d o a t
e a l l u a
培 养 基
M e d i u m
( m g / l )
接种花药数
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.
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s P l a n t e d
出愈花药数
N o
.
a n t h e r s e a l l u s i n g
M S
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M S + 2 , 4一 D 0
.
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M S + 2 , 4一 D 0
.
1 + l % A C
M S 十 2 , 4 一 D 0 . 5
M S + 2
, 4 一 D 0 . 5 + [% A C
M S + 2
, 4一 D I
M S + 2
,斗一D I + l% A C
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M S + 2
, 4一 D Z + l% A C
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蔗糖浓 度 4% 。 4% : u e r o s o .
的离体花药对外源激素 ( 2 , 4 一 D )的强烈依赖性 ,形成了鲜明的对照 。 已经证明 , 在水稻 、
小麦 、 大麦 、 黑麦 、小黑麦等禾谷类作物的花药培养中 ,培养基中加有 1一 2 m g / 1 的 2 , 4 -
D , 是诱导离体花药中花粉起动分裂的不可缺少的最重要因素之一 。在玉米花药培养中 ,
多数作者在培养基中同时加有 2 , 4一 D 和活性碳 ,也有的作者在不加任何激素的基本培养
基上得到了花粉愈伤组织 .[ 71 。 很可能玉米花药对外源激素的反应和筱麦花药有某 些相
似之处 ,即玉米花粉雄核发育的启动也不需要外源激素的刺激 ,相反培养基中的外源激素
说不定还有负效应 。 由此可以推测 ,在筱麦 (以及玉米 )的花药 (或花粉 )中 ,内源激素是很
丰富的 ,可以完全满足离体花粉启动分裂的需要 ,如再在培养基中补加外源激素 , 会导致
激素含量过高 ,反而对花粉分裂和愈伤组织的形成造成不 良影响 。
将上述两种类型的愈伤组织 (类型 1 及类型 1 ) , 转移至 M S 十 。 . 1 m g / 1 N A A 十
物 学 报 3 卷
o
.
s m g 八 BA 的分化培养基上进行植株分化 ,只有来源于 含 2 , 4一 D l m g / 1 的培养基 上的
4 块质地较硬 ,组织化程度较高的类型 I 愈伤组织具有分化能力 ,其中 3 块共分化出绿色
植株 12 棵 (图版 I , 2 ) , l 块分化出白化苗 1棵。 对分别来自 3 块愈伤组织的 3 株绿 苗 进
行了根尖染色体计数 ,其中两株为单倍性植株 ( Z n ~ 3 x ~ 2 1) (图版 I , 3) , l 株为二
倍性植株 ( Z n ~ 6 x 一 4 2 ) 。 为了测试类型 1 愈伤组织的分化能力 ,将其转移到含 有各
种激素和附加物的 M S 培养基上诱导根芽分化 ,但始终未获成功 。 这和 iR en s ( 1 9 8 3 )图
在普通燕麦 ( A . sa it 、 ) 花药培养中描述的情况是类似的 , iR en s 曾接 种 了 “ , 。0 多
枚普通燕麦花药 ,其中 2 6 2 7 枚花药产生了愈伤组织 , 但只从其中的 1枚花药产生的愈伤
组织中 , 再生了 1株单倍体和 2 株二倍体 ,其余 2 6 2 6 枚花药产生的愈伤组织没有分化能
力。 令人惊异的是 iR en s 得到的具有分化能力的愈伤组织 , 也是在含 2 , 4一 D 的培 养基
上形成的 。 也许 ,外源激素虽然对花粉分裂有抑制作用 ,但对保持花粉细胞的全能性却是
至关重要的 。 将继代培养 3 个月的类型 1 愈伤组织转至液体培养基中进行振荡培养 ,在
4 周时间内就可建立起分散良好 、 生长迅速的悬浮细胞培养物 (图版 I , 4 、 5) 。 悬浮细胞
经 1年左右继代培养 , 80 多 以上仍保持着单倍体特性 。
参 考 文 献
{; }
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卜学贤 、 陈维伦 , 19 8:8 活性碳对培养基中植物生长调节物质的吸附作用 。 植物生理学报 , 1 4: 40 1一 4。 , 。
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[ 9 ]
图
1
. 离体培养下筱麦花药形成的愈伤组织 。
版 说 明
2
. 由类型 l 愈伤组织分化出的绿色花扮植株 。 3 . 单倍性 花 粉
植株根尖染色体 ( 2n 二 3二 一 2 1 ) 。 4 . 组成悬浮细胞培养物的小细抱团 。 .5 液 ,州兴养基中的悬浮细胞培养物 。
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