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洋桔梗黄烷酮 3 －羟化酶基因的克隆
及其反义表达载体的构建
阮春燕，韦银凤，姚 超，陈崇顺
(南京师范大学生命科学学院 /江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，江苏南京 210023)
摘要:黄烷酮 3 －羟化酶(flavanone 3 － hydroxylase，F3H)是花青素生物合成途径中的关键酶，对花色的形成具有
重要作用。以洋桔梗试管苗叶片基因组 DNA为模板，通过设计分别带有酶切位点 BamH Ⅰ和 Xba Ⅰ的 1 对特异引
物，进行 PCＲ扩增，克隆了洋桔梗 F3H基因;对克隆得到的 F3H 基因进行测序鉴定，再将该基因反向插入 pBI121 质
粒，成功构建了植物反义表达载体 pBI121 － F3H，为利用植物基因工程技术调控洋桔梗 F3H 基因的表达提供了重要
基础。
关键词:洋桔梗;黄烷酮 3 －羟化酶基因;克隆;反义表达载体构建
中图分类号:Q943． 2;S682． 1 + 90． 1 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)11 － 0035 － 04
收稿日期:2013 － 04 － 26
基金项目:国家基础科学人才培养基金(编号:J1103507) ;江苏高校
优势学科建设工程项目。
作者简介:阮春燕(1990—) ，女，浙江宁波人，本科生，从事植物生物
技术与分子生物学研究。E － maill:695206842@ qq． com。
通信作者:陈崇顺，博士，主要从事植物生物技术与分子生物学研究。
E － mail:chenchongshun@ njnu． edu． cn。
洋桔梗［Eustoma grandiflorum (Ｒaf．)Shinn．］别称草原
龙胆，是龙胆科草原龙胆属的观赏植物。洋桔梗株态轻盈潇
洒，花形别致可爱，是国际上十分流行的切花和盆花种类之
一［1］。颜色、香味及形态是观赏植物的三大重要性状。随着
经济发展和社会进步，人们对花卉尤其是那些在色、香、形方
面能够标新立异的新品种的需求越来越强烈。其中，花的颜
色具有特别重要的审美价值，分子育种新技术———植物基因
工程可定向、高效获得更丰富和奇美的观赏植物新品种。
花青素广泛存在于被子植物中，对花色形成具有重要作
用。而黄烷酮 3 －羟化酶(flavanone 3 － hydroxylase，F3H)是
花青素生物合成途径中的关键酶［2］。研究表明，反义核酸技
术主要通过碱基互补原理，利用人工或生物合成特异互补的
DNA或 ＲNA片段(或化学修饰产物)与目的序列核酸结合，
通过空间位阻效应或诱导 ＲNase 活性的降解作用，在复制、
转录、剪接、mＲNA转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的基
因的表达［3 － 4］。
目前，F3H基因已经从多种植物的不同器官中克隆得
到，如红巴梨成熟果皮［5］、苹果果皮［6］、洋桔梗花瓣［7］、苦荞
幼苗［8］、芜菁块根［9］、龙眼胚胎［10］、猕猴桃内果皮［11］、非洲菊
花瓣［12］、核桃叶片［13］。Elomaa 等成功运用反义核酸技术调
控了非洲菊、金鱼草等植物中花青素生物合成相关酶基因的
表达［14 － 15］，进而改变了花色。
本研究以洋桔梗叶片为试材，提取基因组 DNA，通过设
计 1 对特异性引物，进行 PCＲ扩增，克隆 F3H基因;对该克隆
基因进行 DNA 序列测定、鉴定，再将其反向插入 pBI121 质
粒，构建洋桔梗 F3H 基因反义表达载体，为利用植物基因工
程技术调控洋桔梗 F3H基因的表达，进而改变其花色及创建
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DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.11.123
洋桔梗新种质提供重要基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料 洋桔梗(E． grandiflorum cv． Double Mari-
achi Pink)试管苗的叶片取自笔者所在实验室。
1． 1． 2 菌株与质粒 大肠杆菌 DH5α和 pBI121 质粒为笔者
所在实验室保存;pMDl8 － T 质粒购自宝生物工程(大连)有
限公司。
1． 1． 3 主要生化试剂 dNTP、IPTG、X － gal、Amp、Km、DNA
聚合酶、BamH Ⅰ、XbaⅠ限制性内切酶及 T4 － DNA 连接酶等
工具酶、质粒小提试剂盒均为宝生物工程(大连)有限公司产
品;植物基因组 DNA提取试剂盒、普通琼脂糖 DNA回收试剂
盒购自生工生物工程(上海)有限公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 洋桔梗基因组 DNA的提取 称取洋桔梗试管苗叶片
0． 1 g置于研钵，轻轻加入适量液氮进行研磨，参照植物基因
组 DNA提取试剂盒说明书，进行洋桔梗基因组 DNA的提取。
1． 2． 2 洋桔梗 F3H基因片段的克隆 以上述提取的洋桔梗
基因组 DNA 为模板，利用根据 NCBI GenBank 数据库中洋桔
梗 F3H基因 cDNA 序列(登录号:AB078956． 1)所设计的 P1
和 P2 为 1 对特异引物，进行 PCＲ扩增，以克隆洋桔梗 F3H基
因片段。
为方便后续试验操作，在 2 个引物的 5端分别引入了酶
切位点 BamHⅠ和 XbaⅠ，并外加 3 个保护碱基，具体序列为
(标有下划线的为酶切位点) :P1:5 － TGCGGATCCGAGGTAT
TATCGGAGGCAAT－ 3;P2:5 － CGCTCTAGAGAAGCAATAGG
TAAGACAA－3。
PCＲ 程序为:95 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 40 s，55 ℃ 复
性 55 s，72 ℃延伸 1 min，循环 35 次;72 ℃再延伸 10 min。在
PCＲ完成后，取 5 μL 反应产物，加样于 1%琼脂糖凝胶进行
电泳检测，随后参照普通琼脂糖 DNA 回收试剂盒说明书，回
收 PCＲ产物，送往美吉生物公司进行 DNA序列测定。
1． 2． 3 中间载体 pMD18 － T － F3H的构建 利用 TA 克隆方
法，以 T4 － DNA为连接酶，将用 DNA回收试剂盒回收的 F3H
基因 PCＲ扩增产物与 pMD18 － T 质粒进行连接重组;再将重
组子通过 CaCl2 法导入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，在含有
X － gal、IPTG、Amp的琼脂培养基平板上 37 ℃培养过夜;挑取
白色单菌落，进行菌落 PCＲ(PCＲ程序与 F3H 基因 PCＲ 克隆
相同) ，电泳检测;经菌落 PCＲ 初步鉴定正确后，再使用质粒
小提试剂盒从大肠杆菌 DH5α 中提取重组质粒，进行进一步
的酶切检测，以确认成功构建中间载体 pMD18 － T － F3H。
1． 2． 4 植物反义表达载体 pBI121 － F3H 的构建 对确认构
建成功的中间载体 pMD18 － T － F3H 进行 BamH Ⅰ和 XbaⅠ
双酶切，回收纯化约 1 500 bp 的 F3H 基因片段;对中间表达
载体 pBI 121 同样进行 BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切，回收纯化大
片段(约 2 700 bp) ;将上述回收纯化的 2 个片段用 T4 － DNA
连接酶进行连接重组，即将 F3H 基因片段反向插入 pBI121
质粒中，构建成植物反义表达载体 pBI121 － F3H，连接反应参
照 T4 － DNA连接酶说明书。然后将 pBI121 － F3H 导入大肠
杆菌 DH5α感受态细胞，在含有 Km 的琼脂培养基平板上
37 ℃ 培养过夜;挑取单菌落，进行菌落 PCＲ(PCＲ 程序与
F3H基因 PCＲ克隆相同) ，电泳检测，以确认成功构建植物反
义表达载体 pBI121 － F3H。
2 结果与分析
2． 1 洋桔梗基因组 DNA的提取
使用植物基因组 DNA 提取试剂盒提取洋桔梗基因组
DNA，提取结果完全符合后续试验要求(图 1)。
2． 2 F3H基因片段的克隆及其鉴定
以上述提取的洋桔梗 DNA 基因组为模板，根据洋桔梗
F3H基因 cDNA序列所设计的 P1 和 P2 为引物，进行 PCＲ 扩
增，扩增出了唯一 1 条条带，大约 1 500 bp(图 2)。回收纯化
该扩增产物，进行 DNA 序列测定，测序结果可确认 F3H 基因
片段克隆成功。
2． 3 中间载体 pMD18 － T － F3H的构建及鉴定
将克隆得到的 F3H 基因片段与 pMDl8 － T 连接重组，然
后转化大肠杆菌 DH5α。挑取白色单菌落，进行菌落 PCＲ 鉴
定。电泳结果(图 3)显示，扩增出了 1 500 bp左右的 F3H 片
段，与预期结果相符。该结果初步表明，重组子已经导入大肠
杆菌 DH5α中。再将重组子 pMD18 － T － F3H 经限制性内切
酶 BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切，检测结果(图 4)显示，得到 3 条
条带，从上而下:第 1 条大小为 4 200 bp 左右，是重组子
pMD18 － T － F3H;第 2 条大小为 2 700 bp左右，为 pMD18 － T
载体;第 3 条大小为 1 500 bp左右，为 F3H 基因。结果表明，
中间载体 pMD18 － T － F3H已经构建成功。
2． 4 F3H基因片段序列的测定及分析
2． 4． 1 F3H基因片段序列的测定 洋桔梗叶片基因组黄烷
酮 3 －羟化酶(F3H)基因片段测序结果见图 5。
2． 4． 2 F3H基因片段序列的分析 利用 GenBank中的 Blast
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工具，对测序结果(全长 1 427 bp)与 NCBI GenBank上公布的
从洋桔梗花瓣黄烷酮 3 －羟化酶(F3H)基因 mＲNA 而来的
cDNA 序列进行比较发现，本研究从洋桔梗叶片基因组扩增
出的 F3H基因片段，比从洋桔梗花瓣分离得到的 F3H基因片
段的 cDNA多了 1 段序列，推测是 1 个内含子(图 5 中标有字
符底纹的序列)。
利用 DNAMAN对本研究所获得的上述 F3H 基因片段序
列进行限制性内切酶酶切位点分析，其主要酶切位点见表 1。
2． 5 反义表达载体 pBI121 － F3H的构建及鉴定
将重组子 pMD18 － T － F3H 与质粒 pBI121 分别经限制
性内切酶 BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切，用 T4 － DNA连接酶连接、
回收、纯化后，转化大肠杆菌 DH5α。挑取单菌落进行菌落
PCＲ鉴定，电泳结果(图 6)显示，得到 1 条约 1 500 bp左右的
条带。结果表明，F3H基因反义表达载体 pBI121 － F3H 已经
构建成功。
3 结论与讨论
F3H是花青素生物合成途径中的关键酶。F3H基因已
表 1 F3H基因片段序列进行限制性内切酶酶切位点
限制性内切酶 识别位点
酶切位点数
(个)
酶切位点位置
(bp)
BamHⅠ G /GATCC 1 1
Bsc91Ⅰ GAAGACNN / 1 181
HpaⅠ GTT /AAC 1 258
BalⅠ TGG /CCA 1 275
NdeⅠ CA /TATG 2 545、918
Mfe1Ⅰ C /AATTG 3 564、752、1 133
SsPⅠ AAT /ATT 1 941
BsmⅠ GAATGCN / 1 1 092
BbeⅠ GGCGC /C 2 1 159、1 219
EheⅠ GGC /GCC 2 1 157、1 217
Bsp1407Ⅰ T /GTACA 1 1 238
Bg1Ⅱ A /GATCT 1 1 352
XbaⅠ T /CTAGA 1 1 419
经从多种植物的多种不同器官中克隆得到。不同器官包括花
瓣、果皮、胚胎、块根、植株叶片等，其中大多数种类试材的取材
时间都受到某种程度的限制。本研究试材取自笔者所在的实
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验室增殖保存的洋桔梗试管苗叶片。以该试材提取的基因组
DNA为模板，进行同源克隆 PCＲ 扩增，只扩增出 F3H 基因唯
一 1条条带;测序后，与从花瓣中 cDNA 所获得的 F3H 基因进
行序列比对，除了内含子之外，外显子的序列完全相同［7］。
与众多相关研究通过 cDNA 进行克隆不同的是，本研究
选以洋桔梗基因组 DNA 为模板，利用同源克隆的方法，进行
F3H基因的克隆。本研究的目的是为进一步利用植物基因
工程技术调控洋桔梗 F3H 基因的表达提供重要基础。已有
研究表明，在反义核酸技术的应用中，来源于植物基因组的
DNA转化植物后对内源基因的抑制效果与来源于 mＲNA 的
cDNA 相当甚至更明显［16］。
本研究克隆的是洋桔梗 F3H 基因的片段，非全长序列。
Smith等将 PG cDNA 5端的 730 bp 片段反向插入，接上
CaMV 35S启动子和 Nos基因 3末端，构建了一个反义融合基
因，将其转入农杆菌，转化番茄茎段，在转基因叶中和果实中
都发现了反义 PG ＲNA，其 PG酶活性只有正常株的 10%［17］。
而 Sheehy等用全长的 PG cDNA 进行上述同样的试验，测定
结果表明，在果实成熟的各个阶段 PG ＲNA 和 PG 酶的水平
也大大降低［18］。余义勋等用香石竹基因组 ACC 氧化酶基因
DNA片段(非全长基因)构建反义表达载体，转化香石竹，结
果表明，反义基因能有效抑制内源同源基因的表达［16］。
本研究以周年可取的洋桔梗试管苗叶片为试材，提取基
因组 DNA，通过设计 1 对特异性引物，进行 PCＲ扩增，克隆了
F3H基因，再将其反向插入 pBI121 质粒，成功构建了洋桔梗
F3H 基因反义表达载体，为利用植物基因工程技术调控洋桔
梗 F3H基因的表达，并改变了花色。同时，本研究结果为创
建洋桔梗新种质提供了技术贮备。
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