全 文 ：275植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2005, 31 (3): 2-280
2004-06-28收到， 005-03-09接受。
教育部留学生基金(教外司1999363)资助。
*通讯作者(E-mail: ltxiao@hunau.net; Tel: 0731-4635259-
8001)。
伏令夏橙愈伤组织体细胞胚发生中多胺水平的变化
刘华英1, 萧浪涛1*, 鲁旭东1, 胡家金1, 吴顺1, 何长征1, 邓秀新2
(1湖南农业大学湖南省植物激素与生长发育重点实验室，长沙410128；2华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉
430070)
摘要：以继代培养8年的伏令夏橙愈伤组织为材料，研
究了不同类型愈伤组织体细胞胚发生能力的差异和多胺
水平的变化及两者之间的关系。结果表明，胚性愈伤组
织的多胺含量高于非胚性愈伤组织，体细胞胚发生能力
与多胺水平呈正相关。体细胞胚发生早期Put含量的增
加有利于体细胞胚发生。球形胚大量形成时，Spd达到
最高值；球形胚发育后期并有少量心形胚形成时Spm
达到峰值。随着倍性的增加，伏令夏橙体细胞胚发生能
力降低。精氨酸脱羧酶的活性变化与Put水平呈正相
关，表明它是调节伏令夏橙体细胞胚发生中多胺水平的
重要因子。
关键词：多胺；体细胞胚发生；伏令夏橙
中图分类号：Q945
多胺广泛存在于各种植物中，主要有腐胺
(putrescine, Put)、亚精胺(spermidine, Spd) 、精
胺(spermine, Spm)和尸胺(cadaverine, Cad)，它们
能促进细胞生长、分化和增殖，延缓衰老，参
与胚胎发育和花芽分化等生命活动，与植物的生
长发育密切相关(Evans和Malmberg1989; Tiburcio
等1993)。多胺在体细胞胚发生中的作用在胡萝卜
中研究较多，但对柑橘(伏令夏橙)不同类型长期
继代培养愈伤组织体细胞胚发生中多胺水平的变化
及与体细胞胚发生能力的关系还未见报告。研究
表明，多胺能促进胡萝卜、枸杞等的体细胞胚发
生，维持愈伤组织的胚性，适量的外源Put和Spd
或它们的合成前体精氨酸也可促进体细胞胚发生和
发育，但多胺对野胡萝卜、茄子等的体细胞胚发
生没有促进作用，甚至抑制其发生(邢更妹等2002;
Brudley和El-Fik 1984; Feirer等1984; Forbert和
Webb 1988)。
柑橘的多胚性及部分品种的不育性限制了有
性杂交在柑橘品种改良上的应用。通过体细胞胚
发生途径再生植株为品种脱毒复壮、遗传改良、
种质保存和快速繁殖提供了新的方法和手段，而
柑橘体细胞胚发生能力在不同品种和不同来源的外
植体间有很大差异(邓占鳌等1991)。本研究通过
比较伏令夏橙长期继代培养的不同类型愈伤组织体
细胞胚发生能力及多胺含量和精氨酸脱羧酶
(arginine decarboxylase, ADC, EC 4.1.1.19)活性的变
化，研究多胺在伏令夏橙体细胞胚发生中的生理
作用，探讨多胺与体细胞胚发生能力间的关系，
为高频诱导体细胞胚发生和阐明体细胞胚发生的机
理提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
实验材料为长期继代保存8年的伏令夏橙
(Citrus sinensisOsb. cv. Valencia)二倍体胚性和非胚
性珠心愈伤组织，分别记作V2I和V2II；四倍体
和六倍体胚性愈伤组织，分别记作V4和V6 (华中
农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供)。
1.2　培养方法
参照萧浪涛等(2001)的方法。愈伤组织继代
培养基为MT (Murashige和Tucker 1969)+蔗糖5%+
琼脂0.7% (pH 5.8)，每30 d继代1次。取继代
20 d的愈伤组织进行体细胞胚发生诱导。诱导体
细胞胚发生的分化培养基为MT+甘油2%+琼脂
0.7% (pH 5.8)，30 d时观察记录胚状体形成情况。
外源Put处理是将继代20 d的愈伤组织在添加Put
30 mg/L的分化培养上培养5 d，然后转到正常的
分化培养基上。分化培养时，定期取样进行内源
多胺含量和精氨酸脱羧酶(ADC)活性的测定。所
有培养均在(28±1)℃、光照强度约为40 mmol m-2
s -1、每天光照14 h的条件下进行。
1.3　内源多胺的提取和含量测定
参照Flore和Galston (1982)的方法加以改进。
取0.5~1 g柑橘愈伤组织加入2 mL预冷的5%高
276 31卷 植物生理与分子生物学学报
氯酸(W/V)冰浴研磨，冰浴浸提1 h，4℃ 23 000×g
离心20 min。取500 mL上清液加入7 mL苯甲酰
氯，1 mL NaOH 2 mol/L，充分混匀后37℃水浴
反应30 min，然后加入2 mL饱和NaCl，2 mL
乙醚，充分混匀后1 500×g离心5 min。收集1 mL
醚相真空干燥，用100 mL甲醇溶解后过0.45 mm
滤膜，取10 mL进样。
多胺含量的测定在Agilent 1100型高效液相色
谱仪上进行，色谱条件如下： Waters C18反向色
谱柱(4.6 mm×250 mm，5 mm)，流动相为甲醇：
水(体积比为64:36)，检测光波长为230 nm，流
速0.7 mL/min，柱温30℃。外标法定量。
1.4　ADC的提取和活性测定
参照赵福庚和刘友良(2000)的方法进行酶液的
提取及部分纯化，略作修改。反应体系组成为：
1 mL Tris-HCl 100 mmol/L缓冲液(pH 7.5, 内含
EDTA 5 mmol/L, 磷酸吡哆醛40mmol/L和二硫苏糖
醇5 mmol/L)和0.3 mL酶提取液及0.2 mL 精氨酸
25 mmol/L，37℃反应60 min后，加入高氯酸至
终浓度5%，3 000×g离心10 min，取0.5 mL上
清液加入1 mL NaOH 2 mol/L，混匀，加10 mL
苯甲酰氯，涡旋混匀，25℃反应60 min，再加
入2 mL饱和NaCl，混匀后加入2 mL乙醚，振
荡，15 000×g离心5 min，收集1 mL醚相，真
空浓缩至干，再溶于3 mL重蒸甲醇中，以756
型紫外分光光度计在波长254 nm处测定OD值，
以DA254 0.1 g-1 FW h-1为一个酶活力单位(U)。
2　结果
2.1　不同类型愈伤组织的体细胞胚发生
组织培养结果表明，不同类型的伏令夏橙愈
伤组织在继代培养中都能增殖，20 d时增殖最旺
盛。其中，V2I比其它材料生长速度快，并可见
零星畸形胚产生。转到分化培养基后，V2II仍然
可进行增殖生长，但无体细胞胚产生。而V2I在
第10天时可观察到愈伤组织表面有许多淡黄绿色
点，14~16 d时开始转变成绿色，20 d时大部分
愈伤组织转变成绿色胚状体(球形胚)，并不断增
加；30 d时绿色胚状体体积有所增加，并有少量
心形胚出现。V4和V6有胚状体产生，但不仅比V2I
数量少，而且发生的时间也要晚。各种材料的体
细胞胚发生情况见表1。
2.2　体细胞胚发生中Put含量的变化
继代的愈伤组织转入分化培养后，V2I的Put
含量在0~10 d呈迅速上升趋势，10 d后开始逐渐
下降，至30 d时仍保持较高水平。V4、V6的Put
变化与V2I的变化趋势大体相似，但整个过程中它
们的Put水平低于V2I。非胚性的V2II变化较复杂，
先是急剧下降，随后有所增加，30 d时降到另一
个水平(图1)。与胚性的V2I比较表明，V2II的Put
含量明显要低。
2.3　体细胞胚发生中Spd含量的变化
Spd含量的变化如图2所示，各种胚性愈伤组
织转入分化培养后的0~10 d中，Spd含量都略有
下降。随着细胞的分裂分化，当20 d球形胚形成
时，V2I、V4与V6的Spd含量比10 d时有显著的
表1　伏令夏橙不同类型愈伤组织的体细胞胚发生
Table 1　Frequency of somatic embryogenesis from different
calli of C trus sinensiscv. Valencia
Callus type Number of Number of embryoids/
flasks inoculated g FW calli
V2I 30 206±7.18A
V4 30 29±1.30B
V6 30 1.4±0.51C
V2II 30 0C
Means followed by different capital letters are different after
being tested by Duncan’s New Multiple Range Test at 1%
level. V2I: Diploid embryonic nucellus Calli; Major green globu-
lar embryoids, minor heart-shaped embryoids. V4: Quadploid
embryonic Calli; Green or white globular embryoids. V6:
Hexoploid embryonic Calli; Minor green or white globular
embryoids. V2II: Diploid non-embryonic nucellus Calli.
图1　伏令夏橙体细胞胚发生中Put含量的变化
Fig.1　Changes in endogenous Put content during somatic
embryogenesis in Citru sinensiscv. Valencia
277刘华英等: 伏令夏橙愈伤组织体细胞胚发生中多胺水平的变化3期
升高，推测此时Spd含量的升高可能与球形胚形
成有关，也可能是球形胚形成的结果，这有待于
做外源Spd处理实验后进一步验证。30 d时，V2I、
V4的Spd虽有下降但仍高于0 d，推测保持较高水
平的Spd可能有利于球形胚的进一步分化，而V6
的Spd则降到0 d以下。非胚性愈伤组织V2II的
Spd水平明显低于V2I，呈下降趋势，变化比较平稳。
2.4　体细胞胚发生中Spm含量的变化
Spm含量的变化如图3，随着体细胞胚的发
育，V2I的Spm水平逐步升高，30 d时，除有
大量球形胚外，还可观察到少量心形胚，并有大
量次生胚形成，表明Spm可能参与了球形胚的分
化发育，并可能与次生胚的形成有关。V4、V6中
Spm的早期变化与V2I 、V4和V6的Spd变化相似，
先下降，再上升，但后期继续增加。非胚性愈
伤组织的Spm含量低于胚性愈伤组织，它们在10
d形成峰值后持续下降。　
2.5　体细胞胚发生中多胺总量及Put/Spd的变化
在伏令夏橙体细胞胚发生中，Spd和Spm的
含量都远低于Put，因而多胺含量的变化(方向和
幅度)在很大程度上由Put的变化决定(图4)，体细
胞胚发生能力高的具有较高的多胺总量，二者呈
显著相关(P<0.05)。分析Put/Spd的变化(图5)发
现，体细胞胚发生能力强的V2I在转入分化培养后
比值增幅最大，0~10 d，Put/Spd呈显著上升趋
势；10~20 d，V2I、V4、V6的Put/Spd值都呈急
剧下降趋势。
2.6　外源Put对体细胞胚发生和内源多胺含量的影响
添加Put培养后，改善了V2I、V4的体细胞
胚发生状况，二者的体细胞胚发生频率分别由原
来每克鲜重含胚状体206和29升高到230和33，
各提高了11.65%和17.24%，都有显著差异(P<
0.05)，V4发生体细胞胚的瓶数也有所增加。同
时，Put处理影响了内源多胺含量(表2)。10 d时，
两种体细胞胚中的Put含量显著增加，分别是对照
(0 d)的1.54倍和1.76倍，Spd则降低，Put/Spd
图2　伏令夏橙体细胞胚发生中Spd含量的变化
Fig.2　Changes in endogenous Spd content during somatic
embryogenesis in Citru sinensiscv. Valencia
图3　伏令夏橙体细胞胚发生中Spm含量的变化　
Fig.3　Changes in endogenous Spm content during somatic
embryogenesis in Citrus sinensis cv. Val c a
图4　伏令夏橙体细胞胚发生中多胺总量的变化
Fig.4　Changes in total endogenous polyamines (PA) contents
during somatic embryogenesis in Citrus sinencv. Valenc a
图5　伏令夏橙体细胞胚发生中Put/Spd的变化
Fig.5　Changes in endogenous Put/Spd ratio during somatic
embryogenesis in Citrus sinensis.cv. Valencia
278 31卷 植物生理与分子生物学学报
表 2　 V2I和V4体细胞胚发生中内源多胺含量的变化及外源Put对内源多胺含量(nmol/g FW)的影响
Table 2　Changes in endogenous PA content and effects of Put on endogenous PA content (nmol/g FW) during somatic embryogenesis
in V2I and V4
Calli Days Put Spd Spm Total PA content Put/Spd
V2I 0 106.89±14.00 11.05±1.73 11.24±1.37 129.18±5.75 9.67
10 168.00±18.43 5.78±0.69 12.43±1.45 186.21±6.86 29.05
20 133.46±16.08 27.54±2.26 15.49±1.57 176.49±6.64 4.85
30 112.96±12.35 24.06±1.86 16.28±1.49 153.30±5.23 4.69
V4 0 84.59±9.22 8.30±0.64 3.32±0.26 96.21±3.37 10.19
10 124.29±15.29 7.49±0.61 3.06±0.21 134.84±5.37 16.59
20 94.91±14.61 14.21±1.09 8.93±0.84 118.06±5.51 6.68
30 35.73±3.44 11.81±0.75 14.23±1.85 61.77±2.01 3.02
V2I+Put 0 106.89±14.00 11.05±1.73 11.24±1.37 129.18±5.73 9.67
10 259.31±17.87 7.60±0.64 8.91±1.02 267.57±6.51 34.12
20 132.84±15.26 20.32±1.82 7.30±0.63 160.45±5.90 6.54
30 76.62±5.79 19.22±1.56 35.70±1.95 131.53±3.10 3.99
V4+Put 0 84.59±9.22 8.30±0.58 3.32±0.31 96.21±3.37 10.19
10 219.12±18.05 5.43±0.46 3.58±0.25 228.12±6.30 40.38
20 94.50±11.34 8.84±0.77 8.83±0.76 112.17±4.29 10.69
30 41.20±5.68 13.41±1.29 16.46±1.51 71.08±2.83 3.07
关键酶，Put含量变化与ADC活性变化相对应(图1、
6)，具有较高ADC活性的愈伤组织其Put含量和多
胺总量也较高，二者间呈显著正相关(P<0.05)，
说明Put和多胺总含量的增加与ADC活性有密切的
关系，因此它在调节多胺水平上起重要作用。
3　讨论
多胺对离体培养细胞分化形成体细胞胚有重
要意义，通过调节多胺水平可对其进行调控。胡
萝卜胚性愈伤组织中Put、Spm含量比非胚性的
高，随着体细胞胚发生，多胺含量逐渐升高
(Brudley和El-Fik 1984; Fienberg等1984)。枸杞
体细胞胚发生中，Put含量始终高于Spd和Spm，
并在多细胞原胚期形成高峰，而Spd和Spm峰值
则出现于胚性细胞分化期和球形胚期，胚性细胞
的分化与依赖于ADC的游离Put合成密切相关(邢
更妹等2002)。Put是茄子体细胞胚发生中的主要
多胺，抑制其合成将减少体细胞胚发生数，云杉
中也有相似结果(Yadav和Rajam 1998; Santanen和
Simola 1992)。本研究中，伏令夏橙体细胞胚发
生早期，多胺特别是Put的含量，随着胚性细胞
的分裂分化迅速增加(图1、表2)，细胞分裂越旺
盛，多胺合成越活跃，说明早期较高Put含量促
值明显提高，之后Put下降， Spd水平升高。Spm
在后期含量增加，尤其是V2I，在30 d时达到对
照的219.29%，可能与同期的Put比对照显著降
低，使其合成迅速增加有关。
2.7　伏令夏橙体细胞胚发生中ADC活性的变化
图6结果显示，三种胚性愈伤组织(V2I、V4、
V6)的ADC活性从0到10 d呈上升趋势，随后逐渐
下降；非胚性愈伤组织的ADC活性明显低于其相
应的胚性愈伤组织，而高ADC活性是细胞分裂的
前提。ADC是高等植物中催化精氨酸向Put转化的
图 6　伏令夏橙体细胞胚发生中ADC活性的变化　
Fig.6　Changes in ADC activity during somatic embryogenesis
in Citrus sinensiscv. Valencia
279刘华英等: 伏令夏橙愈伤组织体细胞胚发生中多胺水平的变化3期
进了细胞的分裂分化，与早期体细胞胚的形成密
切相关。外源Put处理，提高了V2I、V4的体细
胞胚发生频率，内源多胺水平也升高(表2)，进
一步证实了这一点。这与蕉柑活体中Put含量的上
升促进珠心胚原始体的启动一致(黄碧光等1997)。
ADC活性显著升高对早期Put的增加起重要作用。
随着体细胞胚发育，Put降低，Spd、Spm先后
达到最大值(图1~3)，可见它们在体细胞胚发生中
的作用不同。观察发现，虽然20 d、30 d时都
主要由球形胚组成，但与20 d相比，30 d时的
球形胚已出现一定分化，并可见少量心形胚，因
而Spd可能更多参与球形胚形成，而Spm与球形
胚的进一步发育有关，当然，这还需要做Spd、
Spm体外处理实验进一步验证。
茄子不同部位叶片和咖啡不同枝条叶片的体
细胞胚发生能力研究表明，它们与其多胺水平正
相关，而茶叶不同部位的胚性反应与多胺无明显
相关性(Sharma和R jam 1995; Pedroso等1997;
Calheiros等1994)。本文结果表明，伏令夏橙体
细胞胚发生能力与多胺水平呈正相关。V2I体细胞
胚发生能力强，其多胺水平也高，无体细胞胚发
生能力的V2II多胺水平则低。随倍性增加，V4、
V6的多胺含量下降，体细胞胚发生能力也降低(图
4、表1)。外源Put处理增加了内源多胺含量，体
细胞胚发生能力提高，说明外源Put能改善伏令夏
橙的体胚发生状况。这种改善与内源多胺水平的
升高密切相关。多胺水平的降低可影响细胞的分
裂分化，从而影响分化能力。因而V2II的多胺减
少可能是其丧失胚性能力的原因之一。Faure等
(1991)认为适当的Put/Spd值可提高葡萄体细胞胚
的质量，反之则可导致不正常的生长和过度的细
胞增殖。伏令夏橙体细胞胚发生的后期，观察到
从球形胚上高频率的产生次生胚，并且球形胚难
以进一步发育，必须转移到新的培养基上才能继
续发育成子叶胚，而此时V2I仍含有相当高的Put
水平(图1)，它们引起不正常的生长，可能是产
生次生胚和以后形成畸形子叶胚的重要影响因素。
多胺生物合成抑制剂DL-a-二氟甲基精氨酸
(DFMA)、甲基乙二醛双(脒基腙)(MGBG)等可降
低内源多胺水平，也相应抑制一些植物的体细胞
胚发生，这种抑制作用可为外源多胺所消除(邢更
妹等2002; Robie和Minocha 1989; Yadav和Rajam
1998)。本文用Put处理可调控内源多胺的含量，
并对体细胞胚发生有一定促进作用，如果将外源
多胺和多胺生物合成抑制剂结合起来进行研究，
将可进一步阐明多胺在植物体细胞胚发生中的作用。
参 考 文 献
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Changes in Polyamine Levels in Citrus sinensis Osb. cv. Valencia Callus
During Somatic Embryogenesis
LIU Hua-Ying1, XIAO Lang-Tao1*, LU Xu-Dong1, HU Jia-Jin1, WU Shun1, HE Chang-Zheng1, DENG
Xiu-Xin2
(1Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan Agricultural University, Changsha 410128,
China; 2National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract: Somatic embryogenetic capability and
changes in polyamine level and their relationship were
analyzed using the long-term (8 years) subcultured calli
of Citrus sinensis Osb. cv. Valencia as materials. The
results showed that endogenous polyamine contents
in embryogenic calli were higher than those in non-
embryogenic calli, and the embryogenetic capability
was positively correlated to the levels of endogenous
polyamines (Table 1, Fig.4). When the calli were trans-
ferred to a differentiation medium, the putrescine con-
tent rapidly increased and reached a peak, then fell
gradually (Fig.1). Applying exogenous putrescine raised
the embryogenesis frequency and endogenous pu-
trescine level (Table 2). It indicated that increase in
putrescine content at early stage of differentiation pro-
moted embryogenesis. With the development of so-
matic embryo, spermidine content reached its the high-
est level at globular embryo stage (Fig.2), spermine
content rose and reached a peak at a later stage of
globular embryo development (Fig.3). Furthermore,
changes of the putrescine, spermidine and spermine
contents during somatic embryogenesis were similar
in Valencia calli which had different ploidy levels, but
their contents decreased following the increasing of
ploidy level (Figs.1–3). Changes in arginine decarboxy-
lase activity (Fig.6) were positively correlated to the
polyamine levels, which suggest that the later is a key
factor in regulating the polyamine levels during so-
matic embryogenesis in citrus plants.
Key words: polyamines; somatic embryogenesis; citrus
This work was supported by Foundation for Returned Scholar
from Overseas of Chinese Ministry of Education (1999363).
*Corresponding author (E-mail: ltxiao@hunau.net; Tel: 0731-
4635259-8001).