全 文 ：周旭红 ,莫锡君 ,蒋亚莲 ,等.激素 、蔗糖浓度和取材时间对洋桔梗花药培养的影响 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(2):98-100.
激素 、蔗糖浓度和取材时间对洋桔梗花药培养的影响
周旭红 , 莫锡君 , 蒋亚莲 , 吴　旻 , 龙　江 , 李　荣 , 桂　敏
(云南省农业科学院花卉研究所 /云南省花卉育种重点实验室 /云南省花卉工程中心 ,云南昆明 650205)
　　摘要:以洋桔梗品种 CeremonyOrange的花药为材料 , 探讨激素 、蔗糖浓度和取材时间对洋桔梗花药培养的影响。
结果表明:(1)不同的取材时间 、激素水平对洋桔梗愈伤组织诱导率不同;(2)随着供试植株年龄增长 , 洋桔梗花药愈
伤组织分化率逐渐下降;(3)3月份是洋桔梗花药培养的最佳时期。
　　关键词:花药培养;激素水平;洋桔梗;取材时间
　　中图分类号:S681.9　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0098-02
收稿日期:2010-05-21
作者简介:周旭红(1978—),女 ,湖南永州人 ,硕士 ,助理研究员 ,主要
从事花卉育种技术的研究。 E-mail:zhouxuhong7801@ 126.com。
通信作者:桂　敏,女 ,副研究员 ,主要从事花卉种苗生产及原种繁育
技术体系研究。 E-mail:gming-114@163.com。
　　洋桔梗为龙胆科(Gentianaceae)观赏植物 ,原产于北美
洲 ,其株态轻盈 ,花色典雅 ,花形别致 ,茎秆、叶片光洁动人 ,是
近年来国际上流行的一种高档切花。我国各地竞相引种栽
培 ,极具市场开发前景 。但其种源主要是从国外进口 F1杂
种 ,价格昂贵 ,给洋桔梗切花生产带来一定的困难 。进行洋桔
梗花药培养产生单倍体植株 ,单倍体植株经秋水仙素加倍处
理能够产生纯合自交系 ,可为 F1代种子生产提供优良的亲本
材料 。因此 ,开展花药培养研究在洋桔梗的遗传育种中具有
重要的理论与实践意义 。花药培养受基因型 、供体植株的生
长状态 、小孢子的发育时期、花蕾或花药的预处理方法和培养
条件等因素的影响 。国内外很少有洋桔梗花药培养方面的报
道 。本试验通过研究激素和供试植株的年龄对洋桔梗花药培
养的影响 ,探讨洋桔梗花药培养再生植株产生的适宜条件 ,为
洋桔梗育种提供理论和实践基础 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料为市场上流行品种 CeremonyOrange, 于
2006年 3月播种 , 2006年 5月定植 ,至 2007年 3月到 5月采
收花蕾。从 3月到 5月 ,每隔 2周采集 、培养花药 。分别统计
3、4、5月愈伤形成的个数和形成再生植株愈伤的个数 。
1.2　试验方法
取花萼与花冠等长或花冠稍长于花萼时的花蕾 , 4 ℃预
处理 1 ～ 3d后 ,用 5%的次氯酸钠溶液消毒 10 min后 ,再用
无菌水冲洗 3次;用高压灭菌的滤纸吸干花蕾上面的水分 ,剥
取花药 ,除去花丝 。将花药接种在诱导培养基上 ,每个培养瓶
接种 10个花药 , 2个月后统计愈伤的个数 。再将愈伤转入再
生培养基中 , 2个月后统计产生再生植株的愈伤个数 。
以 MS为基本培养基 ,附加不同浓度的蔗糖 、激素 , 0.8%
琼脂粉 , pH值 5.8。培养基在 121 ℃高压锅内灭菌 20 min。
诱导培养基为:(1)1 mg/LKT(激动素)+2.5 mg/L2 , 4-D
(2, 4-二氯苯氧乙酸 )+60 g/L蔗糖;(2)1 mg/LKT+
3 mg/L2 , 4 -D+30 g/L蔗糖;(3)1 mg/LKT+2.5 mg/L
2 , 4-D+30g/L蔗糖 。再生 培养 基 为 2.5 mg/LKT+
0.5 mg/LNAA+30 g/L蔗糖 。接种后的材料放在温度
(26±2)℃、光照强度 1 500 lx、光照时间 8h/d的培养室内 。
用 SPSS11.5软件统计花药的出愈率和再生愈伤数 ,出愈
率 =产生的愈伤组织数 /接种花药数 ×100%;分化愈伤率 =
分化愈伤组织数 /接种愈伤组织数 ×100%。
2　结果与分析
2.1　激素和蔗糖浓度对洋桔梗花药愈伤组织诱导的影响
洋桔梗花药接种后 10 d左右 ,在花药的表面形成愈伤组
织 。愈伤组织为黄白色 ,质地较密实(图 1-A)。接种 2个月
后统计愈伤组织诱导率 ,结果见表 1。试验结果显示 , 3月取
材 ,附加 1mg/LKT+3mg/L2 , 4-D+30g/L蔗糖诱导愈伤
率最高 ,达到 77.1%,显著高于附加 1 mg/LKT+2.5 mg/L
2 , 4-D+60g/L蔗糖的培养基;4月取材 ,附加 1 mg/LKT+
2.5 mg/L2 , 4-D+30g/L蔗糖诱导愈伤率最高 ,达到 42%,
极显著高于附加 1mg/LKT+2.5 mg/L2, 4-D+60 g/L蔗
糖的培养基;5月取材 ,附加 1 mg/LKT+3 mg/L2 , 4-D+
30g/L蔗糖诱导愈伤率最高 , 达到 84.1%,显著高于附加
1 mg/LKT+2.5mg/L2, 4-D+30 g/L蔗糖的培养基 。
2.2　同一培养基不同取材时间对洋桔梗花药愈伤组织诱导
的影响
以 CeremonyOrange为材料 ,研究了不同取材时间对洋桔
梗花药愈伤组织诱导的影响 。表 2结果表明 , 附加 1 mg/L
KT+2.5 mg/L2 , 4-D+60 g/L蔗糖的培养基 ,在 5月取材
时 ,诱导愈伤率最高 ,达到 73.1%,显著高于 3、4月取材的花
药愈伤诱导率;附加 1mg/LKT+3 mg/L2 , 4-D+30g/L蔗
糖的培养基 ,在 5月取材时 ,诱导愈伤率最高 ,达到 84.1%,
极显著高于 4月取材的花药愈伤诱导率;附加 1 mg/LKT+
2.5 mg/L2 , 4-D+30g/L蔗糖的培养基 ,在 5月取材时 ,诱
导愈伤率最高 ,达到 70%,极显著高于 4月取材的花药愈伤
诱导率 。
2.3　不同的取材时间对洋桔梗花药愈伤组织分化的影响
将愈伤组织转移到再生培养基进行分化培养时 ,部分愈
伤组织转绿 ,有些愈伤组织出现芽的分化(图 1-B),将其转
移至生根培养基后分化出根 ,形成再生植株(图 1-C)。不同
的取材时间洋桔梗花药愈伤组织分化率都有差异(表 3)。结
—98— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.02.143
表 1　 3— 5月份诱导培养基中激素和蔗糖浓度对
洋桔梗花药愈伤组织诱导的影响
取材
时间
KT
(mg/L)
2, 4-D
(mg/L)
蔗糖
(g/L)
花药数
(个)
愈伤数
(个)
出愈率
(%)
3月 1 2.5 60 126 69 54.8±8.4bA
1 3 30 120 93 77.1±4.8aA
1 2.5 30 132 87 68.9±6.2abA
4月 1 2.5 60 150 27 18±4.9bB
1 3 30 153 54 35±5.8aAB
1 2.5 30 150 63 42±6aA
5月 1 2.5 60 162 114 73.1±4.7abA
1 3 30 228 186 84.1±3.3aA
1 2.5 30 114 72 70 ±5.2bA
　　注:同一月份同列数据后不同的大写字母表示 1%差异水平 ,小写字母表
示 5%差异水平。
表 2　取材时间对洋桔梗花药愈伤组织诱导的影响
KT
(mg/L)
2, 4-D
(mg/L)
蔗糖
(g/L)
取材
时间
花药
个数
愈伤数
(个)
出愈率
(%)
1 2.5 60 3月 126 69 54.8±8.4bA
4月 150 27 18±4.9cB
5月 162 114 73.1±4.7aA
1 3 30 3月 120 93 77.1±4.8aA
4月 153 54 35 ±5.8bB
5月 228 186 84.1±3.3aA
1 2.5 30 3月 132 87 68.9±6.2aA
4月 150 63 42±6bB
5月 114 72 70±5.2aA
　　注:同一激素处理同列数据后不同的大写字母表示 1%差异水平 ,小写字
母表示 5%差异水平。
表 3　取材时间对洋桔梗花药愈伤组织分化的影响
取材时间 愈伤数(个)
分化愈伤
(个)
分化愈伤率
(%)
3月 116 14 11.1±2.0
4月 100 8 6.8±3.3
5月 146 0 0
果表明 , 3月取材时 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率最高 ,达到
11.1%;4月取材时 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率为 6.8%;而
5月取材时 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率为 0。
3　结论与讨论
3.1　不同的激素和蔗糖浓度对洋桔梗花药愈伤组织诱导的
影响
培养基中激素的种类 、用量和配比 ,对诱发小孢子启动 、
分裂 、生长和分化具有作用 [1 ] 。陈晓等研究认为 , 2, 4-D对
许多作物花粉的启动 、分裂 、形成愈伤组织和胚状体起着决定
性的作用 [ 2] , KT具有促进愈伤组织形成茎叶的作用 [ 3 ] 。许
多研究表明 ,单一激素成分培养的效果较差 ,合理的激素配比
是保证组培效果的基础 [ 4 -5] 。本研究中 , 3月取材时 ,附加
1 mg/LKT+3mg/L2 , 4-D+30g/L蔗糖诱导愈伤率最高 , 4
月取材时 ,附加 1mg/LKT+2.5 mg/L2 , 4-D+30 g/L蔗糖
诱导愈伤率最高 , 5月取材时 ,附加 1 mg/LKT+3 mg/L2 , 4
-D+30g/L蔗糖诱导愈伤率最高 。可见不同的取材时间和
激素浓度对洋桔梗的愈伤组织诱导率不同。
3.2　取材时间对洋桔梗花药愈伤组织诱导的影响
本研究中 ,附加 1mg/LKT+2.5 mg/L2, 4-D+60g/L
蔗糖的培养基 ,在 5月取材时 ,诱导愈伤率最高 , 3月其次 ,
4月最低;附加 1 mg/LKT+3 mg/L2 , 4-D+30 g/L蔗糖的
培养基 ,在 5月取材时 ,诱导愈伤率最高 , 3月其次 , 4月最低;
附加 1 mg/LKT+2.5mg/L2, 4-D+30 g/L蔗糖的培养基 ,
在 5月取材时 ,诱导愈伤率最高 , 3月其次 , 4月最低 。可见 ,
不同的培养基 ,在 5月取材时 ,诱导愈伤率最高 , 3月其次 , 4
月最低 。
3.3　不同的取材时间对洋桔梗花药愈伤组织分化的影响
Kristiansen等研究表明 ,温度和供试植株的年龄对辣椒
小孢子的胚状体形成起着重要的作用 。最适宜的培养温度是
26℃,且随着供试植株的年龄的增长 ,胚状体的形成率下
降 [6 ] 。Ercan等的研究表明 ,在冬季和夏季 ,供体植株的年龄是
影响花药培养的重要因素 [ 7] 。相反 ,在油菜的研究中 ,年老的
植株比年幼的植株花药培养的效果好[ 8 ] 。本试验中 , 3月取材
时 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率最高 , 4月其次 ,而 5月取材
时 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率为 0。由此可见 ,随着供试植
株的年龄的增长 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率逐渐下降 。
不同的培养基 ,在 5月取材时 ,诱导愈伤率最高 , 3月其
次 , 4月最低;但 3月取材时 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率最
高 , 4月其次 ,而 5月取材时 ,洋桔梗花药愈伤组织分化率为
0。因此 ,在本试验中 , 3月是洋桔梗花药培养的最佳时期 。
总之 ,不同的取材时间和激素水平对洋桔梗的愈伤组织
诱导率不同;随着供试植株年龄的增长 ,洋桔梗花药愈伤组织
分化率逐渐下降;在本试验中 , 3月是洋桔梗花药培养的最佳
时期 。
参考文献:
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的影响 [ J].西北农林科技大学学报:自然科学版 , 2006, 34(9):
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(下转第 100页)
—99—周旭红等:激素 、蔗糖浓度和取材时间对洋桔梗花药培养的影响
陈文强 ,邓百万 ,彭　浩 ,等.1株产紫杉醇内生真菌的原生质体制备与再生 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(2):100-102.
1株产紫杉醇内生真菌的原生质体制备与再生
陈文强 , 邓百万 , 彭　浩 , 刘开辉 , 丁小维 , 解修超 , 王乃嘉
(陕西理工学院生物科学与工程学院 /西省食药用菌工程技术研究中心 ,陕西汉中 723001)
　　摘要:对 1株产紫杉醇的内生真菌的原生质体的制备与再生进行了研究。 结果表明 , 原生质体制备的最佳条件
是 1.33%纤维素酶 +2.66%蜗牛酶的酶解液 , 酶解时间 6 h, 稳渗剂为 0.7 mol/LNaCl,酶解温度 30 ℃, 酶解 pH值
6.0, 原生质体产量 524万个 /mL, 原生质体细胞再生频率为 21.47%。
　　关键词:紫杉醇;内生真菌;原生质体;最佳条件
　　中图分类号:Q933　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0100-03
(上接第 99页)
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　　紫杉醇是一种复杂的具有抗癌活性的二萜生物碱 ,最早
由美国的 Wani等从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中分离出来
的 [ 1-2 ] 。在生物体内 ,紫杉醇的作用机理是抑制微管蛋白的
解聚 ,破坏细胞微管的功能 ,从而影响纺锤体的形成 ,抑制肿
瘤细胞的有丝分裂;在临床上 ,用于治疗乳腺癌 、卵巢癌 、绒毛
膜癌 、子宫癌等人体多种恶性肿瘤。紫杉醇产生菌 (Nodulis-
poriumsylviforme)是周东坡等在 1993年从东北红豆杉(Taxus
cuspidata)韧皮部分离到的一种内生真菌 ,为中国新记录的
1种属———多节孢属 ,紫杉醇产量最初经高效液相色谱测定
为 51.06 ～ 125.70 μg/L,较 1993年以前报道的其他菌种发
酵单位高 ,是一种很有前途的紫杉醇产生菌 [ 3] 。
地球人口和癌发率呈暴发性增长 ,人们对紫杉醇的需求
量亦明显增大 。除了从红豆杉树皮中提取外 ,科技工作者一
直在尝试利用其他的方法得到紫杉醇 ,并取得了不少突破性
的进展 ,诸如化学合成法 、半化学合成法和细胞组织培养生产
等 [ 4-6 ] 。化学全合成法虽然在体外合成了紫杉醇 ,但此方法
成本高且产量不高;半化学合成法是借助从植物组织中分离
纯化的前体为底物进行紫杉醇合成 ,然而前体物的分离仍较
为困难 ,并且同样需要以大量红豆杉为原料 。用植物细胞组
织培养的方法生产紫杉醇较为简单 ,但目前得到的产量仍较
低 ,而且存在一些影响产量的不稳定因素 [ 7 ] 。
近年来 ,利用基因工程技术进行菌种选育工作取得了令
收稿日期:2010-06-17
基金项目:陕西省教育厅重点科研项目(编号:Z21);陕西省 “ 13115”
科技创新工程计划(编号:8IDGC-04)。
作者简介:陈文强(1957—),男 , 教授 ,硕士生导师 ,主要从事微生物
资源的保护 、开发和利用。 E-mail:wenqiangc@126.com。
人瞩目的成绩 ,传统的物理及化学诱变方法是国内外提高工
业生产菌产量的重要手段 。原生质体是细胞去除坚韧的细胞
壁后对渗透压极为敏感的球质体 ,它保持着细胞的生理生化
和遗传学的特性和功能 [ 8-9] ,去除细胞壁的原生质体对环境
更加敏感;同时 ,细胞壁的缺失大大提高了遗传物质交换和重
组的频率 ,另外 ,在一定条件下可恢复成为一个具壁细胞 。因
此 ,原生质体是生理学 、遗传学以及生物工程的重要试验材
料 。从 20世纪 80年代开始 ,许多学者就在原生质体融合 、诱
变育种 、单核和同核育种及转化等方面进行了大量研究 ,并取
得了令人瞩目的成果 [ 10 -11] 。制备原生质体是为了除去紫杉
醇产生菌细胞壁对紫外线的阻碍作用 。原生质体形成率越
高 ,则诱变的概率越大 。因此 ,原生质体诱变育种已成为一种
菌种选育的较新的生物技术手段 。微生物诱变育种在发酵工
业的菌种选育中独占鳌头 ,国内外发酵工业中采用的各种生
产菌种品系绝大多数是诱变菌株 。诱变育种除能提高代谢产
物外 ,还可达到改进产品质量 、扩大品种和简化生产工艺等的
效果 。通过原生质体诱变 ,选育产紫杉醇内生真菌的高产菌
株 ,发挥菌株的遗传潜力 ,提高菌株的紫杉醇产量 ,为微生物
发酵法生产紫杉醇且早日实现工业化生产奠定基础 ,从根本
上解决紫杉醇药源不足的问题 。目前 ,对内生真菌产紫杉醇
的试验已有大量研究 ,而采用诱变产紫杉醇内生真菌的原生
质体尚未见报道 。本研究就 1株产紫杉醇内生真菌的原生质
体制备的酶液种类 、酶解时间 、稳渗剂 、酶解温度 、pH值等影
响因素进行分析 ,筛选出适合产紫杉醇内生真菌的原生质体
分离与再生条件 ,为诱变育种奠定基础 ,进一步培育优良品
种 ,为更好开发利用内生真菌这一珍贵的资源奠定基础 。
—100— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期