全 文 ：第 39卷 第 1期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.39No.1
2011年 1月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Jan.2011
1)国家科技基础条件平台项目(2005DKA21003)。
第一作者简介:牟少华 ,女 , 1976年 6月生 , 国际竹藤网络中心 ,
博士研究生。
通信作者:孙振元 ,男 ,中国林业科学研究院林业研究所 ,研究员。
收稿日期:2010年 5月 12日。
责任编辑:任　俐。
部分鸢尾属植物的 AFLP标记 1)
　　　　　　　　　 牟少华　　　　彭镇华　郄光发　孙振元
(国际竹藤网络中心 ,北京 , 100102)　　　　　(中国林业科学研究院林业研究所)　　
　　摘　要　利用 AFLP技术 ,选择 EcoRI/MesI酶切组合 , 从 48对 EcoRI+3 /MesI+3引物组合中筛选出 6对引物进行选择性扩增 ,检测了鸢尾属植物 26个样品基因组的 DNA多态性 , 共扩增出 536个遗传位点 , 并通过 Jaccard的
方法将电泳谱带矩阵转化为遗传相似性系数矩阵 ,进行了 UPGMA聚类分析。 26个样品的遗传相似性系数(GS)为 0.56 ～ 0.89,表现出丰富的遗传多样性。阈值取 0.624时 , 可以将所有样品分为 6组:第 1组为鸢尾和其变种白
花鸢尾;第 2组为马蔺;第 3组为野鸢尾和小鸢尾;第 4组为长白鸢尾;第 5组为粗根鸢尾;第 6组为其余 18个样
品。大多数同种鸢尾的不同种源首先聚在一起 ,相似性系数较高 ,亲缘关系也较近。
关键词　鸢尾属;AFLP;多样性;亲缘关系
分类号　Q943.2;Q949.71+8.28GeneticDiversityofIrisDeterminedbyAFLPMarkers/MuShaohua(InternationalCenterforBambooandRattan,Beijing100102, P.R.China);PengZhenhua, QieGuangfa, SunZhenyuan(ResearchInstituteofForestry, ChineseAcademyofForestry)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2011, 39(1).-124 ～ 126TheAmplifiedFragmentLengthPolymorphism(AFLP)techniquewasusedtoanalyzegeneticdiversityof26samplesofIriscollectedfromChina.GenomicDNAwasdigestedwithEcoRIandMseIenzymesandamplifiedwith6EcoRI+3 /MesI+3primercombinations.Atotalof536 scorablebandswereproducedbyAFLPanalysis, whichweretranslatedintogeneticsimilaritymatrix.Geneticsimilarity, rangingfrom0.56 to0.89, showedabundantgeneticdiversity.ClusteranalysiswasmadebasedontheUPGMAmethod.Althesampleswereclassifiedintosixgroups.ThefirstgroupconsistedofI.tecto-rumandI.tectorumf.alba, thesecondoneofI.lactea, thethirdoneofI.dichotomaandI.proantha, thefourthoneofI.mandshurica, thefifthoneofI.tigridia, andotherswereclusteredintothesixthgroup.DiferentprovenancesofIrisbelongingtothesamespecieswithhighgeneticsimilaritywerecloselycorrelatedandgatheredtogether.Keywords　Iris;AFLP;Geneticdiversity;Relationships
　　我国具有丰富的鸢尾属植物资源, 是鸢尾属植物的一个分
布中心。鸢尾种类繁多 ,适应性强, 是绿化、美化 、香化城市 , 装
饰花坛 、花径 、花带 、路旁及草坪的优良材料 ,在园林中有多种
应用形式。对于鸢尾属植物的研究主要集中在栽培繁殖 、花粉
学 、细胞学 、同工酶学等方面, 系统位置和亲缘关系的研究起步
较晚。在分子水平上仅对鸢尾、野鸢尾 、蝴蝶花和德国鸢尾等
鸢尾种采用 RAPD标记 [ 1]和叶绿体 rbcL基因序列分析 [ 2]研究
其亲缘关系 ,有关鸢尾属分类群多是通过细胞分类学和酯酶同
工酶学方法进行讨论的 [ 3] 。目前 ,尚未见到任何从分子水平上
对我国鸢尾属植物进行系统位置研究的报道。
AFLP分子标记技术结合了 RFLP和 RAPD技术的特点 ,
既具有 PCR的高效性 、安全性和方便性的特点 , 又具有 RFLP
可靠性好 、重复性高的优点 , 已被广泛应用于植物亲缘关系 、
种质鉴别及遗传多样性研究 [ 4 -9] 。
本研究采用 AFLP分子标记的方法 , 以所收集到的鸢尾
属植物材料为基础 ,研究分析我国鸢尾属植物的遗传多样性 ,
揭示其系统位置和亲缘关系 , 为指导我国鸢尾属植物的种质
创新以及可持续利用提供科学依据。
1　材料与方法
分别对鸢尾属植物 26个群体(表 1)进行叶片采集 ,每个
群体随机选取 20个单株 ,每株取一片幼嫩的完全展开叶 ,每
个叶片取相同质量组成混合样作为一个样品。样品采集后立
即放入液氮灌中冷藏。
接头和引物(表 2)由上海博亚生物技术有限公司(BIO-
ASIA)北京分公司合成;PromegaTagDNApolymerase、Promega
dNTP购于北京华绿渊生物技术公司;MseI、EcoRI和 T4DNA
ligase为 NewEnglandBiolabs公司产品。全部室内试验在国
家林业局林木培育重点实验室(中国林业科学研究院林业研
究所)完成。
表 1　鸢尾属植物的来源和编号
编号 植物名称 材料来源
LbuXBL 西南鸢尾(IrisbuleyanaDykes) 云南省香巴拉庄园民间自然保护区
LbuDQ 西南鸢尾(I.bulleyanaDykes) 云南省迪庆州香格里拉高山植物园
LpsDL 黄菖蒲(I.pseudacorusLinn.) 云南省大理市点苍山
LpsKM 黄菖蒲(I.pseudacorusLinn.) 云南省昆明植物园
LsaKM 溪荪(I.sanguineaDonn) 云南省昆明植物园
LsaTH 溪荪(I.sanguineaDonn) 吉林省通化市郊区
LdeKM 长葶鸢尾(I.delavayiMich.) 云南省昆明植物园
LfoKM 红籽鸢尾(I.foetidissimaL.) 云南省昆明植物园
LuniCC 单花鸢尾(I.unifloraPal.) 吉林省长春市郊区
LunKM 红粒鸢尾(I.ungiucularisPoir.) 云南省昆明植物园
LtyWLHT 北陵鸢尾(I.typhifoliaKitagawa) 内蒙古省乌兰浩特市
LlaHB 马蔺(I.lacteaPall.) 河北省涿洲市
CteBJ 鸢尾(I.tectorumMaxim.) 中国科学院植物研究所
CteKM 鸢尾(I.tectorumMaxim.) 云南省昆明植物园
CteNJ 鸢尾(I.tectorumMaxim.) 江苏省中国科学院植物研究所
CtefNJ 白花鸢尾(I.tectorumf.albaDykes) 江苏省中国科学院植物研究所
CjaKM 蝴蝶花(I.japonicaThunb.) 云南省昆明植物园
CcoKM 扁竹兰(I.confusaSealy) 云南省昆明植物园
CprNJ 小鸢尾(I.proanthaDiels) 江苏省中国科学院植物研究所
PdiBJ 野鸢尾(I.dichotomaPall.) 中国林业科学研究院后山路边及山坡
PdiWLHT 野鸢尾(I.dichotomaPall.) 内蒙古省乌兰浩特市
XhaHEB 喜盐鸢尾(I.halophilaPall.) 黑龙江省哈尔滨市郊
NcoDQ1 高原鸢尾(I.collettiiHook.) 云南省迪庆州香格里拉高山植物园
NcoDQ2 高原鸢尾(I.collettiiHook.) 云南省迪庆州香格里拉高山植物园
ItiWLHT 粗根鸢尾(I.tigridiaBunge) 内蒙古省乌兰浩特市
ImaJT 长白鸢尾(I.mandshuricaMaxim.) 吉林省九台市土价岭
　　DNA提取:总 DNA提取采用 CTAB方法 [ 10] 。 DNA的质
量浓度及质量用琼脂糖凝胶电泳估测和检查 ,最后稀释到 50 ～
DOI :10.13759/j.cnki .dlxb.2011.01.017
100g· mL-1备用。
表 2　接头及引物序列
接头或引物 序　　列
EcoRIAdapter 5 -CTCGTAGACTGCGTACC-3
3 -CTGACGCATGGTTAA-5
MseIAdapter 5 -GACGATGAGTCCTGAG-3
3 -TACTCAGGACTCAT-5
EcoRI-00 5 -GACTGCGTACCAATTC-3
EcoRI-33 5 -GACTGCGTACCAATTCAAG-3
EcoRI-34 5 -GACTGCGTACCAATTCAAT-3
EcoRI-44 5 -GACTGCGTACCAATTCATC-3
EcoRI-60 5 -GACTGCGTACCAATTCCTC-3
EcoRI-63 5 -GACTGCGTACCAATTCGAA-3
EcoRI-65 5 -GACTGCGTACCAATTCGAG-3
MseI-00 5 -GATGAGTCCTGAGTA-3
MseI-31 5 -GATGAGTCCTGAGTAAAAA-3
MseI-33 5 -GATGAGTCCTGAGTAAAAG-3
MseI-34 5 -GATGAGTCCTGAGTAAAAT-3
MseI-44 5 -GATGAGTCCTGAGTAAATC-3
MseI-46 5 -GATGAGTCCTGAGTAAATT-3
MseI-47 5 -GATGAGTCCTGAGTAACAA-3
MseI-60 5 -GATGAGTCCTGAGTAACTC-3
MseI-63 5 -GATGAGTCCTGAGTAAGAA-3
　　AFLP分析:本研究 AFLP分析的基本程序和 Vos等 [ 11]
发明的方法基本相同 ,对体系进行了优化。采用 EcoRI/MseI
酶切组合进行基因组限制性酶切。预扩增反应选用引物组合
EcoRI00/MseI00,选择性扩增反应采用引物组合 EcoRI+3 /MseI+3。 PCR扩增反应在 PCR仪(Biometratgradient)上进行。电泳:选择性扩增产物经变性后在 6%的变性聚丙烯酰
胺序列分析胶上电泳分离 ,条件是 85W, 3 000V, 恒功率电泳
约 90min。电泳后采用 Tixier等 [ 12]描述的银染检测方法进行
AFLP指纹显色反应。
按电泳带的有无构建二进制矩阵 , 通过 Jaccard的方法将
电泳带矩阵转化为遗传相似性系数矩阵。采用 NTSYSpc2.10e
软件计算相似性系数与遗传距离系数 , 用 SAHNClustering进
行不加权成对算术平均法(UPGMA)聚类分析。
2　结果与分析
2.1　AFLP指纹图谱
由于缺乏有关鸢尾的基因组信息资料 , 所以采用了引物
筛选策略。从 48对引物组合中筛选出 22对扩增较好的引
物 , 再进行二次筛选。最后 , 确定 6对扩增整齐的引物组合作
为鸢尾属植物的选择性扩增引物。 6对 AFLP引物在鸢尾属
植物 26个样品基因组中共获得 536条清晰的谱带 ,缺少共有
的谱带和特异性缺失条带。
2.2　遗传多样性参数
根据遗传相似性系数(GS)可以看出 , 鸢尾属植物 26个
样品的 GS为 0.56 ～ 0.89,表现出丰富的遗传多样性。其中 ,
鸢尾(CteBJ和 CteNJ)及其变种白花鸢尾(CtefNJ)与其他鸢
尾遗传差异最大 ,遗传相似系数最低 , 仅为 0.56 ～ 0.70。鸢
尾(CteBJ)和白花鸢尾(CtefNJ)的相似性系数约为 0.70, 它们
与鸢尾(CteNJ)的相似性系数为 0.64, 与其他鸢尾的亲缘关
系较远 ,相似性系数仅为 0.56。大多数不同种源的同种鸢
尾 , 相似性系数较高 , 亲缘关系也较近 , 其中溪荪 LsaKM和
LsaTH亲缘关系最近 , 相似系数最高 ,为 0.89。
2.3　聚类分析
根据聚类分析图(图 1), 当取阈值为 0.624时 , 可将 26
个样品分成 6组 , 第 1组为鸢尾(CteBJ和 CteNJ)和其变种白
花鸢尾(CtefNJ);第 2组为马蔺(LlaHB),与其他鸢尾亲缘关
系较远 ,相似性系数约为 0.57;第 3组为野鸢尾(PdiBJ)和小
鸢尾(CprNJ);第 4组为长白鸢尾(ImaJT);第 5组为粗根鸢
尾(ItiWLHT),与其他鸢尾的相似性系数约为 0.62;第 6组包
括 5个亚属的 18个样品 , 分别为:无附属物亚属的红籽鸢尾
(LfoKM)、北陵鸢尾(LtyWLHT)、单花鸢尾(LuniCC)、红粒鸢
尾(LunKM)、长葶鸢尾 (LdeKM)、西南鸢尾 (LbuXBL和
LbuDQ)、黄菖蒲 (LpsDL和 LpsKM)和 溪荪 (LsaKM和
LsaTH);鸡冠状附 属物亚属的扁竹兰 (CcoKM)、鸢尾
(CteKM)和蝴蝶花(CjaKM);琴瓣鸢尾亚属的喜盐鸢尾(Xha-
HEB);尼泊尔鸢尾亚属的高原鸢尾(NcoDQ1和 NcoDQ2)和
野鸢尾亚属的野鸢尾(PdiWLHT)。
图 1　鸢尾属植物基于SM相似系数的 AFLP谱带 UPGMA聚类图
　　大多数不同种源的同一种鸢尾被首先聚在一起 , 相似性
系数较高 , 亲缘关系也较近 , 如西南鸢尾 (LbuXBL和
LbuDQ)、黄菖蒲(LpsDL和 LpsKM)、溪荪(LsaKM和 LsaTH)、
高原鸢尾 (NcoDQ1 和 NcoDQ2)和鸢尾 (CteBJ、 CtefNJ和
CteNJ)等。但也有个别例外的 , 如鸢尾(CteKM)与北陵鸢尾
(LtyWLHT)聚在一起 , 2 个种源的野鸢尾(PdiBJ和 Pdi-
125第 1期　　　　　　　　　　　　　　　牟少华等:部分鸢尾属植物的 AFLP标记
WLHT)亲缘关系较远 , 被分别聚在两大组中。
3　结论与讨论
在鸢尾属植物 26个样品基因组中 , 6对 AFLP引物分析
结果表明 ,这些鸢尾属植物缺少共有的谱带和特异性缺失条
带 ,具有种的特异性 , 这与谢航 [ 3]对我国鸢尾属植物酯酶同
工酶研究的结果相同。天然群体的遗传变异是基因流和选择
作用的综合结果。同种植物各个群体空间上的隔离 、突变 、环
境因子造成的选择差 、随机遗传漂变 、基因流的隔离等都能导
致群体基因结构的空间异质性 , 从而促进群体分化。
AFLP聚类结果表明 ,鸡冠状附属物分类群被聚在 2个大
组中 ,其中扁竹兰(CcoKM)和蝴蝶花(CjaKM)关系较近 ,聚在
一组内 ,而鸢尾(CteBJ和 CteNJ)和其变种白花鸢尾(CtefNJ)
关系较近 ,聚成一组 , 它们与其他鸢尾属植物关系最远。另
外 ,值得注意的是 , 该分类群的小鸢尾(CprNj)和北京的野鸢
尾(PdiBJ)亲缘关系较近 , 被聚在一起。这些都说明鸡冠状附
属物分类群是一个很不自然的分类群 , 应当对该分类群内的
部分种的分类地位进行调整。
须毛状附属物分类群果实侧裂组(Sect.Hexapogon)中的
粗根鸢尾和长白鸢尾各成一组 , 2种鸢尾亲缘关系较远。从
聚类图上分析来看 ,这 2个种超过同分类群组内之间的关系 ,
主张将其划分到不同的亚组或亚属中。
从聚类树型图上可以看出 , 野鸢尾分类群和尼泊尔鸢尾
分类群作为亚属的分类地位比较合适。
无附属物鸢尾分类群是一个极不自然的类群。该分类群
的马蔺与其他鸢尾关系较远 , 单独成一组。另外 ,红籽鸢尾与
该分类群其他鸢尾关系也较远 ,而其他鸢尾间关系较近 ,尤其
是溪荪和黄菖蒲 2个种的亲缘关系最近 。因此 , 将无附属物
类群分成几个组或亚属 ,从树型图上分析会更合理。
喜盐鸢尾是琴瓣鸢尾分类群仅有的 1个种 , 关于这个种
的分类地位及归属问题一直有争议。聚类图中 , 喜盐鸢尾与
无附属物分类群的一些种类聚成一组。因此 , AFLP标记得出
的结论与形态标记相同 , 即将琴瓣鸢尾分类群置于无附属物
分类群中或者作为一个独立的分类群 , 与无附属物分类群分
成的几个亚属地位并列。
另外 ,本试验 DNA提取采用的是混合样品 ,它可以作为
个体样品的代表 ,对整个居群的遗传多样性进行评价 [ 13] 。故
本研究集中讨论的是各个种群间的遗传变异 ,有关种群内的
变异正在作进一步研究。
参　考　文　献
[ 1] 　黄芸 ,秦民坚 ,杨光,等.RAPD法鉴定射干类中药 [ J] .中草药 ,
2002, 33(10):935-937.
[ 2] 　秦民坚 ,黄芸 ,杨光,等.射干及类似药用植物叶绿体 rbcL基因
序列分析 [ J] .药学学报 , 2003, 38(2):147-152.
[ 3] 　谢航.中国鸢尾有关分类群的讨论及属下分类系统的修订
[ D] .长春:东北师范大学 , 1996, 160.
[ 4] 　王利 ,邢世岩 ,王芳 ,等 ,银杏雌株种质遗传关系的 AFLP分析
[ J] .林业科学 , 2008, 44(4):48 -53.
[ 5] 　王献 ,张启翔,杨秋生 ,等.利用 AFLP技术研究紫薇的亲缘关系
[ J] .北京林业大学学报 , 2005, 27(1):59-63.
[ 6] 　ZhangDonglin, DirrM, PriceRA.Discriminationandgeneticdi-
versityofcephalotaxusaccessionsusingAFLPmarkers[ J] .JAmer
SocHortSci, 2000, 125(4):404-412.[ 7] 　文亚峰 ,谢碧霞 ,何钢 ,等.人心果品种资源亲缘关系的 AFLP分
析 [ J] .林业科学 , 2008, 44(9):59 -64.
[ 8] 　宋红竹 ,张绮纹 ,周春江.杨树部分种的 AFLP遗传多样性分析
[ J] .林业科学 , 2007, 43(12):64-69.
[ 9] 　张克中 , 贾月慧 , 张启翔 , 等.部分中国野生百合亲缘关系的
AFLP技术分析 [ J] .东北林业大学学报 , 2008, 36(2):19-22
[ 10] 　HamiltonAJ, LyettGW, GriersonD.Antisensegenethatinhib-
itssynthesisofthehormoneethyleneintransgenicplants[ J] .Na-
ture, 1990, 346:284-287.
[ 11] 　VosP, HogersR, BleekerM, etal.AFLP:anewtechniquefor
DNAfingerprinting[ J] .NucleicAcidsResearch, 1995, 23(21):
4407-4414.
[ 12] 　TixierMH, SourdileRM, LeroyP, etal.Detectionofwheatmi-
crosatelitesusinganonradioactivesilver-nitratestainingmethod[ J] .JGenetBreed, 1997, 51(2):175 -177.
[ 13] 　钱韦 ,葛颂,洪德元.采用 RAPD和 ISSR标记探讨中国疣粒野
生稻的遗传多样性 [ J] .植物学报 , 2000, 42(7):74l-750.
(上接 109页)和菊酯类农药均产生较为灵敏的响应 , 可作为
一种监测农药污染生物化学标记物加以开发利用 ,而有关农
药对其它重要生物化学标记物的影响有待进一步地研究。
致谢:感谢南开大学生命科学学院王新华教授对摇蚊种
类的鉴定。
参　考　文　献
[ 1] 　周凤保.制定农药工业水污染物排放标准严格控制农药工业污
染:农药水污染物排放标准制定的思路及解析 [ J] .中国农药 ,
2008, 4:4-9.
[ 2] 　McCarthyJF, ShugartLR.Biomarkersofenvironmentalcontami-
nation[ M] .BocaRaton:LewisPublishers, 1990.
[ 3] 　万斌.生态毒理学中生物标志物研究进展 [ J] .国外医学:卫生
学分册 , 2002, 27(2):110-114.
[ 4] 　赵于丁 ,徐敦明 ,范青海 ,等.生物标志物在农药水生态毒理学中应用的进展 [ J] .江苏农业学报 , 2009, 25(1):203-209.
[ 5] 　AdamsSM.Biologicalindicatorsofaquaticecosystemstress[ M] .
Bethesda:AmericanFisheriesSociety, 2002.
[ 6] 　SarkarA, RayD, ShrivastavaAN, etal.Molecularbiomarkers:
theirsignificanceandapplicationinmarinepollutionmonitoring
[ J] .Ecotoxicology, 2006, 15:333-340.
[ 7] 　邓春凯.生物的指示作用与水环境 [ J] .环境保护科学 , 2007, 33
(4):114-117.
[ 8] 　PrintesLB, CalaghanA.Acomparativestudyontherelationship
betweenacetylcholinesteraseactivityandacutetoxicityinDaphnia
magnaexposedtoacetylcholinesteraseinsecticides[ J] .Environ-
mentalToxicologyandChemistry, 2004, 23(5):1241-1247.
[ 9] 　SibleyPK, ChappelMJ, GeorgeTK, etal.Integratingefectsof
stresorsacrosslevelsofbiologicalorganization:examplesusingorgano-phosphorusinsecticidemixturesinfield-levelexposures[ J] .Journalof
AquaticEcosystemStressandRecovery, 2000, 7(2):117-130.
[ 10] 　GuilherminoL, LacerdaMN, NogueiraAJA, etal.Invitroand
invivoinhibitionofDaphniamagnaacetylcholinesterasebysurfac-
tantagents:possibleimplicationsforcontaminationbiomonitoring
[ J] .ScienceoftheTotalEnvironment, 2000, 247:137 -141.
[ 11] 　ForgetJ, BeliaeffB, Bocquené G.Acetylcholinesteraseactivityincopepods(Tigriopusbrevicornis)fromtheVilaineRiverestuary,
France, asabiomarkerofneurotoxiccontaminants[ J] .Aquatic
Toxicology, 2003, 62:195-204.
[ 12] 　KeyPB, FultonMH, Harman-fetchoJA, etal.Acetylcholinest-
eraseactivityingrassshrimpandaqueouspesticidelevelsfrom
SouthFloridadrainagecanals[ J] .ArchivesofEnvironmentalCon-
taminationandToxicology, 2003, 45:371 -377.
[ 13] 　ForcelaM, BerraE, GiacchiniR, etal.Increasedalaninecon-
centrationisassociatedwithexposuretofenitrothionbutnotcarba-
matesinChironomusripariuslarvae[ J] .EcotoxicologyandEnvi-
ronmentalSafety, 2007, 66(3):326 -334.
[ 14] 　GorunV, ProinovI, BaltescuV, etal.ModifiedElmanproce-
dureforasayofcholinesterasesincrudeenzymaticpreparations
[ J] .AnalyticalBiochemistry, 1978, 86(1):324-326.[ 15] 　EllmanGL, CourtneyKD, AndresV, etal.Anewandrapid
colorimetricdeterminationofacetylcholinestereaseactivity[ J] .Bi-
ochemicalPharmacology, 1961, 7:88 -95.
[ 16] 　BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationof
microgramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofproteindye
binding[ J] .AnalyticalBiochemistry, 1976, 72(2):248-254.
[ 17] 　JemecA, DrobneD, Ti lerT, etal.Theapplicabilityofacetyl-
cholinesteraseandglutathioneS-transferaseinDaphniamagnatox-
icitytest[ J] .ComparativeBiochemistryandPhysiology, PartC,
2007, 144:303-309.
[ 18] 　DeCoenW D, JanssenCR.Themissingbiomarkerlink:rela-
tionshipbetweenefectsonthecelularenergyalocationbiomarker
oftoxicantstressedDaphniamagnaandcorespondingpopulation
characteristics[ J] .EnvironmentalToxicologyandChemistry,
2003, 22(7):1632-1641.
126 　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第 39卷