全 文 ：书 ［收稿日期］ ２０１４－０４－０６；２０１４－０６－２２修回
［基金项目］ 贵州省科学技术基金项目“红托竹荪资源遗传多样性研究”［黔科合Ｊ字（２０１１）２１６９号］；贵阳市科学技术计划项目“红托竹荪
代料发酵生态循环栽培技术集成与示范”［（２０１０）筑科农合同字第１－农－１７］；贵州省科技计划项目“织金竹荪以草代木栽培优
良菌株筛选及应用示范”［黔科合ＮＹ字（２０１１）３０３２］
［作者简介］ 卢颖颖（１９８５－），女，研究实习员，硕士，从事食用菌育种与栽培研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｙｉｎｇｙｉｎｇ６６８８＠１６３．ｃｏｍ
＊通讯作者：朱国胜（１９７１－），男，研究员，博士，从事药用植物益生菌及食药用真菌研究。Ｅ－ｍａｉｌ：４９５１４２２４＠ｑｑ．ｃｏｍ
［文章编号］１００１－３６０１（２０１４）０７－０３７２－００１７－０４
１８个贵州红托竹荪种质资源的遗传多样性
卢颖颖，桂 阳，龚光禄，魏善元，朱国胜＊
（１．贵州省农作物品种资源研究所，贵州 贵阳５５０００６；２．贵州省农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳５５０００６）
［摘 要］为红托竹荪优良菌种的选育和开发利用提供参考，利用ＩＴＳ和ＩＳＳＲ分子标记对１８个贵州红
托竹荪种质的遗传多样性进行分析。结果表明：１）１８个红托竹荪菌株的ＩＴＳ序列长度为６１１～６２１ｂｐ，ＧＣ
碱基的含量为５３．９％～５４．６８％，相似性为９９．９％～１００％。２）在遗传相似度为０．７７时，将１８个红托竹荪
菌株分为２个类群。第Ⅰ类群包含１３个菌株，分别为３个栽培菌株（ＺＳ０１７，ＺＳ０３６，ＺＳ０３８）和１０个野生菌
株（ＹＺＳ０１０－１，ＹＺＳ０１０－２，ＹＺＳ０１２，ＹＺＳ０１８，ＹＺＳ０３３，ＹＺＳ０３５，ＹＺＳ０３９，ＹＺＳ０４１，ＹＺＳ０４４，ＹＺＳ０４６）；第Ⅱ类
群包含５个野生菌株（ＹＺＳ０４０，ＹＺＳ０４３，ＹＺＳ０４５，ＹＺＳ０４７，ＹＺＳ０５２）。结论，贵州１８个红托竹荪种质的亲缘
关系较近，没有明显的地域分布特点，其遗传背景差异较小。
［关键词］红托竹荪；内转录间隔区；ＩＴＳ和ＩＳＳＲ分子标记；遗传多样性
［中图分类号］Ｓ６４６．８ ［文献标识码］Ａ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ １８ Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｕｉｚｈｏｕ
ＬＵ Ｙｉｎｇｙｉｎｇ，ＧＵＩ Ｙａｎｇ ＧＯＮＧ，Ｇｕａｎｇｌｕ，ＷＥＩ Ｓｈａｎｙｕａｎ，ＺＨＵ Ｇｕｏｓｈｅｎｇ＊
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ５５０００６；
２．Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５５０００６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｄ．ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａ，ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄ．ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｕｉｚｈｏｕ ｂｙ ＩＴＳ ａｎｄ ＩＳＳＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：１）ＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ １８ Ｄ．ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ６１１～６２１ｂｐ，ＧＣ ｂａｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ５３．９％～５３．９％ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗａｓ ９９．９％～１００％．２）Ｔｈｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＩＳＳＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ
ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ａｔ ａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ０．７７．ＧｒｏｕｐⅠｃｏｎｔａｉｎｅｄ １３ｓｔｒａｉｎｓ，ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ
ｔｈｒｅｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ（ＺＳ０１７，ＺＳ０３６，ＺＳ０３８）ａｎｄ １０ｗｉｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ（ＹＺＳ０１０－１，ＹＺＳ０１０－２，ＹＺＳ０１２，
ＹＺＳ０１８，ＹＺＳ０３３，ＹＺＳ０３５，ＹＺＳ０３９，ＹＺＳ０４１，ＹＺＳ０４４，ＹＺＳ０４６）．ＧｒｏｕｐⅡｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｆｉｖｅ ｗｉｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ
（ＹＺＳ０４０，ＹＺＳ０４３，ＹＺＳ０４５，ＹＺＳ０４７，ＹＺＳ０５２）．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅｓｅ １８
ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｃｌｏｓｅ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
ｗａｓ ｏｆ ｌｉｔｔｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａ；ＩＴＳ；ＩＴＳ ａｎｄ ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
红 托 竹 荪 （Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａ Ｍ．
Ｚａｎｇ，ｅｔ ａｌ．）隶属于担子菌门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）腹菌
纲 （Ｇａｓｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）鬼 笔 目 （Ｐｈａｌａｌｅｓ）鬼 笔 科
（Ｐｈａｌａｃｅａｅ）竹荪属（Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ）食用菌，是贵州
省最具特色的优势食用菌，在其食用菌产业中占有
重要地位。红托竹荪是竹荪中的珍品，其气香、味
鲜、质脆，且富含多种氨基酸、维生素、无机盐等营养
成分，具有益气补脑、宁神健体等功效，市场开发前
景较好。野生红托竹荪主要分布在我国贵州的中
（西）部和云南、四川、浙江等省，多生长于竹林下的
腐殖土上［１－２］。２０１０年以红托竹荪为代表的贵州织
金竹荪获得了国家地理保护标识认证，其常年种植
面积达２００～３３３ｈｍ２，总产量达３００～５００ｔ，产值
１．５亿余元，织金县现已成为贵州红托竹荪的集散
地，并逐渐形成了以织金县为中心向全省辐射的红
托竹荪产业布局。但贵州红托竹荪在经过长期的自
然选择和人工驯化后，其遗传背景不清，生产中存在
菌种混杂、产量不稳等现象。目前，国内学者已在分
子水平上利用内转录间隔区（ＩＴＳ）和ＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ
Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）对香菇、黑木耳、侧耳属等
食用菌的遗传多样性、指纹图谱构建以及菌株的鉴
定等进行了研究［１０－１４］，对红托竹荪食用菌的研究则
主要集中在其栽培模式、菌种保存、多糖活性物质的
提取及化学成分分析等方面［３－９］，而针对其种质资源
的遗传背景和遗传多样性进行研究的文献尚未见报
道。为此，笔者利用ＩＴＳ及ＩＳＳＲ分子技术对１８个
贵州野生和栽培红托竹荪食用菌的遗传多样性进行
分析，比较它们之间的遗传差异，在分子水平上揭示
不同菌株间的亲缘关系与遗传基础，旨为贵州红托
竹荪优良菌种的选育和开发利用提供理论依据。
贵州农业科学 ２０１４，４２（７）：１７～２０
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 供试菌株 在供试的１８个贵州红托竹荪
菌株中，有１５个为野生菌株，采自织金县、德江县、
遵义市、黔西南布依族苗族自治州；３个为栽培菌
株，采自织金县、遵义市和德江县（表１）。
１．１．２ 试剂与仪器 ＩＴＳ引物为ＩＴＳ１（５′－ＴＣＣＧ－
ＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣ－
ＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＧＧＣ－３′）通用引物；ＩＳＳＲ引物
也为通用引物，其编号和序列见表２。所有引物均
由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表１ １８个贵州红托竹荪菌株的来源与名称
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ
编号
Ｃｏｄｅ
菌株名称
Ｓｔｒａｉｎｓ
采样地点
Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ
菌株类型
Ｔｙｐｅ
１ ＹＺＳ０１０－１ 织金县普翁乡白岩脚 野生型
２ ＹＺＳ０１０－２ 织金县普翁乡白岩脚 野生型
３ ＹＺＳ０１２ 织金县桂果镇打油寨 野生型
４ ＺＳ０１７ 织金县桂果镇雅贤农业山庄 栽培型
５ ＹＺＳ０１８ 织金县城关镇白岩村白乌寨 野生型
６ ＹＺＳ０３３ 织金县黑土乡龙洞村陈家竹林 野生型
７ ＹＺＳ０３５ 织金县后寨乡三家寨乡刹河安家竹林 野生型
８ ＺＳ０３６ 遵义市板桥镇 栽培型
９ ＺＳ０３８ 德江县高山乡龙洞湾竹林 栽培型
１０ ＹＺＳ０３９ 德江县高山乡龙洞湾竹林 野生型
１１ ＹＺＳ０４０ 德江县高山乡龙洞湾竹林 野生型
１２ ＹＺＳ０４１ 德江县沙溪乡煤厂竹林 野生型
１３ ＹＺＳ０４３ 德江县沙溪乡煤厂竹林 野生型
１４ ＹＺＳ０４４ 龙里县 野生型
１５ ＹＺＳ０４５ 龙里县 野生型
１６ ＹＺＳ０４６ 龙里县 野生型
１７ ＹＺＳ０４７ 龙里县 野生型
１８ ＹＺＳ０５２ 普安县青山镇烟司马张家竹林 野生型
表２ ２８条ＩＳＳＲ引物的编号及序列
Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｏｄｅｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ２８ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列（５’－３’）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列（５’－３’）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｐ４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴ Ｐ２４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＴ
Ｐ５ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣ Ｐ２５ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＣ
Ｐ６ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧ Ｐ２６ ＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＹＡ
Ｐ７ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴ Ｐ２８ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＴ
Ｐ９ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡ Ｐ３０ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＧ
Ｐ１１ ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡ Ｐ３６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＴ
Ｐ１２ ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣ Ｐ３７ ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＲＣ
Ｐ１４ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡ Ｐ３８ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ
Ｐ１５ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣ Ｐ３９ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ
Ｐ１６ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＧ Ｐ４０ ＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴ
Ｐ１７ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ Ｐ４１ ＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧ
Ｐ１８ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ Ｐ４２ ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣ
Ｐ１９ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＧ Ｐ４７ ＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴ
Ｐ２０ ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧ Ｐ４８ ＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＣＡ
１．２ 菌株的分离纯化及菌丝培养
１．２．１ 菌株的分离纯化 采用组织分离法对菌株
进行分离纯化培养。首先，将采集到的野生种和栽
培种红托竹荪竹蛋用ｄｄＨ２Ｏ洗净表面泥土和杂质，
晾干，用７５％的酒精棉球轻擦子实体表面，无菌
ｄｄＨ２Ｏ冲洗３次，再用无菌滤纸吸干表面水分。在
超净工作台上，用无菌解剖刀纵切竹蛋１／３，撕取一
小块内层菌柄组织接入ＰＤＡ平板上，于２５℃恒温
培养箱中培养，在菌丝即将长满平板还未爬壁时，用
接种针在长势较好的平板菌丝边缘挑取健壮菌丝，
接种到ＰＤＡ平板上进行纯化培养，如此重复３次，
即可得到与原品种基本一致的纯化菌种。余下子实
体组织分成小块装入１．５ｍＬ无菌离心管中，于
－２０℃冰箱中保存备用。
１．２．２ 菌丝的培养 将活化后的菌种接入直径为
６ｃｍ的平板培养皿中培养，培养基与菌种间铺玻璃
纸，待菌丝即将长满平板还未爬壁时，揭下玻璃纸，
刮取菌丝备用。
１．３ 菌株ＤＮＡ的提取和检测
采用白永宏等［１５］改进的ＣＴＡＢ法提取子实体
菌柄组织和菌丝体总ＤＮＡ，用１％的琼脂糖凝胶电
泳检测其提取ＤＮＡ的质量和浓度。
１．４ ＩＴＳ反应体系及序列测定
１．４．１ ＩＴＳ反应体系 ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增反应的总体
积为 ２５μＬ。其 中，１０×ＴａｑＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ
Ｍｇ２＋）２．５μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）
０．３μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ
ＩＴＳ１／ＩＴＳ４引物各１μＬ，模板ＤＮＡ １μＬ（浓度１～
１００ｎｇ／μＬ），ｄｄＨ２Ｏ １８．２μＬ。
ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增条件：参照刘华晶等［１１］的方法，
９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５２℃退火１ｍｉｎ，
７２℃延伸１．５ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸８ｍｉｎ。
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贵 州 农 业 科 学
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１．４．２ ＩＴＳ序列测定 采用 ＴＡ克隆测序方法，
将ＰＣＲ纯化产物与ｐＭＤ１９－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（ＴａＫａＲａ）连
接后转至大肠杆菌ＤＨ５α的感受态细胞中，在含有
Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、Ａｍｐ的ＬＢ平板上培养进行蓝白斑筛
选，挑取白色菌落培养，并进行菌落ＰＣＲ检测，引物
为 Ｍ１３Ｒ／Ｆ。
扩增体系总体积为１５μＬ，其中，１０×ＴａｑＰＣＲ
Ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ Ｍｇ２＋）１．５μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（５Ｕ／μＬ）０．１５μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２μＬ，
１０μｍｏｌ／Ｌ Ｍ１３Ｒ／Ｆ引物各０．３μＬ，菌液０．５μＬ，
ｄｄＨ２Ｏ １１．０５μＬ。
ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增条件：９５℃ ５ｍｉｎ，９４℃ ３０ｓ，
５５℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，３５个循环，７２℃１０ｍｉｎ［１７］。
克隆成功后，样品委托上海生物工程技术服务有限
公司进行双向测序。
将各菌株测序所得的ＩＴＳ序列通过 ＤＮＡＳ－
ＴＡＲ．Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ．Ｖ７．１中的ＳｅｑＭａｎ拼接，反复校
对组装后提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库。运用 ＭｅｇＡｌｉｎ和
ＭＥＧＡ５．１软件计算各个ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列间的相似
性及遗传距离。
１．５ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系与聚类树状图的构建
１．５．１ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系 ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反
应总体积为２０μＬ，其中，ＤＮＡ模版０．８μＬ，引物
０．８μＬ，１０ｘＴａｑＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ Ｍｇ
２＋ ）２μＬ，
ＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．１６μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １５．８４μＬ。
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增条件：９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃
变性１ｍｉｎ，退火４０ｓ（退火温度视引物而定），７２℃延伸
１．５ｍｉｎ，４０个循环；７２℃１０ｍｉｎ，４℃终止反应。
ＰＣＲ产物在１．５％琼脂糖凝胶上电泳分离，
Ｇｏｌｄｖｉｅｗ染色，Ｂｉｏ－ｒａｄ凝胶成像系统照相［１８］。
１．５．２ 聚类树状图的构建 根据照相结果统计条
带，用ＮＴＳＹＳ软件，以平均连锁法（ＵＰＧＭＡ）进行
聚类分析，并建立聚类树状图。
２ 结果与分析
２．１ ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增的序列
由图１可知，１８个红托竹荪菌株的基因组
ＤＮＡ经ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增后均获得了单一目的条带，
其序列片段长度为６００～６５０ｂｐ，各菌株间的条带
大小略有差异，而 ＮＣＢＩ公共数据库 ＧｅｎｅＢａｎｋ中
已上传的鬼笔科和竹荪属的ＩＴＳ（包含完整的ＩＴＳ１
＋５．８ｓＤＮＡ＋ＩＴＳ２）序列长度为６００ｂｐ左右。说
明，扩增获得的ＩＴＳ序列为所需的目的片段。
ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增获得的目的片段包括ＩＴＳ１、
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
图１ １８个菌株ＤＮＡ的ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增图谱
Ｆｉｇ．１ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＩＴＳ－ＰＣＲ ｏｆ
１８ｓｔｒａｉｎｓ
５．８ＳｒＤＮＡ和ＩＴＳ２序列，分别将这１８条红托竹荪
ＩＴＳ序列的测序结果提交到 ＮＣＢＩ数据库 Ｇｅｎｅ－
Ｂａｎｋ，并利用 ＮＣＢＩ软件的ＢＬＡＳＴ进行网上序列
比对，其与１８条序列相似度最高的菌株均为竹荪
属，但未发现红托竹荪种的ＩＴＳ序列。说明，红托
竹荪种的ＩＴＳ序列信息鲜有研究或未见公开报道。
２．２ ＩＴＳ序列的同源性
由表３看出，１８个贵州红托竹荪种质资源的
ＩＴＳ序列长度为６１１～６２１ｂｐ，ＧＣ 碱基含量为
５３．９％～５４．６８％。由表４可知，１８个菌株ＩＴＳ序
列的相似性达９９．１％～１００％，遗传距离为０～
０．７％。说明，１８个菌株的同源性很高。
２．３ ＩＳＳＲ的聚类分析
由图２可知，１８个红托竹荪菌株的遗传相似度
为０．７２９～０．８８６，平均０．８０７。在遗传相似度为
０．７７时，可将１８个红托竹荪菌株划分为２个类群。
第Ⅰ类群包含１３个菌株，分别为３个栽培菌株
（ＺＳ０１７，ＺＳ０３６，ＺＳ０３８）和 １０ 个 野 生 菌 株
（（ＹＺＳ０１０－１， ＹＺＳ０１０－２， ＹＺＳ０１２， ＹＺＳ０１８，
ＹＺＳ０３３，ＹＺＳ０３５，ＹＺＳ０３９，ＹＺＳ０４１，ＹＺＳ０４４，
ＹＺＳ０４６））；第Ⅱ类群包含５个野生菌株（ＹＺＳ０４０，
ＹＺＳ０４３，ＹＺＳ０４５，ＹＺＳ０４７，ＹＺＳ０５２）。在遗传相似
度为０．７９时，又可将２个类群划分为４个亚类群。
第１亚类群包含１２个菌株，分别为３个栽培菌株
（ＺＳ０１７，ＺＳ０３６，ＺＳ０３８）和９个野生菌株（ＹＺＳ０３３，
ＹＺＳ０１２，ＹＺＳ０１８等）；第２亚类群仅有１个野生菌
株（ＹＺＳ０４１）；第 ３ 亚类群包括 ２ 个野生菌株
（ＹＺＳ０４０和ＹＺＳ０４３）；第４亚类群包含３个野生菌
株，分别为ＹＺＳ０４５，ＹＺＳ０５２和ＹＺＳ０４７。部分菌株
间的遗传相似度较高，达０．８３５以上，如 ＹＺＳ０１０－２
和ＺＳ０１７、ＹＺＳ０３５和ＺＳ０３６、ＹＺＳ０４５和ＹＺＳ０５２的
遗传相似度最大，均为０．８８２，表明其相互间的亲缘
关系较近。
表３ １８株菌株ＩＴＳ序列的长度和ＧＣ含量
Ｔａｂｌｅ ３ Ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｆｒｏｍ １８ｓｔｒｉａｎｓ
菌株
Ｓｔｒａｉｎｓ
序列大小／ｂｐ
Ｌｅｎｇｔｈ
序列号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
ＧＣ含量／％
ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔ
ＹＺＳ０１８ ６１６ ＫＦ９３９５１３ ５３．９０
ＺＳ０３６ ６１７ ＫＦ９３９５０１ ５３．９７
ＹＺＳ０３９ ６１７ ＫＦ９３９５０２ ５３．９７
ＺＳ０３８ ６１７ ＫＦ９３９５０９ ５３．９７
ＹＺＳ０４５ ６１１ ＫＦ９３９５０５ ５４．０１
ＹＺＳ０４４ ６１２ ＫＦ９３９５１５ ５４．０８
ＹＺＳ０４０ ６１８ ＫＦ９３９５０３ ５４．２１
ＹＺＳ０４７ ６１８ ＫＦ９３９５０７ ５４．２１
ＹＺＳ０１０－１ ６１８ ＫＦ９３９５１０ ５４．２１
ＹＺＳ０４１ ６１５ ＫＦ９３９５１４ ５４．３１
ＹＺＳ０５２ ６１８ ＫＦ９３９５０８ ５４．３７
ＹＺＳ０４６ ６２１ ＫＦ９３９５０６ ５４．４３
ＹＺＳ０４３ ６１７ ＫＦ９３９５０４ ５４．４６
ＹＺＳ０１０－２ ６１７ ＫＦ９３９５１１ ５４．４６
ＺＳ０１７ ６１７ ＫＦ９３９５１６ ５４．４６
ＹＺＳ０３５ ６１８ ＫＦ９３９５００ ５４．５３
ＹＺＳ０１２ ６１３ ＫＦ９３９５１２ ５４．６５
ＹＺＳ０３３ ６２０ ＫＦ９３９４９９ ５４．６８
·９１·
卢颖颖 等 １８个贵州红托竹荪种质资源的遗传多样性
ＬＵ Ｙｉｎｇｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ １８Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｕｉｚｈｏｕ
表４ １８个菌株ＩＴＳ序列的相似性和遗传距离
Ｔａｂｌｅ ４ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ １８ｓｔｒａｉｎｓ
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
ＹＺＳ
０３３
ＹＺＳ
０３５
ＺＳ
０３６
ＹＺＳ
０３９
ＹＺＳ
０４０
ＹＺＳ
０４３
ＹＺＳ
０４５
ＹＺＳ
０４６
ＹＺＳ
０４７
ＹＺＳ
０５２
ＺＳ
０３８
ＹＺＳ
０１０－１
ＹＺＳ
０１０－２
ＹＺＳ
０１２
ＹＺＳ
０１８
ＹＺＳ
０４１
ＹＺＳ
０４４
ＺＳ
０１７
ＹＺＳ０３３ １００ ９９．８ ９９．８ ９９．８ １００ ９９．３ １００ ９９．８ ９９．８ ９９．８ ９９．８ １００ ９９．５ ９９．８ ９９．７ ９９．３ １００
ＹＺＳ０３５ ０ ９９．８ ９９．８ ９９．８ １００ ９９．３ １００ ９９．８ ９９．８ ９９．８ ９９．８ １００ ９９．５ ９９．８ ９９．７ ９９．３ １００
ＺＳ０３６ ０．２ ０．２ １００ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８ １００ ９９．７ １００ １００ ９９．８ ９９．７ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８
ＹＺＳ０３９ ０．２ ０．２ ０ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８ １００ ９９．７ １００ １００ ９９．８ ９９．７ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８
ＹＺＳ０４０ ０．２ ０．２ ０ ０ ９９．８ ９９．５ ９９．８ １００ ９９．７ １００ １００ ９９．８ ９９．７ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８
ＹＺＳ０４３ ０ ０ ０．２ ０．２ ０．２ ９９．３ １００ ９９．８ ９９．８ ９９．８ ９９．８ １００ ９９．５ ９９．８ ９９．７ ９９．３ １００
ＹＺＳ０４５ ０．７ ０．７ ０．５ ０．５ ０．５ ０．７ ９９．３ ９９．５ ９９．１ ９９．５ ９９．５ ９９．３ ９９．１ ９９．５ ９９．３ １００ ９９．３
ＹＺＳ０４６ ０ ０ ０．２ ０．２ ０．２ ０ ０．７ ９９．８ ９９．８ ９９．８ ９９．８ １００ ９９．５ ９９．８ ９９．７ ９９．３ １００
ＹＺＳ０４７ ０．２ ０．２ ０ ０ ０ ０．２ ０．５ ０．２ ９９．７ １００ １００ ９９．８ ９９．７ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８
ＹＺＳ０５２ ０．２ ０．２ ０．３ ０．３ ０．３ ０．２ ０．９ ０．２ ０．３ ９９．７ ９９．７ ９９．８ ９９．３ ９９．７ ９９．５ ９９．１ ９９．８
ＺＳ０３８ ０．２ ０．２ ０ ０ ０ ０．２ ０．５ ０．２ ０ ０．３ １００ ９９．８ ９９．７ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８
ＹＺＳ０１０－１ ０．２ ０．２ ０ ０ ０ ０．２ ０．５ ０．２ ０ ０．３ ０ ９９．８ ９９．７ １００ ９９．８ ９９．５ ９９．８
ＹＺＳ０１０－２ ０ ０ ０．２ ０．２ ０．２ ０ ０．７ ０ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ９９．５ ９９．８ ９９．７ ９９．３ １００
ＹＺＳ０１２ ０．５ ０．５ ０．４ ０．４ ０．４ ０．５ ０．９ ０．５ ０．４ ０．７ ０．４ ０．４ ０．５ ９９．７ ９９．５ ９９．１ ９９．５
ＹＺＳ０１８ ０．２ ０．２ ０ ０ ０ ０．２ ０．５ ０．２ ０ ０．３ ０ ０ ０．２ ０．４ ９９．８ ９９．５ ９９．８
ＹＺＳ０４１ ０．３ ０．３ ０．２ ０．２ ０．２ ０．３ ０．７ ０．３ ０．２ ０．５ ０．２ ０．２ ０．３ ０．５ ０．２ ９９．３ ９９．７
ＹＺＳ０４４ ０．７ ０．７ ０．５ ０．５ ０．５ ０．７ ０ ０．７ ０．５ ０．９ ０．５ ０．５ ０．７ ０．９ ０．５ ０．７ ９９．３
ＺＳ０１７ ０ ０ ０．２ ０．２ ０．２ ０ ０．７ ０ ０．２ ０．２ ０．２ ０．２ ０ ０．５ ０．２ ０．３ ０．７
注：表中上三角为ＩＴＳ序列的相似性，下三角为ＩＴＳ序列的遗传距离。
Ｎｏｔｅ：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｔｒｉａｎｇｌｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｔｒｉａｎｇｌｅ．
0.75 0.79 0.82 0.85 0.89
图２ １８个红托竹荪菌株的ＵＰＧＭＡ聚类图
Ｆｉｇ．２ Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｓ ｏｆ ＵＰＧＭＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １８
Ｄ．ｒｕｂｒｏｖｏｌｖａｔａｓｔｒａｉｎｓ
３ 结论与讨论
１）ＩＴＳ序列分析结果表明，贵州红托竹荪资源
的遗传背景存在一定差异，１８个贵州野生和栽培红
托竹荪的遗传距离较近，相似性较高，它们在ＩＴＳ
序列水平上的差异性较小。
２）ＩＳＳＲ聚类分析结果显示，１８个红托竹荪菌
株的遗传相似度为０．７２９～０．８８６，平均０．８０７。在
遗传相似度为０．７７时，可将１８个红托竹荪菌株划
分为２个类群。第Ⅰ类群包含１３个菌株，分别为３
个栽培菌株（ＺＳ０１７，ＺＳ０３６，ＺＳ０３８）和１０个野生菌
株 （ＹＺＳ０１０－１，ＹＺＳ０１０－２，ＹＺＳ０１２，ＹＺＳ０１８，
ＹＺＳ０３３，ＹＺＳ０３５，ＹＺＳ０３９，ＹＺＳ０４１，ＹＺＳ０４４，
ＹＺＳ０４６）；第Ⅱ类群包含５个野生菌株（ＹＺＳ０４０，
ＹＺＳ０４３，ＹＺＳ０４５，ＹＺＳ０４７，ＹＺＳ０５２）。在遗传相似
度为０．７９时，又可将２个类群划分为４个亚类群。
第１亚类群包含１２个菌株，第２亚类群仅有１个野
生菌株；第３亚类群包括２个野生菌株，第４亚类群
包含３个野生菌株。部分菌株间的遗传相似度较高，
达到０．８３５以上，表明其相互间的亲缘关系很近。
３）分析结果发现，１８个贵州红托竹荪菌株没
有明显的区域分布规律，说明其遗传背景相似。尽
管ＩＴＳ序列分析 ＹＺＳ０１０－２和ＺＳ０１７、ＹＺＳ０３５和
ＺＳ０３６、ＹＺＳ０４５和 ＹＺＳ０５２菌株间的相似性达到
９９％～１００％，但ＩＳＳＲ分析结果却并没有如此高的
相似性。说明，采用ＩＳＳＲ分子技术分析红托竹荪
菌株的遗传多样性优于ＩＴＳ。总体来说，贵州省境
内的红托竹荪菌种间的遗传背景存在一定差异，但
遗传关系较近，不同来源的野生种聚为一类，说明其
地域性不强；而不同来源的栽培种与野生种可以聚
为一类，则可能与贵州红托竹荪栽培种多由野生红
托竹荪分离驯化而来有关。
［参 考 文 献］
［１］ 姜守忠，林朝忠，吴 勇，等．竹荪栽培与制种技术
［Ｍ］．贵阳：贵州科技出版社，１９９１：１－１０．
［２］ 吴 勇，姜守忠，林朝忠．竹荪栽培与加工技术［Ｍ］．
贵阳：贵州科技出版社，１９９７：１－９．
［３］ 邹方伦．贵州竹荪资源及生态的研究［Ｊ］．贵州农业科
学，１９９４（３）：４３－４７．
［４］ 刘都才，唐学龙，杨建武．竹荪高产制种技术要素的筛
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［５］ 何 惠，徐兆伯．液态发酵竹荪多糖提取工艺的优化
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［６］ 赵 凯，王飞娟，潘薛波，等．红托竹荪菌托多糖的提
取及抗肿瘤活性的初步研究［Ｊ］．菌物学报，２００８，２７
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［７］ 杨 颖，程俊俠，王 军，等．红托竹荪化学成分的分
离和鉴定［Ｊ］．陕西师范大学学报：自然科学版，２０１２，
４０（５）：１０１－１０３． （下转第２３页）
·０２·
贵 州 农 业 科 学
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
图３ 菌株与同源性高菌株种的系统发育树
Ｆｉｇ．３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ
３ 结论与讨论
木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）是自然界中资源丰
富的拮抗微生物，具有抗菌谱广、适应性强和多机制
性的特点［１０］。以木霉菌表型特征作为分类依据的
传统方法，由于受外部环境影响较大，已经难以适应
木霉菌研究领域的发展和需要，借助现代分子生物
学手段，寻求高效准确的分类方法已经成为木霉菌
鉴定的新趋势。只有准确分类以确定木霉菌株种属
地位，获取木霉菌详细的身份信息，才能为后续研究
和有效利用提供坚实的平台和可靠的保障。该研究
在形态分类的基础上，应用ＩＴＳ序列分析技术对滨
州市农业工程重点实验室采集分离的木霉菌株 Ｔ－
Ｃ７进行了鉴定。结果显示，形态学观察结果、ＩＴＳ
序列与ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ中序列的比对结果以及系统
聚类分析均证明 Ｔ－Ｃ７为哈茨木霉，提高了鉴定的
准确性和可靠性，克服了单纯依靠传统形态学分类
的局限性，有助于下一步玉米苗期根腐病木霉菌生物
防治机制研究的深入开展。哈茨木霉菌是抑制玉米
串珠镰孢菌的菌株，同时对多种植物病原菌具有拮抗
作用，也能促进植物的生长和提高植物的抗逆性［１１］。
因此，是具有较好开发前景的农用微生物菌株。
［参 考 文 献］
［１］ 孙广勤．鲁西夏玉米苗期叶枯病发生特点与防治对策
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［２］ 刘治刚．玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选［Ｊ］．贵州
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的发生及生物防治研究［Ｊ］．西南农业学报，２００７，２０
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Ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｃ］／／Ｇａｍｓ Ｗ，Ｂｉｓｓｅｔｔ Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉ－
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｔａｙｌｏｒ ＆
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（责任编辑：刘忠丽
櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁
）
（上接第２０页）
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Ｉｔｏ Ｔ．［Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｄ－ｂｏｒｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａ
ｆｒｏｍ ｍｉｘｅｄ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ［Ｊ］．Ｋａｎｓｅｎｓｈｏｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，
２０１２，８６（６）：７４１－７４８．
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（责任编辑：陈 静）
·３２·
刘治刚 木霉菌株Ｔ－Ｃ７的形态鉴定及其ＩＴＳ序列分析
ＬＩＵ Ｚｈｉｇａｎｇ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＩＴＳ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｓｔｒａｉｎ Ｔ－Ｃ７