全 文 ：西北农业学报　２０１４，２３（９）：９８－１０５
Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｓｉｎｉｃａ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１４．０９．０１６
网络出版日期：２０１４－０９－１８
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１４．０９．０１６．ｈｔｍｌ
农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立
收稿日期：２０１３－１１－０４　　修回日期：２０１３－１２－２６
基金项目：国家自然科学基金（３１３６００６０）。
第一作者：袁彬青，女，在读硕士研究生，从事植物转基因研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｂｑ５９１９９２７５＠１６３．ｃｏｍ
通信作者：闫　洁，女，副教授，主要从事生物化学与分子生物学的教学与研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｅｙ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
袁彬青，王秀珍，罗成华，闫　洁，祝建波
（石河子大学 生命科学学院，新疆石河子　８３２００３）
摘　要　以橡胶草为试验材料，利用农杆菌介导法进行遗传转化研究。结果表明：５０ｍｇ／Ｌ的卡那霉素
（Ｋａｎ）对橡胶草的抗性芽具有很好地筛选效果，生根筛选时，Ｋａｎ的适宜质量浓度为３５ｍｇ／Ｌ；最佳抑菌抗生
素为羧苄青霉素（ｃｂ），适宜质量浓度为５００ｍｇ／Ｌ，获得３５株抗性试管苗，通过ＧＵＳ染色及分子生物学检测，
最终获得６株转基因植株，转化率为１７．１％。可见，获得的橡胶草转基因植株，为橡胶草后续的遗传转化研
究奠定了基础。
关键词　橡胶草；再生体系；农杆菌；遗传转化
中图分类号　Ｑ９４３　　　文献标志码　Ａ　　　　　文章编号　１００４－１３８９（２０１４）０９－００９８－０８
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ
ＹＵＡＮ　Ｂｉｎｑｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｘｉｕｚｈｅｎ，ＬＵＯ　Ｃｈｅｎｇｈｕａ，ＹＡＮ　Ｊｉｅ　ａｎｄ　ＺＨＵ　Ｊｉａｎｂｏ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８３２００３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｗｅ　ｐｒｏｃｅｅｄｅｄ　ｔｈｅ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　５０ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ　ｈａｄ　ａ
ｖｅｒｙ　ｇｏｏｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｂｕｄｓ　ｏｆ　Ｔａｒａｘａｃｕｍｋｏｋｓａｇｈｙｚ，ｉｎ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ，ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋａｎ　ｗａｓ　３５ｍｇ／Ｌ；ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｗａｓ
ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ（ｃｂ）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５００ｍｇ／Ｌ．３５ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｅｓｔ－ｔｕｂｅ　ｐｌａｎｔｌｅｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂ－
ｔａｉｎｅｄ，ａｆｔｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ＧＵＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，６ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｆｉｎａｌｙ，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　１７．１％．Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｓｅｔ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ
ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ；Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｇｅ－
ｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　　天然橡胶是产胶植物的一种次生代谢物［１］，
是合成橡胶不可比拟的一种世界性工业原料和重
要的战略物质，具有极高的经济价值及应用前
景，在中国经济和国防建设中有着重要意义［２］。
蒲公英橡胶草（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ）是
菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）菊苣族蒲公英属多年生宿根型
草本植物，又称为俄罗斯蒲公英（Ｒｕｓｓｉａｎ　ｄａｎｄｅ－
ｌｉｏｎ），中国俗称橡胶草［３］。橡胶草与巴西橡胶
树、银胶菊一起并称为全球三大产胶植物。橡胶
草的橡胶主要从根中提取，质量分数为６％～
２８％［４］。橡胶草适应性强、适应区域广，并且生长
收获期短，可在田间种植，可轮种或间作，适合机
械化种植和采收，是一种具有极高开发价值的产
胶植物。
巴西橡胶树种植是一种典型的资源约束性产
业，地域性强，仅限于在部分亚洲和非洲等地的热
带地区少数国家种植［５］。因此，人们一直在寻找
能够替代巴西橡胶树的产胶植物。而橡胶草具有
生长周期短、适应范围广、适应性强，适合机械化
采收等明显工业化生产优势，而且橡胶草所产橡
胶的生物相容性较强，抗过敏性高，橡胶草的这些
特性都表明它是新型的理想天然橡胶替代资
源［６］。目前，国内外对橡胶草的研究主要集中于
生理特征及分子生物学方面［７－８］，而对橡胶草再生
体系及遗传转化的研究较少［９－１１］。鉴于橡胶草的
特点及目前的研究现状，本试验以已建立的橡胶
草高频再生体系为基础，利用根癌农杆菌介导的
叶盘法进行遗传转化的研究，从而初步建立橡胶
草的遗传转化体系。
１　材料与方法
１．１　试验材料
１．１．１　植物材料　橡胶草野生植株于２０１１年６
月采自石河子北泉镇农田沟渠旁，后移栽至温室
栽培。
１．１．２　植物表达载体　含有选择标记基因ｎｐｔ
Ⅱ、羧苄青霉素抗性基因和ＧＵＳ基因的植物表达
载体为ＰＢＩ１２１，农杆菌ＧＶ３１０１由石河子大学农
业生物技术重点实验室提供。
１．２　试验方法
再生培养基以 ＭＳ为基础培养基，生根培养
基以１／２ＭＳ为基础培养基。
１．２．１　卡那霉素对橡胶草芽再生的选择压试验
　将卡那霉素（Ｋａｎ）以不同的质量浓度（２５、５０、
７５ｍｇ／Ｌ）添加到橡胶草的再生培养基中，观察
外植体的生长情况。每次处理２０个外植体，每个
处理３次重复。
１．２．２　卡那霉素对橡胶草再生芽生根的选择压
试验　将生长良好的再生芽插入含有不同质量浓
度Ｋａｎ（１５、２０、２５、３０、３５ｍｇ／Ｌ）的生根培养基
中，每个处理２０个，重复３次，统计试管苗的生根
情况，以筛选出最适的质量浓度。
１．２．３　羧苄青霉素对橡胶草再生芽分化的影响
试验　选择４个质量浓度梯度（３００、４００、５００、６００
ｍｇ／Ｌ）的羧苄青霉素（ｃｂ）加入再生培养基，将新
剪下来的空白橡胶草叶片（每个处理２０个，重复
３次）接种到该培养基上，光照培养，观察外植体的
生长情况，统计出芽率，以确定合适的质量浓度。
１．２．４　羧苄青霉素对农杆菌的抑菌试验　选择
不同质量浓度（３００、４００、５００、６００ｍｇ／Ｌ）的ｃｂ添
加到外植体的再生培养基，将侵染后的外植体（每
个处理２０个，重复３次）接种到该培养基中，观察
农杆菌的生长状况，以确定最佳的质量浓度。
１．２．５　根癌农杆菌ＧＶ３１０１的活化与培养　将
－７０℃保存的含有ＰＢＩ１２１植物表达载体的农杆
菌取出，加入到１００ｍＬ活化培养基中，振荡培
养，使菌体活化。活化以后用接种环蘸取菌液，在
筛选培养基上划线，倒置于２８℃恒温培养箱中。
２ｄ后观察菌落生长情况，用接种针挑取单菌落，
置于加有８００μＬ活化培养基的无菌ＥＰ管中，
２８℃恒温振荡培养，至 ＥＰ管中菌液浑浊。以
ＧＵＳ基因上下游引物进行菌液ＰＣＲ及凝胶电泳
检测，选择电泳条带最亮的菌落扩大培养，备用。
所有无菌操作均在超净工作台上进行，下同。
１．２．６　农杆菌对橡胶草叶片外植体的侵染　将
备好的 ＯＤ６００值为０．６的根癌农杆菌菌液倒入
５ｍＬ的无菌离心管中，配平。在４℃离心机中以
５　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。弃上清，用１００ｍＬ加
有不同乙酰丁香酮的 ＭＳ液体培养基重新悬浮菌
体。将经过预培养处理的外植体加入到 ＭＳ农杆
菌悬浮液中，２８℃恒温震荡培养。到达设置的时
间后倒掉菌液，用无菌滤纸吸干叶面菌液，将外植
体置于表面铺有一层无菌滤纸的共培养基上，进
行共培养。共培养结束后，将外植体转入抗性芽
诱导培养基，光照培养，１周后转板，转板２次后
逐步降低ｃｂ的质量浓度至４００ｍｇ／Ｌ。
１．２．７　橡胶草叶片外植体预培养时间的筛选　
设置２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ３个时间梯度，将处理好
的外植体经过不同时间梯度的预培养后，在相同
ＯＤ６００值、相同侵染时间、相同共培养时间及抗生
素质量浓度的培养基上再生之后，统计不同处理
的抗性芽的出芽率，以确定最适的预培养时间。
１．２．８　侵染时间对转化率的影响试验　将
ＯＤ６００值为０．６的农杆菌菌液离心后用相同体积
的 ＭＳ液体培养基重新悬浮，控制其他条件一致
（如预培养时间、共培养时间、抗生素质量浓度
等），设置３个（１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ）侵染时间
梯度，经过后续的培养后统计外植体的存活率及
抗性芽的出芽率，以确定最佳的侵染时间。
１．２．９　共培养时间对转化率的影响试验　在外
植体进行农杆菌侵染以后，用无菌滤纸擦干表面
菌液，在预培养基表面覆盖一层无菌滤纸，将擦干
·９９·９期 袁彬青等：农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立
菌液的外植体正面朝上置于滤纸上，进行侵染后
的共培养。在控制其他条件一致的情况下，将共
培养时间设置为２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ，再统计抗性
芽的出芽率，以确定最佳的共培养时间。（共培养
于黑暗条件下进行）。
１．２．１０　乙酰丁香酮（Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，ＡＳ）对转
化率的影响试验　在控制其他因素一致的情况
下，向 ＭＳ悬浮培养基中添加１００、１５０、２００、２５０
ｍｇ／Ｌ的ＡＳ，以未添加ＡＳ的处理为对照，比较抗
性芽诱导率的差异，以确定ＡＳ的最佳质量浓度。
１．２．１１　橡胶草转化体的ＧＵＳ组织染色检测　
将筛选出的６周龄抗性苗叶片和根段剪下，在自
来水中冲洗干净，用吸水纸吸干，标记。置于染色
液中３７℃恒温过夜，依次用φ＝５０％乙醇、φ＝
７０％乙醇和φ＝９５％乙醇脱色，至空白对照脱去
所有叶绿素为止，用用显微镜检测到橡胶草叶片
及根中ＧＵＳ基因稳定表达的情况。
１．２．１２　橡胶草转化植株的分子的生物学检测　
剪取抗性试管苗的幼嫩叶片，提取ＤＮＡ，以ＧＵＳ
基因的上、下游检测引物进行 ＰＣＲ，电泳检测
ＧＵＳ基因是否整合到橡胶草基因组中。
２　结果与分析
２．１　卡那霉素对橡胶草再生芽的选择压确定
将剪好的外植体接种至含有不同质量浓度
Ｋａｎ的再生培养基中（图１－Ａ和１－Ｂ），２周后统计
生长情况。从表１中可知，当 Ｋａｎ质量浓度为
２５ｍｇ／Ｌ时，外植体无明显褐化死亡现象，此时抗
　　Ａ．橡胶草叶片再生芽的诱导　Ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＫＳ　ｌｅａｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄｓ；Ｂ．再生芽的伸长　Ｔｈｅ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｂｕｄｓ；Ｃ．再生芽的生根　Ｔｈｅ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｏｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄｓ；Ｄ、Ｅ．橡胶草组织培养试管苗　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　ＴＫＳ；Ｆ．移栽成活的橡
胶草　Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ　ｏｆ　ＴＫＳ；Ｇ．转基因橡胶草叶片ＧＵＳ组织化学染色　ＧＵＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ＴＫＳ　ｌｅａｆ；Ｈ．转基因橡胶
草不定根ＧＵＳ组织化学染色　ＧＵＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ＴＫＳ　ｒｏｏｔ；Ｉ．转基因橡胶草叶片（右）与空白橡胶草叶片（左）对比　Ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ＴＫＳ　ｌｅａｆ（ｒｉｇｈｔ）ａｎｄ　ＣＫＳ　ｌｅａｆ（ｌｅｆｔ）
图１　 橡胶草遗传转化的不同时期及ＧＵＳ检测
Ｆｉｇ．１　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＵＳ　ｒｕｂｂｅｒ　ｇｒａｓｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
·００１· 西　北　农　业　学　报 ２３卷
生素起不到筛选标记的作用；当质量浓度增加到
５０ｍｇ／Ｌ时，外植体能够长出愈伤组织，部分外植
体褐化并死亡，但褐化速率较慢；当质量浓度增加
到７５ｍｇ／Ｌ时，大部分外植体没能长出愈伤而直
接褐化死亡。由于高质量浓度的 Ｋａｎ直接杀死
组织细胞后，死亡组织会更加抑制抗性细胞的生
长，因此，为了达到抗性筛选的目的，选择质量浓
度为５０ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ作为再生芽的选择压。
２．２　卡那霉素对橡胶草根的选择压确定
将生长良好的再生芽接种到添加了不同质量
浓度Ｋａｎ的生根培养基中，统计再生芽的生根情
况。从表２中可知，随着 Ｋａｎ质量浓度的升高，
再生芽的生根率逐渐下降，当Ｋａｎ的质量浓度为
３５ｍｇ／Ｌ时，再生芽生根率接近０。因此，将Ｋａｎ
对根的筛选质量浓度确定为３５ｍｇ／Ｌ。
２．３　羧苄青霉素对芽再生的影响
将橡胶草叶片外植体接种至添加有不同质量
浓度ｃｂ的再生培养基中，光照培养２周后，统计
发现，随着ｃｂ的质量浓度的增加，外植体的出芽
率逐渐下降，当ｃｂ的质量浓度低于５００ｍｇ／Ｌ
时，橡胶草外植体能够保持较高的出芽率，且再生
芽长势良好（表３）。
２．４　羧苄青霉素抑菌试验结果
综合上述两个试验结果，可以从表４中看出，
当ｃｂ的质量浓度为４００ｍｇ／Ｌ时，既能保证外植
体保持较高的出芽率，又能较好地抑制住农杆菌
的生长。因此，在再生培养中，选择该质量浓度的
ｃｂ作为抑菌剂。
２．５　橡胶草外植体预培养时间的确定
预培养可以提高抗性芽的诱导率。从图２可
知，随预培育时间的延长，抗性芽的诱导率先提高
后降低。当外植体预培养时间为４８ｈ，抗性芽的
诱导率最高，且与其他预培养时间相比差异显著。
因此，在遗传转化试验中将外植体的预培养时间
确定为４８ｈ。
２．６　农杆菌最佳侵染时间的确定
由图３可知，随着侵染时间的延长，外植体的
存活率逐渐下降，而抗性芽的诱导率开始升高。
综合考虑，确定３０ｍｉｎ为最佳侵染时间。
表１　再生芽的卡那霉素筛选
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄｓ
Ｋａｎ质量浓度／（ｍｇ／Ｌ）
Ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ　Ｋａｎ
褐化率／％Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　ｒａｔｅ
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
特征描述
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
２５　 ０　 ０　 ０　 ０
外植体接种７ｄ边缘出现轻微膨大，１０ｄ长出愈伤组织，并未
发生褐化
Ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｓｗｏｌｅｎ　ｍｉｌｄｌｙ　ｉｎ　７ｄａｙｓ，ｔｈｅｎ　ｃａｌｕｓ　ｇｒｅｗ　ｉｎ　１０ｄａｙｓ，
ｎｅｖｅｒ　ｂｒｏｗｎｅｄ
５０　 ２５　 ２８　 １９　 ２４
外植体接种７ｄ后边缘出现膨大，１０ｄ开始有愈伤组织生长，
部分外植体未出愈或轻微出愈而褐化
Ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｓｗｏｌｅｎ　ｉｎ　７ｄａｙｓ，ｔｈｅｎ　ｃａｌｕｓ　ｇｒｅｗ　ａｆｔｅｒ　ａｂｏｕｔ　１０
ｄａｙｓ，ｓｏｍｅ　ｎｅｖｅｒ　ｏｒ　ｇｒｅｗ　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｂｒｏｗｎｅｄ
７５　 ６７　 ６９　 ７４　 ７０
多数外植体在接种５ｄ后直接褐化，个别长出轻微愈伤，但生
长缓慢
Ｍｏｓｔ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｂｒｏｗｎｅｄ　ａｆｔｅｒ　５ｄａｙｓ，ｓｏｍｅ　ｇｒｅｗ　ｃａｌｕｓ　ｓｌｏｗｌｙ
表２　生根培养的卡那霉素筛选
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ’ｓ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｏｎ　ｒｏｏｔｉｎｇ
Ｋａｎ质量浓度／（ｍｇ／Ｌ）
Ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ　Ｋａｎ
生根率／％ Ｒｏｏｔｉｎｇ　ｒａｔｅ
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
特征描述
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
１５　 １００　 １００　 １００　 １００
生根迅速，与空白比较无明显区别
Ｒｏｏｔｅｄ　ｑｕｉｃｋｌｙ，ｈａｄ　ｎｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｔｏ　ＣＫ
２０　 ９４　 ９７　 １００　 ９７．３
大部分芽生根迅速，极少数生根困难，个别接种后变黄死亡
Ｍｏｓｔ　ｒｏｏｔｅｄ　ｑｕｉｃｋｌｙ，ａ　ｈａｎｄｆｕｌ　ｏｆ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ
ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｔｕｒｎ　ｙｅｌｏｗ　ａｆｔｅｒ　ｄｅａｔｈ
２５　 ６７　 ６５　 ７０　 ６７．５
部分再生芽接种后黄化死亡，多数生根缓慢，但２周后基本正
常生根
Ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄｓ　ｇｒａｆｔｅｄ　ｂｒａｎｃｈｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｄｅａｔｈ，
ｍｏｓｔ　ｒｏｏｔｅｄ　ｓｌｏｗｌｙ，ｂｕｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ｒｏｏｔｅｄ　ｎｏｒｍａｌｙ
３０　 ４６　 ３９　 ４４　 ４３
多数再生芽接种后变黄，无生根迹象，少数生根，但速率缓慢
Ｍｏｓｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄｓ　ｔｕｒｎｅｄ　ｙｅｌｏｗ　ａｆｔｅｒ　ｇｒａｆｔｉｎｇ，ｓｈｏｗｅｄ
ｎｏ　ｓｉｇｎ　ｏｆ　ｒｏｏｔｉｎｇ，ａ　ｆｅｗ　ｔｏｏｋ　ｒｏｏｔ，ｂｕｔ　ｓｌｏｗｌｙ
３５　 ０　 ４　 ０　 １．３
２周后均无生根迹象，极少数长出主根，但根系发黄，植株随后
死亡
Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏ　ｓｉｇｎｓ　ｔｏ　ｔａｋｅ　ｒｏｏｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ，ｆｅｗ　ｒｏｏｔｅｄ
ｂｕｔ　ｙｅｌｏｗ，ｐｌａｎｔｓ　ｄｉｅｄ　ｌａｔｅｒ
·１０１·９期 袁彬青等：农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立
表３　羧苄青霉素对再生芽的影响
Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ（ｃｂ）ｏｎ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｃｂ质量浓度／（ｍｇ／Ｌ）
Ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ　ｃｂ
出芽率／％Ｂｕｄｄｉｎｇ　ｒａｔｅ
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
特征描述
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
３００　 ９４　 ９２　 ８９　 ９１．７
外植体出芽迅速，芽生长良好，与空白比较无明显区别
Ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｒａｐｉｄｌｙ，ｂｕｄｓ　ｇｒｅｗ　ｗｅｌ，ｈａｄ　ｎｏ　ｏｂｖｉｏｕｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＣＫ
４００　 ７８　 ８０　 ７５　 ７７．７
大部分出芽迅速，极少数在接种２周后开始出芽，再生芽长势
良好
Ｍｏｓｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｑｕｉｃｋｌｙ，ａ　ｆｅｗ　ｂｅｇａｎ　ｔｏ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ａｆｔｅｒ　ｔｗｏ
ｗｅｅｋｓ，ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄｓ　ｇｒｅｗ　ｗｅｌ
５００　 ５６　 ６２　 ５９　 ５９
部分外植体接种后褐化死亡，其余出芽缓慢，再生芽个别发黄
Ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｂｒｏｗｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｒｅｓｔ
ｓｌｏｗｌｙ，ｔｈｅ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｔｕｒｎｅｄ　ｙｅｌｏｗ
６００　 ２５　 １８　 ２３　 ２２
多数外植体接种后直接褐化，极少数在２周内出芽，且再生芽
生长缓慢，一段时间后开始变白，然后死亡
Ｍｏｓｔ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｂｒｏｗｎｅｄ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，ｆｅｗ　ｒｅｇｅｎｅｒ－
ａｔｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｂｕｄｓ　ｇｒｅｗ　ｓｌｏｗｌｙ，
ａｆｔｅｒ　ａ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ｔｕｒｎｅｄ　ｗｈｉｔｅ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｄｉｅｄ
表４　羧苄青霉素对农杆菌的抑制作用
Ｔａｂｌｅ　４　Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ（ｃｂ）ｏｎ　ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｃｂ质量浓度／（ｍｇ／Ｌ）
Ｍａｓｓ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｂ
３００　 ４００　 ５００　 ６００
外植体及农杆菌生
长状况
Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｌａｎｔ　ａｎｄ
ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
外植体边缘在接种１周
后几乎全为农杆菌覆盖，
随后褐化死亡
Ｔｈｅ　ｅｄｇｅ　ｏｆ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ａｌ－
ｍｏｓｔ　ａｌ　ｃｏｖｅｒｅｄ　ｂｙ
ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｆｔｅｒ　ｏｎｅ
ｗｅｅｋ ，ｔｈｅｎ　ｂｅｇａｎ　ｔｏ
ｂｒｏｗｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｉｅｄ
少数外植体边缘在接种１
周后出现菌落，能正常出
芽
Ｔｈｅ　ｅｄｇｅ　ｏｆ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｉｎ
ｃｏｌｏｎｙ　ａｆｔｅｒ　ａ　ｗｅｅｋ，ａｎｄ
ａｂｌｅ　ｔｏ　ｎｏｒｍａｌｙ　ｂｕｄｄｉｎｇ
外植体边缘无菌落长出，
但褐化率高，出芽率低，
且芽长势差
Ｔｈｅ　ｅｄｇｅ　ｏｆ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｈａｄ
ｎｏ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ，ｂｕｔ　ｂｒｏｗｎ－
ｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｈｉｇｈ，ｔｈｅ
ｂｕｄｄｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｌｏｗ，
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｕｄｓ　ｇｒｅｗ　ｗｏｒｓｅ
外植体在接种１周后全
部褐化，随后死亡
Ａｌ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｂｒｏｗｎｅｄ　ａｆ－
ｔｅｒ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｗｅｅｋ　ａｎｄ
ｔｈｅｎ　ｄｉｅｄ
　　ａ、ｂ表示不同的培养时间对芽诱导水平的差异　ａ　ａｎｄ　ｂ　ｒｅ－
ｐｒｅｓｅｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ
ｂｕｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
图２　不同时间对芽诱导率的作用
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｂｕｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
２．７　最佳共培养时间的确定
在５种不同时长的共培养培养后，将外植体
转入同一培养条件下培养，５周后统计抗性芽诱
导率（图４）。
　　Ａ、Ｂ表示不同时间对外植体存活率的影响　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　ｓｈｏｗｓ
ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｉｍｐｌａｎｔ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ；ａ、ｂ表示
不同时间对外植体诱导率的影响　ａ，ｂ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｅｘｐｌａｎｔｓ；Ｂ、ｂ表示最优侵染条件　Ｂ，ｂ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
图３　不同时间对外植体存活率及诱导率的作用
Ｆｉｇ．３　Ｔｉｍｅ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｉｍｐｌａｎｔ　ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
·２０１· 西　北　农　业　学　报 ２３卷
　　从图４可知，随着共培养时间的延长，抗性芽
诱导率升高，当共培养时间为４８ｈ时，诱导率最
高，且与其他培养时长差异显著；共培养时间为
７２ｈ时，农杆菌在再生培养阶段难以抑制，导致
外植体褐化率升高，抗性芽数量开始下降。因此，
在转化试验中应将最佳共培养时间确定为４８ｈ。
２．８　乙酰丁香酮对抗性芽诱导率的影响
向悬浮培养基中添加一定浓度的 ＡＳ，能够
提高抗性芽的诱导率。从图５可知，当质量浓度
为２００ｍｇ／Ｌ时，抗性芽诱导率最高，且与添加
ＡＳ的其他质量浓度处理差异显著；当质量浓度
达到２５０ｍｇ／Ｌ时，ＡＳ对外植体毒害作用增强，
导致部分外植体褐化死亡，从而降低了抗性芽诱
导率。综合考虑，将ＡＳ的最佳质量浓度确定为
　　ａ、ｂ表示不同的共培养时间对芽诱导水平的差异，ｂ表示诱
导显著
ａ　ａｎｄ　ｂ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｂｕｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｂ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
图４　共培养时间对芽诱导率的作用
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　ｂｕｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
　　ａ、ｂ表示不同质量浓度的ＡＳ对芽诱影响，ｂ表示诱导显著
ａ，ｂ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＳ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｂｕｄｓ，ｂ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｉｎｄｕｃｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
图５　不同质量浓度ＡＳ对芽诱导率的作用
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ＡＳ　ｆｏｒ　ｂｕｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
２００ｍｇ／Ｌ。
２．９　转化橡胶草植株的ＧＵＳ基因ＰＣＲ检测
如图６所示，对获得的橡胶草植株基因组
ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测，结果表明ＧＵＳ基因已经成
功整合到植物基因组中（图１－Ｃ、１－Ｄ、１－Ｅ和１－Ｆ）。
最终检测结果显示像胶草的遗传转化率为
１７．１％。
２．１０　转化橡胶草植株的ＧＵＳ组织化学染色检
测结果
如图１－Ｇ、１－Ｈ所示，转基因橡胶草幼嫩叶片
和根经ＧＵＳ组织化学染色后，叶脉部分、叶柄切
口处及根颜色深，而叶肉部分颜色浅，表明 ＧＵＳ
主要在橡胶草乳管组织内表达。
　　Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ　３；１．阳性质粒对照　Ｐｌａｓｍｉｄ；２．阴性对照　
ＣＫ；３～８．转基因橡胶草 ＤＮＡ 样本　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ＴＫＳ　ＤＮＡ
ｓａｍｐｌｅｓ
图６　转基因橡胶草植株ＤＮＡ
ＧＵＳ基因ＰＣＲ检测电泳图
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｆｉｇｕｒｅ
ｏｆ　ＧＵＳｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ＴＫＳ　ｐｌａｎｔｓ
３　结论与讨论
研究中发现，在植物组织培养中对外植体的
最佳预培养时间为４８ｈ，侵染时将农杆菌用添加
有２００ｍｇ／ＬＡＳ的 ＭＳ培养基重新悬浮，侵染３０
ｍｉｎ，转入黑暗条件下共培养４８ｈ，然后进行抗性
芽的诱导，能够获得２２．７％的抗性芽诱导。其
中，抗性芽诱导培养基为 ＭＳ＋１．５ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋
０．１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ＋５０ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ＋５００ｍｇ／Ｌ　ｃｂ，
抗性芽生根培养基为１／２ＭＳ＋０．２ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ
＋３５ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ＋４００ｍｇ／Ｌ　ｃｂ。
在植物的遗传转化研究中，抗生素的选择很
大程度上直接影响着抗性芽的获得［１２］。由于被
转化细胞对抗生素有一定耐受力，而非转化细胞
对抗生素敏感，从而达到抗生素筛选目的［１３－１４］。
·３０１·９期 袁彬青等：农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立
目前，在遗传转化中常用的筛选标记基因主要包
括ＨｐｔⅡ、ＮｐｔⅡ等，其中，最常用的为ＮｐｔⅡ，其
存在于大多数植物表达载体中，易被根癌农杆菌
转化［１５］。Ｋａｎ是利用ＮｐｔⅡ作筛选标记基因时
的一种抗生素，由于再生芽对Ｋａｎ有着强烈的敏
感性，因此在遗传转化过程中，如何选择适当质量
浓度的Ｋａｎ进行筛选，是影响抗性芽诱导率的关
键因素［１６］。Ｋａｎ质量浓度过高，对包括转化细胞
在内的所有细胞产生强烈抑制作用，致使外植体
在接种到再生培养基后很快死亡，极大降低抗性
芽的诱导率；质量浓度过低，则又难以对非抗性芽
产生明显的抑制作用，从而达不到筛选目的，造成
大量假阳性植株的产生，给后期的筛选鉴定带来
麻烦。因此，Ｋａｎ选择压的确定是进行植物遗传
转化研究的首要工作［１７］。
在植物的遗传转化中，侵染后的叶片外植体
表面附着有大量农杆菌，如果直接转入未添加任
何抑菌剂的培养基，会导致大量农杆菌的滋生，从
而使外植体中毒死亡［１８］。而定时的无菌水清洗
又会给外植体造成二次损伤，导致褐化率升高而
影响再生芽的诱导。因此，在农杆菌介导的遗传
转化中，抑菌剂直接关系到研究的成败。
遗传转化研究中常用的抑菌剂主要有头孢霉
素（Ｃｅｆ）和羧苄青霉素（ｃｂ）［１９］，笔者在本研究的
预试验中曾对两者进行过对比试验。结果表明：
向培养基中添加Ｃｅｆ作为抑菌剂，尽管能起到良
好的抑菌效果，但光照培养１周后，培养基呈暗黄
色，外植体出芽率低，褐化致死率高。将诱导出的
抗性芽插入加有Ｃｅｆ的生根培养基中，４周后也
未表现出生根趋势，大部分再生芽开始发黄，最终
死亡。然而，用相同质量浓度的ｃｂ替代Ｃｅｆ，在
抑制农杆菌滋生的同时，又能保证较高的外植体
存活率和抗性诱导率及生根率。因此，在后面的
转化筛选中使用ｃｂ作为抑菌剂。
农杆菌对目的基因的转化始于菌体对植物伤
口部位的附着［２０］。研究表明，经过创伤处理的大
多数植物外植体，伤口边缘细胞会释放出某些酚
类物质。而酚类物质可以明显刺激农杆菌Ｖｉｒ基
因表达，从而能够提高农杆菌的转化效率。常用
的Ｖｉｒ基因诱导物是乙酰丁香酮（ＡＳ）和羟基乙
酰丁香酮（ＯＨ－ＡＳ）［２１］，其中效果最佳的是 ＡＳ。
本研究中，笔者在农杆菌对叶片外植体的侵染过
程中，于 ＭＳ悬浮培养基中添加不同质量浓度的
ＡＳ，比较抗性芽的诱导率，得出在添加２００ｍｇ／Ｌ
ＡＳ的 ＭＳ悬浮培养基中进行侵染，最终能获得
２８．４％的抗性芽诱导率。
将抗性芽转入生根培养基，由于将新的基因
插入单橡胶草的基因中，从而表现出对卡那霉素
和羧苄青霉素的抗性，从而得到转基因橡胶草的
生根率为８７．７％，且个别抗性苗长势良好，叶片
呈深绿色。对获得的３５株抗性试管苗进行ＰＣＲ
及琼脂糖凝胶电泳检测，发现６个样本能检测到
ＧＵＳ基因，说明外源基因已经整合到植物基因组
中［２２］。对ＰＣＲ阳性植株进行 ＧＵＳ组织化学染
色及分子生物学检测。染色结果显示，６株橡胶
草的叶片均呈阳性（图１－Ｉ），染色部位主要集中于
叶脉部分，叶肉染色较浅，橡胶草根部几乎全部着
色，且分布均匀。最终检测结果显示本研究中的
橡胶草遗传转化率为１７．１％。本试验进行根癌
农杆菌介导的遗传转化研究，并获得橡胶草转基
因植株，成功构建了橡胶草的遗传转化体系。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（参考文献）：
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·４０１· 西　北　农　业　学　报 ２３卷
ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｕａｙｕｌｅ［Ｊ］．
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ａｎｄ　ｌｏｗ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｒｅ　ｋｅｙ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｇｕａｙｕｌｅ　ｌｅａｆ　ｔｉｓｓｕｅ
ｓｈｏｏｔ　ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅ－
ｐｏｒｔｓ，２００６，２５：２６－３４．
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ｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｐｌａｎｔ（热带亚热带植物学
报），２００６，１４（３）：１７９－１８２（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂ－
ｓｔｒａｃｔ）．
［１１］　ＷＡＮＧ　Ｌｉｈｕａ（王丽华），ＷＡＮＧ　Ｙｏｎｇｑｉｎｇ（王永清），
ＣＨＥＮ　Ｗｅｎｄｅ（陈文德），ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｇｕａｙｕ－
ｌｅ［Ｊ］．Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（安徽农业科学），
２００５，３３（６）：１０１１－１０１２（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂ－
ｓｔｒａｃｔ）．
［１２］　ＹＡＮＧ　Ｈｕｉｊｉｅ（杨慧洁），ＹＡＮＧ　Ｓｈｉｈａｉ（杨世海）．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｐｌａｎｔｓ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｕｌｅｔｉｎ（生
物技术通报），２００９（１）：１６－２１（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ
ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［１３］　ＣＨＥＮ　Ｆｅｉ（陈　菲），ＬＩ　Ｌｉ（李　黎），ＧＯＮＧ　Ｗｅｉ（宫　
伟）．Ｔｈｅ　Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｏ　Ｉｎ－
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［１４］　Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ　Ｒ，Ｃｈｅｎ　Ｌ，Ｒｏｇｅｒｓ　Ｓ　Ｍ　Ｄ．Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ
ｔｈｅ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｔｈｅ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｍｏｎｏｃｏｔ，Ｔｙｐｈａ　ｌａｔｉｆｏｌｉａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，
Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，２００４，７９（１）：３１－３８．
［１５］　ＤＵＡＮ　Ｙｉｎｇｙｉｎｇ（段莹莹），ＪＩＡ　Ｗｅｎｌｏｎｇ（贾文龙）．Ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ＩＢＡ　ｏｎ　Ｃｕｔｔｉｎｇ　Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ
ｏｆ　Ｅｄｉｂｌｅ　Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ［Ｊ］．Ｓｈａｎｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅｓ（山西农业科学），２０１１，３９（８）：８３８－８４０（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［１６］　ＺＯＵ　Ｚｈｉ（邹　智），ＬＵ　Ｃｈａｎｇｍｉｎｇ（卢长明）．Ａｎ　Ｏｖｅｒｖｉｅｗ
ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｆａｃｔｏｒ’ｓ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｕｌｅｔｉｎ（生物技术通
报），２００８（１）：１－９（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［１７］　ＨＵＡＮＧ　Ｔｉａｎｄａｉ（黄天带），ＬＩ　Ｚｈｅ（李　哲），ＳＵＮ　Ａｉｈｕａ
（孙爱花），ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｈｅｒ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ　ｒｕｂｂｅｒ　ｔｒｅｅｓ　ｉｎ　Ｂｒａｚｉｌ［Ｊ］．
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｐｌａｎｔ（热带作物学
报），２００８（６）：６７３－６７７（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂ－
ｓｔｒａｃｔ）．
［１８］　ＷＡＮＧ　Ｚｉｘｕａｎ（王紫萱），ＹＩ　Ｚｉｌｉ（易自力）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓａｆｅ－
ｔｙ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ－
ｏｇｙ（中国生物工程杂志），２００３（６）：９－１３（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ
Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［１９］　ＨＵＡＮＧ　Ｔｉａｎｄａｉ（黄天带）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ－
ｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｏｆ
ｒｕｂｂｅｒ　ｔｒｅｅ［Ｄ］．Ｈａｉｎａｎ：Ｈａｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（海南大学），
２０１０（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［２０］　ＬＩＮ　Ｂｏｈｕａｎｇ（林伯煌），ＷＥＩ　Ｘｉａｏｄｉ（魏小弟）．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌ－
ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ［Ｊ］．Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｇｒｉ－
ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（热带农业工程），２００９，３３（４）：１－３（ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［２１］　ＹＵ　Ｂｏ（于　波），ＷＵ　Ｈｕａｌｉｎｇ（吴华玲），ＨＵＡＮＧ　Ｔｉａｎｄａｉ
（黄天带），ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒａｚｉｌ　ｒｕｂｂｅｒ
ｔｒｅｅ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄ［Ｊ］．
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｅｔｉｎ（中国农学通报），
２０１２，２８（３１）：１５－２０（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［２２］　ＣＯＮＧ　Ｍｉｎｇ（丛　明），ＬＩＮＧ　Ｈｕａ（凌　华），ＨＵＡＮＧ
Ｈｕｉｑｉｎ（黄惠琴），ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＥＦ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ
ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｒｕｂｂｅｒ　ｌａｔｉｃｉｆｅｒｉｏｕｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ
ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧＵＳｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｃｒｏｐｓ
（热带作物学报），２００５，２６（２）：２９－３３（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ
Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
·５０１·９期 袁彬青等：农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立