全 文 ：廖　静 ,王　轶 ,陈崇顺 ,等.洋桔梗 DoubleMariachiPink高效遗传转化体系的建立 [ J].江苏农业科学 , 2011, 39(2):91-94.
洋桔梗 DoubleMariachiPink高效遗传转化体系的建立
廖　静 , 王　轶 , 陈崇顺 , 岳　敏 , 孙　晶 , 沈唯军
(南京师范大学生命科学学院 /江苏省生物多样性与生物技术重点实验室 ,江苏南京 210046)
　　摘要:以洋桔梗品种 DoubleMariachiPink为供试材料 ,探讨影响根癌农杆菌介导法遗传转化的一些因素 , 包括
Cb(羧苄青霉素)脱菌浓度 、Km(卡那霉素)筛选浓度 、农杆菌的侵染浓度和预培养时间等。研究结果表明:脱菌培养
基中 Cb的浓度为 200 mg/L时 , 抑制农杆菌生长但不显著影响叶片不定芽分化;不定芽分化阶段和生根阶段的适宜
Km筛选浓度分别为 30 mg/L和 15 mg/L;外植体预培养 3 d,在 D
600nm≈0.5的农杆菌菌液中侵染 10 min后 , Km筛选
得到的抗性植株 GUS染色蓝斑率最高 , 达到 86.7%。
　　关键词:洋桔梗;农杆菌;遗传转化;影响因素
　　中图分类号:S681.9　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0091-04
(上接第 90页)
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　　洋桔梗(Eustomagrandiflorum),别名草原龙胆 ,是龙胆科
洋桔梗属一 、二年生草本植物 。原产北美洲 ,其花姿清雅 ,花
色丰富 ,茎秆光洁修长 ,为世界十大切花之一 ,是近年来切花
生产中地位上升最快的种类 [ 1 ] 。随着社会的进步和经济的
发展 ,人们的生活水平不断提高 ,人们对观赏植物色香形新奇
美的需求也越发多样化 。基因工程技术的发展为观赏植物新
品种的培育提供了新的途径和方法 [ 2 ] ,目前以洋桔梗为受体
植物 ,已进行了一些遗传转化研究 ,这些遗传转化都是以离体
培养再生体系为基础的 ,所用转化方法大多为农杆菌介导法 ,
所涉及的品种有 DeepBlue、LisaBlue、DwarfPurple、Bicolor
Purple等 ,但遗传转化效率一般较低(1% ～ 20%)[ 3-10] ,严重
影响洋桔梗基因工程分子育种研究进展 。本研究以目前市场
上较流行的洋桔梗品种 DoubleMariachiPink为试材 ,在其高
频再生体系建立 [ 11]的基础上 ,系统研究农杆菌介导遗传转化
相关因素的影响 ,包括外植体的最佳预培养时间 、农杆菌侵染
收稿日期:2010-10-22
作者简介:廖　静(1985—),女 ,硕士研究生 ,主要从事植物生物技术
与分子生物学研究。 E-mail:liaojing0071211@sina.com。
通信作者:陈崇顺,博士 ,副教授 ,主要从事植物生物技术与分子生物
学研究。 E-mail:chenchongshun@njnu.edu.cn。
外植体的最适浓度 、既抑制农杆菌生长又不显著影响不定芽
分化的最适羧苄青霉素(Cb)脱菌浓度 、转化体的最适卡那霉
素(Km)筛选浓度 ,以建立 DoubleMariachiPink洋桔梗农杆
菌介导高效遗传转化技术体系 ,为进一步基因工程育种奠定
基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
植物试材为日本 SaKaRa公司生产 、昆明缤纷园艺有限
公司经销的 DoubleMariachiPink洋桔梗 F1代种子经过萌发
成苗及进一步离体培养所获得的无菌苗 。
根癌农杆菌菌株为 LBA4404, 转入其中的质粒载体为
pBI121 ,该质粒 T-DNA区含 CaMV35S启动子 、选择标记基
因 nptⅡ和报告基因 gus。
萘乙酸(NAA)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)和乙酰丁香酮
(AS)购自上海生工生物工程技术有限公司;利福平 (Rif)
(SCIGENE产品)和卡那霉素(Km)购自南京赛吉科技有限公
司;羧苄青霉素 (Cb)和 5 -溴 -4 -氯 -3 -吲哚葡萄糖苷
(X-gluc)购自南京基天生物技术有限公司 。
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DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.02.142
1.2　根癌农杆菌的培养
参照文献 [ 12]的方法进行根癌农杆菌培养 ,先用适量
pH值 5.8的 1 /2 MS液体培养基悬浮菌体 , 调整悬浮液
D600 nm至 0.5 , 并加入适量 AS(500 μmol/L), 使终浓度为
100 μmol/L。
1.3　脱菌抗生素 Cb浓度的确定
1.3.1　不同浓度 Cb对农杆菌生长的影响 　剪取大小为
0.5 cm×1.0cm左右的无菌滤纸 ,蘸上 D600 nm为 0.5的农杆
菌菌液 , 分别接种到含不同浓度 (0、 100、 200、 300、 400、
500 mg/L)Cb的分化培养基 [ 11]上 ,光培养 3 d后观察农杆菌
生长情况。
1.3.2　不同浓度 Cb对叶块不定芽分化的影响　取洋桔梗
无菌苗整张叶片 ,垂直于中脉进行 “三刀切 ”[ 11 ] ,将 1张叶片
切成 2个叶块(每块大约 5 mm×10 mm),分别接种于含不同
浓度(0、100、200、300、400mg/L)Cb的分化培养基上 ,每处理
接种 18个叶块 ,光培养 30 d后统计叶块分化不定芽的数量 。
1.4　选择压(Km浓度)的确定
1.4.1　不同浓度 Km对叶块不定芽分化的影响 　将无菌苗
叶块先接入不含 Km的分化培养基中 ,光培养 3 d,再暗培养
4d,然后接种于含不同浓度 (25、30、35 mg/L)Km的分化培
养基上 ,每个处理接种 24个叶块 ,光培养 30d后统计叶块不
定芽分化数 。
1.4.2　不同浓度 Km对芽苗增殖的影响 　将叶块分化的不
定芽接种于含不同浓度(0、10、20、30、40、50、60 mg/L)Km的
增殖培养基 [ 11 ]中 ,每个处理接种 30个芽 ,光培养 30d后统计
小苗黄化死亡的株数 。
1.4.3　不同浓度 Km对芽苗生根的影响 　将增殖的芽苗接
种于含有不同浓度(0、5、10、15、20、25mg/L)Km及 0.1mg/L
NAA的 1/2MS生根培养基中 ,每个处理接种 30个芽苗 ,光培
养 30 d后统计芽苗的生根数 ,并测量根长度 。
1.5　不同预培养时间对转化效率的影响
将无菌苗叶块放在分化培养基上 ,分别进行 0、1、2、3、4、
5、6 d光培养 ,每个处理 30个叶块 。取出叶块置于无菌小培
养皿中 ,保留分化培养基 ,向小培养皿中分别倒入D600 nm =
0.5的农杆菌菌液(含 100μmol/LAS),不断摇动菌液 ,使叶块
与菌液充分接触 。 10min后 ,取出叶块 ,置于无菌滤纸上吸去
多余的菌液 ,将叶块放回分化培养基上 ,暗培养 , 4d后随机选
取部分叶块进行 gus基因的检测 。将剩余叶块转入脱菌分化
培养基中脱菌 ,光培养 , 1个月后统计再生不定芽的数量 。将
不定芽切下转入增殖筛选培养基 (含 0.1 mg/L6 -BA、
0.05mg/LNAA、 30 mg/LKm、100 mg/LCb的 MS)中 , 1个月
更换 1次新鲜培养基 ,筛选培养 2代 。试验重复 3次 。
1.6　不同农杆菌浓度对转化效率的影响
将培养过夜的农杆菌菌液(D600 nm为 0.8 ～ 1.0)离心后用
pH值 5.8的 1 /2MS液体培养基悬浮 ,调整菌液浓度 D600 nm分
别为 0.2、0.5、0.8,以无菌苗的叶块为受体进行转化 ,暗培养
4 d后对叶片进行 gus基因表达的组织化学检测 。每个菌液
浓度处理 30个叶块 ,试验重复 3次 。
1.7　gus基因表达的组织化学检测
首先按照文献 [ 12]的方法 ,配制 GUS染液 、FAA固定液
和磷酸钠缓冲液 ,然后将叶块浸入 FAA固定液中 ,抽真空 ,轻
摇 ,取出叶块 ,用磷酸钠缓冲液漂洗 3 ～ 4次 ,放入小药瓶中 ,
加染色液 ,浸没材料 ,盖上瓶盖 ,于 37 ℃保温 24 h,取出叶片 ,
依次在 FAA固定液 、20%乙醇 、50%乙醇中各浸泡 20 min,观
察有无蓝色斑点 。染色后的材料浸入含 80% FAA的固定液
中保存 。
1.8　培养条件及试验结果数据分析
光培养条件:温度(25±2)℃,光照强度 60μmol/(m2 · s),
光周期 16h/8 h;暗培养条件:温度 (25 ±2)℃,无光照 。用
SPSS13.0统计软件对相关试验数据进行分析。
2　结果与分析
2.1　脱菌抗生素羧苄青霉素(Cb)浓度的确定
2.1.1　不同浓度的 Cb对农杆菌 LBA4404生长的影响 　当
Cb浓度为 0时 ,可在滤纸片周围的培养基上观察到明显的农
杆菌菌落;当 Cb浓度为 100 mg/L时 ,农杆菌仍然有少量生
长;Cb达到 200mg/L及以上浓度时 ,可完全抑制农杆菌的生
长(图 1)。
2.1.2　不同浓度的 Cb对叶片不定芽分化的影响 　在不加
Cb时 ,不定芽分化率为 100%;随着 Cb浓度的升高 ,不定芽
分化率不断下降 ,当 Cb浓度为 300mg/L时 ,不定芽的生长缓
慢 ,长势较差 ,不定芽分化率显著低于 200 mg/LCb处理
(表 1)。
　　综合考虑 Cb对农杆菌生长和叶片不定芽分化两方面的
影响 ,确定在脱菌培养基中添加 200 mg/LCb抑制农杆菌的
生长 。
2.2　选择压 (Km浓度)的确定
2.2.1　叶块分化不定芽选择压的确定　随着培养基中 Km
—92— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
表 1　羧苄青霉素(Cb)浓度对叶块不定芽分化的影响
Cb浓度
(mg/L)
接种叶块数
(块)
分化叶块数
(块)
不定芽分
化率(%)
不定芽分
化数(个)
0 18 18 100a 176
100 18 17 94.4ab 60
200 18 13 72.2b 41
300 18 7 38.9c 16
400 18 5 27.8c 7
　　注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。
浓度的增大 ,叶片不定芽分化率下降 ,叶片黄化 、坏死现象逐
渐严重 。当 Km浓度为 25mg/L时 ,不定芽分化率为 25%;当
Km浓度为 30 mg/L时 ,只有 1个外植体上分化出 2个不定
芽;当 Km浓度为 35 mg/L时 ,不定芽的分化则完全被抑制
(表 2)。因此 ,采用 30mg/LKm浓度作为叶片不定芽分化选
择压较为合适 。
表 2　卡那霉素(Km)浓度对叶块不定芽分化的影响
Km浓度
(mg/L)
接种叶块数
(块)
分化叶块数
(块)
不定芽分
化率(%)
不定芽分
化数(个)
25 24 6 25a 17
30 24 1 4.16ab 2
35 24 0 0b 0
2.2.2　抗性苗正常生长选择压(Km浓度)的确定　随着 Km
浓度的升高 , 分化苗的黄化率也逐渐增大 。 Km浓度为
30mg/L时 ,分化苗黄化率显著高于 20 mg/LKm处理;而
30mg/L时与 40 mg/L时的黄化率没有显著差异;高浓度的
Km(50 mg/L和 60 mg/L)使分化苗在 1个月内几乎全部黄
化 、死亡(表 3)。为获得尽可能多的抗性转化绿苗 ,在抗生素
筛选中采用 30mg/L的 Km为宜 。
2.2.3　抗性苗生根选择压(Km浓度)的确定 　随 Km浓度
提高 ,生根的苗数呈下降趋势 ,并且根长也受影响 ,比对照短 ,
当 Km浓度达到 15 mg/L时 ,小苗根的分化完全被抑制(表
4)。因此将不定芽生根阶段的 Km筛选浓度定为 15 mg/L。
表 3　卡那霉素(Km)浓度对分化苗生长的影响
Km浓度
(mg/L)
分化芽苗数
(株)
黄化苗数
(株)
黄化率
(%)
0 30 0 0a
10 30 8 26.7b
20 30 12 40.0b
30 30 25 83.3c
40 30 26 86.7c
50 30 28 93.3c
60 30 29 96.7c
表 4　卡那霉素(Km)浓度对小苗生根的影响
Km浓度
(mg/L)
不定芽数
(个)
生根不
定芽数
(个)
平均不
定根数
(条)
平均不定
根长度
(cm)
生根率
(%)
0 30 30 18.9 3.79 100
5 30 18 7.2 2.30 60.0
10 30 2 2.5 0.28 6.7
15 30 0 0 0 0
20 30 0 0 0 0
25 30 0 0 0 0
2.3　预培养时间对转化效率的影响
未预培养的洋桔梗叶片转化率很低 ,只有 3.33%, 大部
分叶盘均白化死亡;预培养 1 ～ 2 d,叶片转化率和平均每叶抗
性苗数有所提高 ,但分析显示 ,与未预培养的不定芽分化率无
显著差异;预培养 3 ～ 4d,叶片转化率和平均每叶抗性苗数进
一步提高 ,其中预培养 3 d不定芽分化率达到 40%,且平均每
叶抗性苗数也达到最高(表 5)。从 GUS染色的结果可以看
出 ,不经过预培养的叶片没有染上蓝色 , 预培养 3 d的叶片
GUS瞬时表达率比预培养 1 ～ 2 d的 GUS瞬时表达率有显著
提高 ,并且随着预培养时间的增加 ,叶片出现蓝斑的数量增
多 。但是预培养时间过长并没有明显增加抗性苗的数量 ,反
而会增强外植体非转化组织对选择压力的耐受能力 。因此 ,
确定预培养时间为 3 d。
表 5　不同预培养时间对转化效率的影响
预培养天数
(d)
接种外植体数
(块)
转化叶外植体数
(块)
转化率
(%)
再生苗数
(株)
每叶块转化数
(株)
抗性苗数
(株)
平均每叶块抗性
苗数(株)
0 30 1 3.33a 3 0.1 1 0.03
1 30 2 6.67a 6 0.2 1 0.03
2 30 4 13.3a 18 0.6 4 0.13
3 30 12 40.0b 32 1.1 7 0.23
4 30 11 36.7b 27 1.0 6 0.20
5 30 15 50.0b 41 1.4 6 0.20
6 30 17 56.7b 54 1.8 5 0.17
　　注:抗性苗筛选培养时间为 2个月。
2.4　农杆菌浓度对转化效率的影响
从 GUS染色结果(图 2)看 ,低浓度菌液(D600 nm≈0.2)侵
染情况下叶片 gus基因瞬时表达率(即有 GUS表达的蓝斑叶
块数 /检测叶块数)仅为 13.3%,蓝斑数较少且显蓝面积较
小;菌液 D600 nm≈0.5时 ,瞬时表达率较高 ,达到 86.7%,且蓝
斑的数量和大小也明显增大;而当菌液浓度达到 D600 nm≈0.8
后 ,瞬时表达率虽未下降 ,但外植体坏死率升高。由此可见 ,菌
液浓度过高或过低都不利于 GUS瞬时表达 。浓度过低则因外
植体上附着的菌体较少而减少了农杆菌的侵入;浓度过高则对
外植体造成伤害 ,外植体切口边缘部分褐化 ,外植体坏死 ,且在
后续培养中很难控制农杆菌的生长 ,从而降低转化率 。
因此 ,侵染外植体的农杆菌浓度以 D600 nm≈0.5、侵染
10min时 , gus瞬时表达率较高 ,外植体生长状态良好 ,诱导
不定芽效果也较好 。
—93—廖　静等:洋桔梗 DoubleMariachiPink高效遗传转化体系的建立
3　讨论
通过 Cb脱菌浓度 、Km筛选浓度 、农杆菌侵染浓度和预
培养时间等因素的筛选研究 ,初步建立了 DoubleMariachi
Pink洋桔梗的高效遗传转化体系 。脱菌培养基中 Cb的浓度
为 200 mg/L,不定芽分化阶段和生根阶段的 Km筛选浓度分
别为 30 mg/L和 15mg/L,经过预培养 3 d的外植体 ,在浓度
为 D600 nm≈0.5的农杆菌菌液中侵染 10 min后的外植体 , gus
染色蓝斑率最高 ,达到 86.7%。
与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中共生有大
量农杆菌 ,农杆菌的过度繁殖会造成外植体切口处转化细胞
的死亡和增加不定芽诱导的难度 ,为杀死和抑制农杆菌的过
量生长 ,必须在培养基中添加适量的抗生素(羧苄青霉素)。
羧苄青霉素(Cb)浓度偏低会造成农杆菌的过度生长 ,从而使
受体材料受到毒害;Cb浓度过高则导致在杀死农杆菌的同时
也伤害转化细胞 ,从而降低遗传转化率 [13] ,因此有必要对洋
桔梗叶片的 Cb敏感性进行测定 。本研究表明 , Cb浓度为
200 mg/L时可以完全抑制农杆菌的生长 ,但不显著影响洋桔
梗叶片的不定芽分化 。与先前报道 [ 11 ]相比 ,本研究显著减少
了 Cb的用量 ,节约了试验成本 。有些植物对 Km非常敏感 ,
如苹果 ,低浓度的 Km即可完全抑制叶片的生长与分化 [ 14 ];
而有些植物则对 Km不敏感 ,在含有较高浓度 Km的培养基
中仍然可以生长与分化 [ 15 ] 。一般认为 ,在农杆菌侵染前 ,对
外植体进行适当的预培养可以调整植物细胞的生理状态 ,从
而有助于提高转化率 。不同植物 、同一植物不同外植体均有
其最佳的预培养时间 。抱子甘蓝以下胚轴为外植体时需 3d
预培养 [ 17 ];诸葛菜以下胚轴和子叶为外植体时需 2 d预培
养 [ 18 ];番茄 、油菜叶片转化也需 2 d预培养 。洋桔梗外植体
对 Km较为敏感 ,有研究表明 ,洋桔梗叶片经预培养后 ,对 Km
的抗性可能会大大提高 [16] 。本试验将洋桔梗叶片经 3 d光
照和 4d暗培养 ,而后再接入含 Km的分化培养基中 ,结果表
明 , 30 mg/LKm可以基本抑制不定芽的分化 ,比先前报道的
最低浓度 25mg/L[11]有所提高 。转化苗在诱导生根阶段仍需
加入一定浓度的 Km,本研究以 15 mg/LKm作为转化苗生根
时的选择压较为合适 。同种植物的不同外植体对同一种抗生
素的敏感性不同 ,本试验表明 ,相对于叶片的增殖和不定芽的
分化 ,洋桔梗不定根的的发生对卡那霉素更为敏感 。
本研究表明 ,农杆菌菌液浓度、预培养时间都对洋桔梗的遗
传转化效率有影响。不同外植体农杆菌菌液最适侵染浓度有一
定差异 ,一般转化中使用的菌液浓度 D600 nm为 0.05 ～ 0.7[ 12] 。本
试验经过预培养的洋桔梗外植体 ,在 D600 nm≈0.5农杆菌菌液中
侵染 10min后 , GUS染色蓝斑率最高 ,达 86.7%。
本研究得到的 gus基因瞬时表达植株还有待于进一步的
筛选和 gus基因稳定表达的分子鉴定 ,以用于今后进一步目
的基因导入与转化的研究 。
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