全 文 ：文章编号:1001-4829(2009)05-1424-04
　　收稿日期:2009-02-05
　　基金项目:云南省科技攻关计划(2006NG14);云南省人才培养
计划(2006PY04)
作者简介:王丽花(1977-), 女 ,助理研究员 , 主要从事花卉生
物技术研究 , ＊为通讯作者 , E-mail:qusuping2002@sina.com。
洋桔梗花药离体培养与完整植株的诱导
王丽花 1 ,杨秀梅 1 ,桂　敏 2 ,瞿素萍 1＊ ,苏　艳1 ,周旭红 2
(1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所,云南 昆明　650205;2.云南省农业科学院花卉研究所 ,云南 昆明　650205)
摘　要:以 9个不同类型的洋桔梗品种为试材 ,研究了花药离体培养中胚状体的诱导及再生。结果表明:基因型是限制花药培养
成胚的关键因素 , 9个品种中 ,有 4个品种获得了胚状体及再生苗 ,再生率为 3.8% ～ 16.0%。用根尖染色体鉴定法鉴定了再生株
的倍性 ,再生株群体的倍性组成比较复杂 ,以二倍体为主。
关键词:洋桔梗;花药培养;植株再生
中图分类号:S681.9　　　文献标识码:A
InVitroAntherCultureandPlantInductionofEustomarusselianum
WANGLi-hua1 , YANGXiu-mei1 , GUIMin2 , QUSu-ping1＊ , SUYan1 , ZHOUXu-hong2
(1.QualityStandardandTestingTechnologyInstitute, YunnanAcademyofAgriculturalSciences, YunnanKunming650205, China;2.
FlowerResearchInstitute, YunnanAcademyofAgriculturalSciences, YunnanKunming650205, China)
Abstract:Antherof9genotypesofEustomarusselianumhavebeenculturedinvitroandinducedtoundergoembryogenesisandplantforma-
tion.Theresultsindicatedthatinthe9genotypesevaluated, fourcultivarsregeneratedembryoidandshoots(3.8%-16.0%).Thegeno-
typewasthemainfactortoinfluencetheembyogenesis.Chromosomecountinginroottipsofploidylevelofanther-derivedplantswascaried
out.Theresultshowedthatthemainanther-plantwasdiploid.
Keywords:Eustomaruselianum;Antherculture;Plantinduction
　　洋桔梗(Eustomaruselianum)又名草原龙胆或
土耳其桔梗 ,为 1 ～ 2年生龙胆科草原龙胆属观赏植
物 ,原产北美洲 ,其株态轻盈潇洒 ,花色典雅明快 ,花
形别致可爱 ,是目前国际上十分流行的盆花和切花
种类之一[ 1] 。现中国各地竟相引种栽培 ,极具市场
开发前景 ,但其种源主要是从国外进口 F1杂种 ,价
格昂贵 ,给洋桔梗在中国的规模化生产带来了一定
的困难 [ 2] 。花药离体培养作为人工诱导单倍体的
有效技术 ,是生物技术在农作物育种中应用最广泛 、
最有成效的方法之一 ,在快速获得纯合体 、高效利用
种质资源和提高选育效率中有一定的理论和应用价
值 [ 3] 。人们对此曾做过许多探索工作 , 先后对百
合 [ 4] 、羽衣甘蓝[ 5] 、水稻[ 6 ～ 7] 、辣椒 [ 8] 、番木瓜 [ 9] 、大
麦 [ 10]等作物进行过研究 ,并成功获得部分单倍体植
株 ,但关于洋桔梗花药培养未见报道 。本文以洋桔
梗花药为外植体进行诱导与再生研究 ,成功获得了
再生植株 ,使通过花药培养快速获得单倍体或纯合
二倍体成为可能 ,对后续开展细胞工程和生物技术
育种具有一定的参考价值。
1　材料与方法
1.1　材料
以 9个不同的洋桔梗品种为试材 ,于花蕾未开
放前采切 , 品种分别为 E04005、 EM9、 E07009、
E14009、1387、E04001、EB1、EM1和 1374,均来自云
南省农业科学院花卉研究所。 9个品种的花色 、性
状等如表 1。
1.2　培养基
以 MS为基本培养基 ,采用以下最适培养基:①
花药愈伤组织诱导和继代培养基:MS+2, 4-D2.0
mg/L+KT2.0 mg/L+NAA0 .1mg/L;②植株再生
(胚状体发生)培养基:MS+KT2.0mg/L+NAA0.
1mg/L;③植株继代培养基:MS+BA0.2 mg/L+
1424
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2009年 22卷 5期
Vol.22　　No.5
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2009.05.050
表 1　洋桔梗花药培养中所用试材
Table1　E.russelianumcultivarsforantherculture
试材编号 品种名称 花色 性状 所属系列
E1 E04005 白色 重瓣 典礼系列
E2 EM9 白色 重瓣 玛丽系列
E3 1374 蓝晕 单瓣 拉古纳系列
E4 E14009 乳黄色 单瓣 欢迎系列
E5 1387 蓝晕 重瓣 卡塔琳娜系列
E6 E04001 淡紫色 重瓣 典礼系列
E7 EB1 蓝白双色 重瓣 玛丽系列
E8 EM1 蓝色 重瓣 玛丽系列
E9 E07009 黄色 单瓣 舞曲系列
KT0.3 mg/L+GA0.3mg/L+NAA0.1mg/L;④
壮苗培养基为:不含激素的 MS培养基;⑤生根培养
基:1/2MS+NAA0.6 mg/L。以上各种培养基均添
加 3.0%蔗糖和 0.6 %琼脂 , pH5.8。
1.3　外植体处理
取不同大小的未开放花蕾 ,拨取花药 ,于载玻片
上捣碎 ,用 4, 6-二酰胺 -2苯基吲哚(DAPI)进行荧光
染色 , NikonUFX-A型荧光显微镜下观察小孢子发育
时期。并于植株开花期(3 ～ 5月)选择较佳时期的
新鲜花蕾(图 1-a),外包一层保鲜膜 ,置于 3℃条件
下处理 48 h后 , 用自来水冲洗 3 ～ 4次 ,无菌条件
下 ,用 70%酒精擦拭花蕾表面 ,剥去外层花瓣 ,保留
内层花瓣 ,后用 10%次氯酸浸泡 4 min,期间不断摇
动 ,再用无菌水冲洗 3 ～ 4次后置于无菌的吸水纸
上 ,放于超净台上 ,待用。
1.4　培养条件
在无菌的培养皿上用尖细镊子挑取花药 ,横切
为两段 ,放于装有培养基①的口径为 6.5cm的培养
瓶中连续暗培养诱导愈伤组织(图 1-b)。接种花药
7 ～ 15 d后可见愈伤组织从药壁开始产生 , 30d后
表 2　不同洋桔梗品种花药培养的花蕾大小
Table2　BudsizeforanthercultureindiferentcultivarsofE.rus-
selianum
试材编号
Codes
花蕾大小(cm)
Budsize
试材编号
Codes
花蕾大小(cm)
Budsize
E1 1.8～ 2.4 E6 2.5 ～ 3.1
E2 1.9～ 2.7 E7 2.5 ～ 3.0
E3 2.0～ 2.5 E8 2.4 ～ 3.0
E4 2.5～ 3.0 E9 2.1 ～ 2.9
E5 2.3～ 3.0
形成愈伤组织团(图 1-c),把愈伤组织团转入培养
基②上光培养诱导胚状体和芽苗(图 1-d),每天光
照 16 h,光照强度 20 ～ 30 μmol/m2 /s,培养温度 25
～ 26℃。在培养 50 ～ 60d期间 ,部分愈伤组织再生
出绿色芽苗及子叶型胚状体(图 1-e),分别统计愈
伤组织诱导率和芽苗再生率 。当芽苗伸长至 0.5 ～
1.0 cm时将其转接于培养基 ③上继代培养(图 1-
f),待小苗长至 1.5cm左右时 ,将苗从基部切下 ,移
入培养基④进行生根培养(图 1-g)。
1.5　染色体观察
无根苗根长至 0.5 cm左右时切取根尖进行预
处理(固定 、离析及染色),后在显微镜(NikonE800
型)下压片镜检 , 采用根尖染色体计数法观察倍
性[ 9, 11] 。于室温下以 5种方法进行预处理:①0.1
%秋水仙素处理 5h;②0.1 %秋水仙素处理 6h;③
0.05 %秋水仙素处理 5 h;④0.05 %秋水仙素处理
12 h;⑤0.025 %秋水仙素处理 24 h。
2　结果与分析
2.1　适合花药培养的花蕾大小
大多数研究表明 ,选择合适的花粉发育时期是
提高花粉植株诱导频率的重要因素 ,处于单核晚期
表 3　不同洋桔梗品种诱导愈伤组织的情况
Table3　CalusinductionindiferentcultivarsofE.ruselianum
试材编号
Codes
横切花药接种数
Anthers
愈伤组织数
Callus
愈伤组织诱导率(%)
Inductionrates
愈伤状况
Conditionofcallus
E1 46 38 82.6 颗粒小 、致密
E2 28 25 89.3 颗粒大 、致密
E3 28 20 71.4 颗粒小 、疏松
E4 40 32 80.0 颗粒小 、疏松
E5 30 26 86.7 颗粒大 、疏松
E6 42 38 90.5 颗粒大 、疏松
E7 28 26 92.9 颗粒大 、疏松
E8 22 16 72.7 颗粒小 、疏松
E9 42 35 83.3 颗粒大 、致密
14255期 　　　　　　王丽花等:洋桔梗花药离体培养与完整植株的诱导
表 4　洋桔梗不同品种的芽再生率
Table4　RegenerationrateofshootsindiferentcultivarsofE.rus-
selianum
试材编号
Codes
愈伤组织数
Calus
再生不定芽数
Regeneration
shoots
不定芽的再生率(%)
Regenerationrate
E1 38 3 7.9
E2 25 4 16.0
E3 20 0 0
E4 32 0 0
E5 26 1 3.8
E6 38 0 0
E7 26 0 0
E8 16 0 0
E9 35 5 14.3
的小孢子最适合花药培养 [ 12 ～ 13] 。对不同洋桔梗品
种的小孢子发育时期进行观察 ,发现不同基因型处
于单核晚期所对应的花蕾大小大致相同 ,范围在 2
～ 3cm(表 2)。
2.2　花药愈伤组织的诱导
横切的花药接种到培养基 ①中 7 d后 ,花药开
始膨大 ,部分花药的药壁周围出现结晶状细小颗粒;
7 d后 ,出现愈伤组织 ,呈白色或淡黄色颗粒状;30d
左右愈伤组织增殖到最大 ,为疏松或致密的规则或
不规则团 , 40 d以后开始出现老化现象 ,愈伤组织
逐渐变褐 、变黑和坏死 ,因此 ,愈伤组织每培养 30 d
左右必须及时转移或继代。不同品种愈伤组织诱导
的情况不同(表 3)。
　　从表 3可看出 ,供试材料在培养基①上诱导培
养 30 d后 9个品种均能诱导出愈伤组织 ,诱导率因
品种而异 。E2、E6和 E7的花药形成愈伤组织的诱
导率相当 ,明显高于其它品种 ,为 89.3 %、90.5 %
和 92.6%;其余品种诱导愈伤组织的频率从高到低
排列为 E5>E9>E1>E4>E8>E3,诱导率分别为
86.7 %、83.3 %、82.6 %、80.0%、72.7 %和 71.4
%。从诱导愈伤组织的形成时间来看 ,以 E2、E5和
E9最早 ,接种 7 d后就开始启动 , 15 d就可产生愈
伤组织;其次是 E1、E4、E6和 E7;E3比较晚 ,接种
19d才开始产生愈伤组织。从愈伤组织的致密度来
看 , E3、E4、E5、E6、E7和 E8的愈伤组织结构疏松;
而 E1、E2和 E9的愈伤组织较致密。可见 ,洋桔梗
花药的愈伤组织诱导率与其遗传背景有一定的关
系 ,但其机理尚不清楚 ,有待进一步研究 。
2.3　洋桔梗不同品种的不定芽的再生率
9个品种的愈伤组织转接到培养基②上培养 20
a:洋桔梗花蕾;b:接种的花药;c:花药愈伤组织;d:愈伤组织分化;e:愈伤组织再生出苗;f:再生苗增殖;g:花药植株生根;h:花药诱导再
生出的二倍体植株根尖染色体数 2n=2x=72;i:花药诱导再生出的单倍体植株根尖染色体数 2n=x=36;j:花药再生植株练苗及移栽
a:Buds;b:Anthers;c:Calus;d:Calusdiferentiation;e:Regenerateshootsofcalus;f:Multiplicationofregenerationplants;g:Rhizogenesis;h:
Chromosomesoftheroottipofdoubledhaploidplant(2n=2x=72);i:Chromosomesoftheroottipofhaploidplant(2n=x=36);j:Trainingand
transplantingplants
图 1　1洋桔梗花药培养和再生植株倍性观察
Fig.1　InvitroinductionandploidyidentificationforanthercultureofE.ruselianum
1426 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　22卷
～ 30 d诱导不定芽的结果显示 ,部分未授粉胚珠愈
伤组织团发生绿色芽点状突起 ,并长出芽苗(图 1-
b)。从表 4可以看出 ,有 4个品种(E1、E2、E5和
E9)可再生出绿色芽苗或叶状结构 ,再生率为 3.8
% ～ 16.0 %, E2的再生率最高 ,达 16.0 %。 E3、
E4、E6、E7和 E8 5个品种未诱导出不定芽。可见 ,
洋桔梗花药诱导出的愈伤组织 ,其芽的再生率与品
种有很大关系 ,而与品种产愈率的高低无关 ,这一结
果与前人的相似 [ 12] 。因此 ,选择合适基因型的洋桔
梗无性系对花药离体培养诱导再生植株的成败起着
重要作用 ,另外 ,试验结果还表明芽苗再生率与愈伤
组织的形态有关 ,结构较致密的愈伤组织较易再生
出不定芽 ,而结构比较疏松的愈伤组织不定芽的诱
导率较低 ,且质量较差 。
2.4　再生株根尖的倍性观察
以 0.05 %秋水仙素室温下处理 5 h的中期及
中前期细胞比例较大 ,形状正常 ,染色体收缩至粗短
状 ,可用于染色体计数 。观察未授粉胚珠诱导产生
的 13个再生植株根尖染色体的结果表明:所得花粉
植株中有单倍体存在 (占 23.1 %),且都为品种
E07009产生 ,其染色体数目为 2n=x=36(图 1-i),
也有二倍体存在(占 76.9 %),染色体数为 2n=2x
=72(图 1-h),尚未发现非整倍体 。可见 ,诱导洋桔
梗花药所产生的再生植株以二倍体为主 ,单倍体所
占比例较小 ,如何提高花药植株的单倍体再生比率
须待进一步研究 。
2.5　壮苗 、生根和移栽
当芽苗扩繁至一定数量时 ,接入培养基④中壮
苗 ,待长至 4 ～ 6 cm时 ,将苗从基部平切下 ,转至培
养基⑤上生根培养。约 20 d后根系长至 2 ～ 4 cm
时经常规方法炼苗 ,炼苗用 100 ～ 800倍液多菌灵浸
泡茎根部 1 ～ 2 min,栽植于蛭石∶珍珠岩∶腐叶土 =
4∶4∶2的基质中 ,遮阴保湿 , 7 ～ 10 d苗成活后去掉
遮阳棚 ,移于消毒温室中 ,室温保持在 15 ～ 23 ℃,移
栽成活率为 90%以上(图 1-j)。
3　讨　论
　　本实验在前期研究的基础上通过花药培养首次
获得了洋桔梗单倍体花粉植株 [ 14] ,为洋桔梗的遗传
转化和选育种开辟了新途径。然而 ,由于花药培养
对基因型的依赖性较强 ,愈伤组织诱导率和芽苗再
生率因不同的基因型而表现出很大的差异 ,且总体
上花药植株的单倍体诱导率偏低 ,不能形成足够的
选择群体 ,因此 ,在进行洋桔梗花药培养时 ,应根据
花药植株的利用目的 ,选择具有代表性的品种 ,并综
合优化培养基 、培养方法和条件 、外源激素以及植株
生长条件等以提高花药植株的诱导率。从本试验结
果看 ,所有供试的洋桔梗品种均能诱导出愈伤组织 ,
部分品种再生成苗 ,这说明所采用的洋桔梗花药培
养方法有一定的适用性 ,然而由于杂种花药的遗传
背景不同 ,在离体培养条件下 ,各个品种仍然会表现
一定的差异。本试验建立的洋桔梗花药培养与完整
植株再生体系 ,为以后进行大量的洋桔梗新品种选
育奠定了良好的基础 ,也为远缘杂交育种提供了技
术保证。
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(责任编辑　谢晓慧)
14275期 　　　　　　王丽花等:洋桔梗花药离体培养与完整植株的诱导