全 文 ：马文晔 ,陈崇顺 ,曹伟杰 ,等.洋桔梗 ISSR最佳反应体系的建立与品种遗传多样性检测 [ J] .江苏农业科学 , 2010(1):43-46.
洋桔梗 ISSR最佳反应体系的建立与
品种遗传多样性检测
马文晔 , 陈崇顺 , 曹伟杰 , 张 娟 , 王转梅 , 岳 敏
(南京师范大学生命科学学院 /江苏省生物多样性与生物技术重点实验室 ,江苏南京 210046)
摘要:利用正交设计 , 对影响洋桔梗 ISSR反应的主要因素进行了优化 , 建立了洋桔梗 ISSR的最佳反应体系。在
25μL的 PCR反应体系中 , 含 2.5 μL10 ×PCRbufer、 1.5 mmol/LMg2 +、 0.3 mmol/LdNTPs、 0.2 μmol/L引物 、
30ng/μL洋桔梗基因组 DNA模板及 2.0 U的 TaqDNA聚合酶。试验结果表明 , 该反应体系具有良好的稳定性和通用
性。 8个不同基因型洋桔梗材料遗传多样性检测结果表明 , 该 ISSR分子标记可有效地检测出其中 4个不同品种之
间 、同一品种F1代及 F2代之间的遗传多样性 , 但未能检测出同 1个品种 F1代 2个株系之间或 2个转基因株系之间的
遗传多样性。
关键词:洋桔梗;ISSR分子标记;最佳反应体系;遗传多样性
中图分类号:S682.1+90.36 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2010)01-0043-04
收稿日期:2009 -05-06
作者简介:马文晔(1986— ),女 ,山西吕梁人 ,硕士研究生 , 主要从事
植物生物技术与分子生物学研究 , E-mail:mwy 1986 0@ 163.
com。
通信作者:陈崇顺 ,博士 ,硕士生导师。 E-mail:chenchongsun@njnu.
edu.cn。
一般观赏植物栽培品种间因亲缘关系较近 ,仅靠花色 、花
形 、叶色 、叶形等常规的形态指标很难加以区分 ,这样既影响
品种的正确识别 ,也给新品种的注册登录和法定保护等带来
困难 。 20世纪 90年代后 , DNA分子标记技术的出现为在分
子水平鉴定花卉品种提供了强有力的工具 [ 1 ] 。
简单序列重复间扩增 (intersimplesequencerepeat,简称
ISSR),是一种较为新型的分子标记方法 。其原理是根据基
因组内广泛存在的微卫星基序设计单一引物 ,在其 3′端或 5′
端锚定几个随机碱基 ,对基因组 DNA进行 PCR扩增 ,扩增的
指纹图谱可以同时提供基因组内多个位点的序列信息 [ 2] 。
它结合了 RAPD标记简单 、快速和 RFLP、SSR标记可靠的优
点 [ 3 ] ,因而被广泛应用于遗传多样性检测 、亲缘关系分析 、品
种鉴定和基因定位等方面的研究 [ 4 -9] 。
洋桔梗(Eustomagrandiflorum),别名草原龙胆 ,是龙胆科
龙胆属的 1、2年生草本观赏植物 。因其株态轻盈 、花形别致 、
花色典雅明快 、颇具现代感 ,能配合现代起居环境而备受人们
喜爱 ,其市场需求在日本 、欧洲 、美国和我国台湾等地急速上
升 ,是目前国际上十分流行的盆花和切花种类之一 [ 10] 。将
RAPD分子标记技术应用于洋桔梗种质鉴定的研究已有报
道 [ 11] ,但迄今还未见有关洋桔梗 ISSR分子标记的研究 。本
研究采用正交试验设计 ,从 Mg2 +、dNTPs、引物 、模板 DNA、
TaqDNA聚合酶等 5个主要因素 4个水平 ,对洋桔梗 ISSR反
应体系进行了优化 ,拟建立适合于洋桔梗 ISSR的最佳反应体
系;并采用该优化体系构建了 8个不同基因型洋桔梗试材的
DNA指纹图谱 ,为洋桔梗种质材料分子鉴定及遗传多样性分
析等深入研究奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
洋桔梗品种 “DoubleMariachiPink”的 F1代种子(购自昆
明缤纷园艺有限公司)萌发幼苗 ,经离体培养 、无性繁殖得到
的 2个 F1代株系;由 F1代自交得到的 F2代种子萌发成的 1
个 F2代株系;以上述 F1代为遗传转化受体的 2个转菜豆几
丁质酶基因株系(笔者所在实验室构建);“ArenaGreen”、
“CeremonySnow”、 “CeremonyLightPink”的 F1代试材(购自
南京花卉市场)。
植物基因组 DNA提取试剂盒 、dNTPs、DNALogicalLad-
der购于北京天根公司;ISSR通用引物由南京生兴生物工程
公司合成;10 ×bufer、MgCl2 、TaqDNA聚合酶均为 Takara公
司产品 ,购于大连宝生物公司 。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA的提取 取洋桔梗幼嫩叶片 ,在液氮中
研成粉末 ,利用植物基因组 DNA提取试剂盒提取高质量的模
板 DNA。将所提模板 DNA稀释后 ,用紫外分光光度计测定
吸光值 D260 nm、D280 nm ,计算 D260 nm/D280 nm比值 ,估算样品的纯
度 ,并结合 0.8%琼脂糖凝胶电泳的结果 ,确定其含量和完整
性 ,然后将其稀释至 20 ng/μL备用 。
1.2.2 ISSR反应体系主要影响因素优化的正交试验设计
经过初步筛选 ,将引物 ISSR-49[ 5′-(TG)8 AC-3′, Tm:
54 ℃]作为正交试验引物 。以 Mg2+、dNTPs、引物、模板和 Taq
DNA聚合酶为 5个试验因素 ,每个因素分设 4个水平(表 1),
采用正交试验设计表 L16 (45)安排试验(表 2)。在每管 ISSR
表 1 洋桔梗ISSR反应体系优化因素与水平
水平 A:Mg2 +(mmol/L)
B:dNTPs
(mmol/L)
C:引物
(μmol/L)
D:模板
(ng/μL)
E:TaqDNA
聚合酶(U)
1 1.0 0.1 0.2 10 0.5
2 1.5 0.2 0.4 30 1.0
3 2.0 0.3 0.6 50 1.5
4 2.5 0.4 0.8 70 2.0
—43—江苏农业科学 2010年第 1期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.01.095
表 2 洋桔梗 ISSR反应体系优化 L16(45)正交试验设计
组合号 A:Mg2 +(mmol/L)
B:dNTPs
(mmol/L)
C:引物
(μmol/L)
D:模板
(ng/μL)
E:TaqDNA
聚合酶(U)
1 1.0 0.1 0.2 10 0.5
2 1.0 0.2 0.4 30 1.0
3 1.0 0.3 0.6 50 1.5
4 1.0 0.4 0.8 70 2.0
5 1.5 0.1 0.6 70 1.0
6 1.5 0.2 0.8 50 0.5
7 1.5 0.3 0.2 30 2.0
8 1.5 0.4 0.4 10 1.5
9 2.0 0.1 0.8 30 1.5
10 2.0 0.2 0.6 10 2.0
11 2.0 0.3 0.4 70 0.5
12 2.0 0.4 0.2 50 1.0
13 2.5 0.1 0.4 50 2.0
14 2.5 0.2 0.2 70 1.5
15 2.5 0.3 0.8 10 1.0
16 2.5 0.4 0.6 30 0.5
反应液中 ,包含 2.5 μL的 10 ×buffer,按表 2所列量加入各成
分后 ,以无菌水补充总体积至 25 μL。每个处理设 2次重复 。
ISSR反应在 PTC-200TM型 PCR仪(美国 MJResearch
公 司)中进行 , 反应程序为 :94℃预变性 5min;94℃变性
1 min、54 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 1.5 min, 35个循环;72 ℃延
伸 6 min。取 6 μL的 PCR产物点入含 0.5 μg/mL溴化乙锭
的 1.0%琼脂糖凝胶加样孔 ,于 0.5 ×TBE电泳缓冲液中 ,设
定 5 V/cm稳压电泳 1 h。置电泳结果于紫外分析仪上观察 ,
并通过 UVP紫外凝胶成像系统采集图像 。
1.2.3 ISSR最佳反应体系稳定性和通用性检验 将前述以
ISSR-49为引物优化得到的 ISSR最佳反应体系 ,应用于根
据不同碱基组成和退火温度选择的 ISSR-12[ 5′-(GAG)6
-3′] 、 ISSR-24 [ 5′-(AC)8TC-3′] 、ISSR-36 [ 5′-
(AG)8TC-3′] 、ISSR-40[ 5′-(ACC)6 -3′] 、ISSR-41[ 5′
-(CTG)6 -3′] 、ISSR-44[ 5′-(AC)8GA-3′] 、 ISSR-49
[ 5′-(TG)8AC-3′]等 7个 ISSR引物 ,以检验该 ISSR优化
反应体系的稳定性和通用性 。
1.2.4 洋桔梗不同品种和株系遗传多样性的 ISSR分子检测
利用本研究建立的洋桔梗 ISSR的最佳反应体系 ,以上述 8
个不同基因型洋桔梗试材的基因组 DNA为模板 ,对 77个 IS-
SR通用引物进行扩增筛选 。从可以扩增出 PCR产物的引物
中 ,再筛选出多态性丰富 、稳定性强 、背景清晰的引物 ,用于受
试基因组 DNA的 ISSR反应 (根据引物的 Tm值确定退火
温度)。
1.2.5 扩增产物和差异条带的统计 (1)带的记录:电泳图
谱的每条带(DNA片段),代表 1个引物的结合位点 。根据各
片段的有无及迁移率 ,统计所有的二元数据 ,有带 (显性 )记
作 “1”,无带(隐性)记为 “ 0”。强带和弱带的赋值均为 “ 1”。
(2)数据的统计方法:利用 PopGen32计算各供试材料间的遗
传距离 ,利用 MEGA3构建聚类关系树 ,分析各供试材料间的
聚类关系 。
2 结果与分析
2.1 ISSR反应体系的正交优化结果
对利用植物基因组 DNA提取试剂盒提取模板 DNA进行
琼脂糖凝胶电泳 ,检测结果显示 , DNA条带较亮 ,谱带整齐 ,
可作为 ISSR扩增反应的模板 DNA。图 1所示为根据表 2安
排的正交试验设计 ISSR反应体系的扩增结果 。从图 1中可
以看出 ,由于 Mg2+、dNTPs、引物 、模板和 TaqDNA聚合酶等 5
个影响因素浓度组合的不同 , 16个处理组合得到不同效果的
扩增 。从 1号到 4号组合 ,条带数量增多 ,清晰程度增强 ,显
示了在 Mg2 +浓度相同的情况下 ,扩增效果随其他 4个组分浓
度提高而增强的变化趋势;但由于 Mg2 +浓度比较低 ,大多数
条带很弱 、不清晰 。第 5 ～ 8号组合 ,背景较为清楚 ,条带较
多;而 1 ～ 4号组合扩增条带相对较少 , 9 ～ 16号组合背景模
糊 ,均出现了非特异性扩增 。该结果表明 , Mg2 +浓度过低或
过高均不利于清晰条带的扩增 。 1、6、11、16号组合条带较
少 ,多态性低 ,可能是由于 TaqDNA聚合酶的浓度过低所致 。
1、5、9、13号组合背景模糊 ,有弥散现象 ,可能与 dNTPs的不
足有关 。
理想组合的扩增产物应谱带清晰 、多态性高及重复性好 。
在图 1中 ,只有第 7号组合谱带多而清晰 ,无弥散和拖尾现
象 。因此 ,确定其为正交优化的最佳体系 ,即在 25 μL反应体
系中 , 含 2.5 μL10 ×PCR buffer、 1.5 mmol/LMg2+、
0.3 mmol/LdNTPs、0.2 μmol/L引物、30 ng/μL洋桔梗基因组
DNA模板及 2.0 UTaqDNA聚合酶 。
2.2 ISSR最佳反应体系的稳定性和通用性
根据不同碱基组成和退火温度 ,选择 7个 ISSR引物来检
验 7号组合体系的稳定性和通用性 ,结果如图 2所示 。从图
2中可以看出 , 7个引物均能扩增出较清晰的条带 。这表明优
—44— 江苏农业科学 2010年第 1期
化的反应体系具有良好的稳定性 ,适用于其他的 ISSR引物 。
2.3 洋桔橘不同品种与株系间基因组遗传多样性的 ISSR分
子检测
利用本研究建立的洋桔梗 ISSR最佳反应体系 ,以上述 8
个不同基因型洋桔梗试材的基因组 DNA为模板 , 对 77个
ISSR通用引物进行扩增筛选 ,从可以扩增出产物的 30个引物
中筛选出 5个多态性丰富、稳定性强 、背景清晰的引物
(ISSR-25、36、39、43、76),再用于 8个试材基因组 DNA的
ISSR反应 。研究结果表明 , 5个引物扩增出的 DNA条带数目
在 6 ～ 12条之间 ,平均 9条;共扩增出 45条 DNA条带 ,其中
多态性条带 21条 ,占总带数的 46.7%(表 3)。
表 3 5个 ISSR筛选引物对洋桔梗 8个试材基因组 DNA的扩增结果
引物 扩增条带数(条)
多态性条带数
(条)
多态性条带频率
(%)
ISSR-25 9 6 66.7
ISSR-36 12 5 41.7
ISSR-39 9 3 33.3
ISSR-43 9 4 44.4
ISSR-76 6 3 50.0
总数 45 21 46.7
平均 9 4.2 46.7
2.4 洋桔橘不同品种与株系基因组 ISSR指纹图谱的构建及
其聚类分析
根据上述 5条 ISSR通用引物用于 8个试材基因组的
ISSR反应 ,构建了不同品种与株系基因组的 ISSR指纹图谱及
聚类关系树 。图 3为 8个不同基因型洋桔梗试材的 ISSR指
纹图谱(引物 ISSR-36和 ISSR-39)。图 4为根据 ISSR分
析绘制的 8个供试洋桔梗材料的聚类关系树 。
研究结果表明 ,选用 5个 ISSR通用引物进行 PCR扩增 ,
即可准确区分 ArenaGreen、CeremonySnow、EchoLightPink、
DoubleMariachiPink等 4个洋桔梗品种及同一品种 Double
MariachiPink的 F1代和 F2代 。但在本研究所选用的引物范
围内 ,未能扩增出同一品种 DoubleMariachiPinkF1代不同株
系及不同转基因株系的特异性条带 。
3 讨论
有关 ISSR反应条件的优化研究大多采用单因素试验的
方法 [ 12-13 ] ,往往试验次数较多 、工作量较大 。正交试验设计
在 PCR反应体系优化中的运用 [ 14 -16] ,不仅可了解全部试验
因素水平以及因素之间的交互作用 ,而且能较快地找到最优
的因素水平组合 ,大大简化了试验过程 ,节约了时间和经费。
—45—马文晔等:洋桔梗 ISSR最佳反应体系的建立与品种遗传多样性检测
在本研究的 ISSR反应体系中 ,不同试验因素与水平组
合 ,扩增出的 DNA条带数量和亮度也不同 。如 dNTPs、Mg2 +
浓度及 TaqDNA聚合酶的用量都显著影响 DNA扩增条带数
量 ,这与前人的研究结果一致 [ 14 -15] 。但是在本试验结果中 ,
引物浓度和模板浓度对扩增条带数量和亮度都无显著影响 ,
这与许多单因素试验结果不同 [12-13] 。其原因可能是:在单因
素试验中 ,某组分对扩增结果的影响是通过固定其他组分浓
度而单一变化该组分浓度获得的 ,但在正交试验中 ,某组分对
扩增结果的影响是通过综合该组分不同浓度与其他各组分多
种浓度交互作用而获得的 。显然 ,正交设计的结果包含了更
多的信息 ,反映了反应体系中各因素间存在的相互影响 。本
试验获得的优化体系稳定性好 、重复性高、通用性强 ,为进一
步进行洋桔梗的 ISSR分析及相关分子生物学研究奠定了良
好基础 。
近年来 ,洋桔梗栽培育种的不断发展 ,需要进行种子纯度
的快速检测和突变体 、转化体的早期鉴定 。本研究对 8个不
同基因型洋桔梗试材的 ISSR遗传多样性检测结果表明 , ISSR
分子标记方法可检测出不同品种间的遗传差异 ,同样可检测
出同一品种 F1代与 F2代间的遗传差异 。武耀廷等 [ 17 -19]将
RAPD、ISSR和 AFLP等 3种分子标记方法应用于同种植物不
同品种间遗传多样性的检测 。本研究结果表明 , ISSR标记方
法能检测到更高的遗传差异性 ,而且产生的聚类图与系谱图
最吻合 ,更适合于不同品种间亲缘关系的分析 。周延清等 [ 20 ]
认为 , ISSR比 RAPD更适于同一品种不同株系遗传多样性的
检测 。宁国贵等 [ 21 ]以 ISSR标记方法对矮牵牛离体培养再生
植株进行分析的结果表明 ,再生植株间存在很大的遗传变异 。
申斯乐 [ 22-23 ]在以 ISSR标记方法对水稻和月季突变品系进行
分析后认为 , ISSR可作为检测突变株的一种方法 。
作为一种分子标记方法 , ISSR方法除了可应用于不同品
种间的遗传多样性检测之外 ,还可应用于同一品种不同株系
间 、离体培养不同再生株系以及不同突变株系间的遗传多样
性检测 。但在本试验中 ,在所选用的 ISSR引物范围内 ,未能
检测出同一品种 F1代 2个株系之间及 2个转基因株系之间
的遗传多样性 ,可能与该品种 F1代 2个株系之间的遗传差异
较小有关 ,其变异位置可能不在本研究所选用引物的有效扩
增范围之内;也有可能与该转基因株系中 T-DNA的整合特
点有关 。一般转基因 T-DNA的整合是随机的 、单(低)拷贝
的 ,单拷贝遗传差异更难以检测 。因此要将 ISSR分子标记应
用于相同品种不同株系间遗传多样性检测 ,或将其运用于一
般转基因材料的遗传变检测 ,仍需进一步深入研究 。
参考文献:
[ 1]贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种 [ J] .中国农业
科学 , 1996, 29(4):1-10.
[ 2] ZietkiwiczE, RafalskiA, LabudaD.Genomefingerprintingbysimple
sequencerepeats(SSR)-anchoredpolymerasechainreactionampli-
fication[ J] .Genomics, 1994, 20:176-183.
[ 3]邹喻苹 ,葛 颂 ,王晓东.系统与进化植物学中的分子标记 [ M].
北京:科学出版社 , 2001:36-41.
[ 4]张淑红 ,范永山 ,翟凤顺.蝴蝶兰不同花色遗传多样性的 ISSR分
析 [ J] .江苏农业科学, 2009(2):77-78, 106.
[ 5]李宗菊 ,熊 丽 ,桂 敏 , 等.非洲菊基因组 DNA提取及 ISSR-
PCR扩增模板浓度优化 [ J] .云南植物研究 , 2004, 26(4):439-
444.
[ 6]王晓明 ,谢碧霞 , 李俊彬 ,等.金银花 ISSR分子标记及遗传多样
性分析 [ J] .中南林业科技大学学报 , 2008, 28(6):14 -18.
[ 7]刘小莉 ,李飞虎 ,李宗菊 ,等.10种报春花亲缘关系的 ISSR分析
[ J].云南大学学报:自然科学版 , 2004, 26(5):454 -458.
[ 8]杨淑达 , 施苏华 , 龚 洵 ,等.滇牡丹遗传多样性的 ISSR分析
[ J] .生物多样性 , 2005, 13(2):105 -111.
[ 9]李钧敏 ,林 俊.青花菜品种的 ISSR分析 [ J] .江苏农业科学 ,
2008(2):85-88.
[ 10]桂 敏 ,莫锡君 ,吴 旻 ,等.洋桔梗切花栽培管理技术 [ J] .中
国种业 , 2005(8):53-54.
[ 11]王 轶 ,陈崇顺 ,曹伟杰 ,等.利用正交设计建立洋桔梗 RAPD
最佳反应体系 [ J] .北方园艺 , 2008(5):197-199.
[ 12]宣 朴 , 邓 婧 ,陈 新 ,等.苦瓜 ISSR扩增条件优化的研究
[ J] .核农学报 , 2006, 20(3):215-217.
[ 13]何 桥 ,梁国鲁 ,谢江辉.莲雾 ISSR反应体系的优化与应用
[ J] .果树学报 , 2005, 22(2):186-189.
[ 14]刘海河 ,侯喜林 ,张彦萍.西瓜 ISSR-PCR体系的正交优化研究
[ J] .果树学报 , 2004, 21(6):615-617.
[ 15]王彦华 ,侯喜林 ,徐明宇.正交设计优化不结球白菜 ISSR反应
体系研究 [ J] .西北植物学报 , 2004, 24(5):899 -902.
[ 16]莫鹏巧 ,黄玉源 ,钟晓青 ,等.利用正交设计法对叉叶苏铁 ISSR
-PCR反应体系的优化研究 [ J] .植物研究 , 2008, 28(3):304 -
309.
[ 17]武耀廷 ,张天真 ,殷剑美.利用分子标记和形态学性状检测的陆
地棉栽培品种遗传多样性 [ J] .遗传学报 , 2001, 28(11):1040-
1050.
[ 18]贺学勤 ,刘庆昌 ,翟 红 ,等.用 RAPD、ISSR和 AFLP标记分析
系谱关系明确的甘薯品种的亲缘关系 [ J].作物学报 , 2005, 31
(10):1300-1304.
[ 19]祁建民 ,周东新 ,吴为人 ,等.RAPD和 ISSR标记检测黄麻属遗
传多样性的比较研究 [ J] .中国农业科学 , 2004, 37(12):2006-
2011.
[ 20]周延清 ,牛敬媛 ,田苗苗 ,等.怀地黄 85 -5品种内遗传多样性
的RAPD和 ISSR分析 [ J] .河南师范大学学报:自然科学版 ,
2006, 34(3):136 -139.
[ 21]宁国贵 ,白三平 ,包满珠 ,等.矮牵牛细胞的长期离体培养及再
生植株的 ISSR分析 [ J] .中国农业科学 , 2007, 40(7):1479-
1485.
[ 22]申斯乐 ,王振伟 ,单晓辉 ,等.高压导致水稻变异品系发生 DNA
甲基化模式及基因组结构的改变 [ J].中国科学:C辑 生命科
学 , 2005, 35(6):490 -496.
[ 23]谢吉容 ,梁国鲁 ,李树发 ,等.月季`金银岛 的红花芽变品系的
分析鉴定 [ J] .北方园艺 , 2007(11):186 -188.
—46— 江苏农业科学 2010年第 1期