全 文 ：小山大学学报 (自然料学版》第30 卷 第l 期 A CT AS I E N T CI RAU M N TAU R AL I U M
U N I V E R S I T TAI S S U N Y TAS E N I
V o l
1 9 9 1年
。
3 Q
1 9 9 1
苏铁在种子植物进化中的位置
— 分子生物学的证据
屈 良鸽 余小 强
(生物工程研 究中心
施苏华 张宏达
(生物学系 )
摘 要
用大分子 :R N A快速测序 法 测 定 了苏铁 (Cy c as re o ol ut aT 五。 n b . )、 水松〔G 扫户to 犷
t r o b u s Pe n ; 111` (S t u n at
。
)K o e h 〕和南方红豆杉 〔T a二u s m ar` e i (L e m e e e t L e vl )S . Y 。 H u 〕
三种裸子植物 L s 一 r R N AS `端区10 8个核普酸的序列 . 用这些数据构建的 r R N A系统树揭示
了苏铁与水松和南方红豆杉构成一个关系密切的姐妹群 , 而所分析的被子植物都为另一自然
类群 . 另以绿藻作为种子植物群外参照物种 , 表明苏铁这一位置并不是由于一个特异的进化
速度所造成的 。 这一结果支持了苏铁与松杉类为 一自然群类 , 它们的分歧发生在裸子植物与
被子植物分歧之后的假说 .
关键词 苏铁 , 裸子植物 , 系统演化 , r R N A , 核苔酸序列
苏铁曾繁盛于中生代 , 现仅存苏铁科 , 故有活化石之称 . 苏铁类不仅对古气候 、 地
理和古植被研究有很大价值 , 而且是研究种子植物起源和进化过程的关键植 物 类 群 之
一 许多植物分类学家在形态结构和生理特征上对苏铁类及其化石巳作了大量的研究工
作。 但是 , 由于化石记录的不完整 , 根据现存植物的表型特征来重建系统进化树的困难
很大 , 所以苏铁在种子植物进化中的位置一直存在争论 〔 ` ~ 3 〕 。 因此 , 提供新 的 、 尤其
是分子生物学方面的证据是非常必要的 。 本文报导了对苏铁 ( C夕` 。 : 1e “ 玩 la ) 和 2 种
针叶树即水松 ( G I互P zo s z: o乙。 5 P e n s i l f s ) 、 南方红豆杉 ( T a x u s 二 a i T e i ) 核糖 体 大亚基
( L
s 一 r R N A ) 部份核昔酸序列的测定以及比较分析的结果 , 并对苏铁在种子植物 进化
中的位置进行了讨论 。
1 材料与方法
苏铁 ( C刀c a s , 。 : , o l o z a ) 、 水松 ( G I , P , o : : ,二石。 s P。 。 s i l f : ) 和南方红豆杉 ( T a x : s 二 a -
f er f ) 树叶采自中山大学校园和华南植物园 . 了一北 P A T P购自A m e r s h a m , 多核昔 酸激
酶和逆转录酶购 自华关公司 。
1
。
, 植物大分子 R N A制备
新鲜嫩叶用蒸馏水洗净 , 吸干 ,放入研体中加入液氮冷冻 , 研磨成粉末 . 每克树叶加入
3 n l l抽提缓冲液 ( o . l n l o l / L L IC I , 0 . 1 。 : 0 1/ L T r i s 一 H C I p H S . o , l o m m o l / L E D E A ,
. 国家自然科学基金资助项目
本文 1 90 0年 6 )J 4 卜{收到
第 1期 屈良 鸽等 : 苏铁立种子植物进化中的位置
l %S D S) 及等体积酚 ( 8 0℃ ) , 剧烈震荡 3 一 5 m in , 加入与酚等量的氯仿 , 震荡 . 以
13 0 0r p m 高速离心 15 m in 后取水相 . 再用酚一氯仿 ( 1 : 1 ) 溶液抽提 2 次。 以氯化 锉
( 终 浓度 Z m ol / L ) 沉淀大分子 R N A , 大分子 R N A粗品再以酚一氯仿抽提 2 次后 , 以
2
.
5 倍 乙醇沉淀 R N A , 于 一 20 ℃冰箱保存 。
1
.
2 r R N A序列浏定
大分子 r R N A 的直接序列测定基本上按照我们过去的 方 法 进 行 〔` ’ 6 0 . 测 序 用 的
D N A 引物 D , c对应于水稻 (O塔 : a s a t i v a L . ) 2 5 5 r R N A S 尹端 3了。~ 3 9 2这段序列 〔已。 . 由
于这一序列在真核生物 L s 一 r R N A分子 中具有很高的同源性 , 所 以我们可 以 用 D , 。 引物
来测定不同植物的 L s 一 r R N A序列 。 即用逆转录酶延伸 与植物 L s 一 r R N A专一性杂 交的
D N A 引物 ( 5 `端 以磷 32 放射性同位数标记 ) , 在双脱氧核糖核昔酸存在下 , 直 接 测定
R N A序列 。
1
.
3 r R N A序列的比较及系统树的绘制
按照最大同源性的原则 , 将苏铁的核昔酸序列与水松 、南方红豆杉和几种被子植物即
水稻 ( O叨 : a s a t i v a L . ) 、 玉米 ( Z e a 二 a夕s L . ) 〔 5 〕和茄 科 的烟草 ( N i c o t i a n a r a丢a c : `m
L
.
) 〔 5 ’ 、 西红柿 ( L v 。 o p e ; s i c : ` m o s c : l e n ` u m 入1 111。 ) 〔 7 ’ 以 及一 种 绿 藻 ( P g r a 二 i二 o ,: a s
尸。 : 寿。 a 。 )〔 8 ’ 的 L s一 r R N A 同源序列进行排列比较 , ) IJK i m u r a 公式 〔 。 ’ 又寸核背酸差异数进
行校正 , 并 以简单成聚法 ( U P G M A ) 〔 ` 。 ’ 构建系统进化树 .
2 结果和讨论
苏铁的 L s 一 r R N A 5 2端区 108 个核昔酸序列已被准确测定 。 由于裸子植物迄今尚未
有 L S一 r R N A的序列报道 , 因此我们同时还测定了公认的典型裸子植物松柏类 的水松以
及另一种针叶树南方红豆杉的同源序列 , 并将这些序列与被子植物及一种绿藻的同源序
列进行了比较分析 , 结果见图 1 。 比较所得到的差异矩阵列于表 1 。 从图 1 和表 1 可以
S a t l v 昆
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图 l 杖搪体大亚基R N A S ,端保守区的核普酸序列排列 ( 本研究测定的植物宇列用圆点表
明 , 排列中仅标明与顶部序列不同的核普酸 , 而相同的核普酸则 以短划代表 )
F : 9
.
1 S e q u e n e e s a l i g n m o n t s f o r t h e e v o l u t i o n a r y e o n s e r v e d s e g m e n t o f l a r g e
s u b n u i t r RN A S
` t o r m i n o l r七9 1 0 : 1 ( T ll e s p e c i e s t h a t w e s e q 、: e n e e d i n t五1 5 、 t u d了 a 丫。
i n di e a t e d b了 f u l l e i r e l e , o n l y t h e n 认 e l e o t i d e 、 t h a t d i f f e r f r o m t h e t o P s e q 住 e n c o a r e
` h o w e d , i d e n t i t i e s a r e d e n o t e d b y h了P h e n s )
中山大学学报 ( 自然科学版 ) 第加卷
看 出 , 这是一段相当保守的核昔酸序列 , 但其已能够提供足够的分子差异来研究种子植
物各大群类之间的关系 .
表 1 r R N A序列比较 (表右上方为不同生物之间的核普酸序列差异数 , 表左下方是经过校正
后的 K n u 。值 。 )
T a b
.
2 P a i r w i s e e o m p a r i s o 且 o f r R N A s e q u e n e e s . ( T h e n u m b e r s o f n u e l e o t i d e s
d 1 f f e r e n e e s b e t w e e n a l l t五e s P e e i e s a n a l y z e d i n F i g . 1 a r e g i v e n i n t h e u P P e r r i g h t
h a l f o f t五e t a b l e , a n d e o r r e s p o n d i n g K n u e v a l u e s i n t h e I o w e r l e f t h a l f o f t h e t a b l e )
C :r G :P T
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.
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.
P a r k e a e 0
.
1 2 2
3 3 8 7 6 6 1 1
0
0
。
0 58
0
。
0 5 9
0
。
0 4 8
0
。
0 4 8
0
。
06 3
0
。
0 58
0
。
0 5 9
0
。
0 4 8
0
。
0 48
0
。
0 6 3
0
。
0 0 9
0
。
04 8
0
。
0 3 9
8
8
1 1
1 0
9
1 1
0
。
1 1 0
0
。
0 1 9
0
。
0 8 9 0
。
1 1 0
犷了
根据表 1 的数据 , 我们得到了
一个种子植物的 r R N A 系统树 ( 图
2 )
. 从树图中可以十分清楚地看
到 , 传统植物分类学中的裸子植物
与被子植物之间具有较 大 一的 分 子
差异 , 明显地分为两个 自然 类群
( m
o n o p h y l e t i e g r o o p )
: 苏铁 与
裸子植物水松 、 南方红豆杉显然构
成一个进化关系较为密 切 的 姐 妹
群 , 而所有其它被子植物则形成另
一大植物类群。 可以推测苏铁与松
杉类的分歧是在它们的共同祖先与
被子植物的祖先分歧一段时间后才
发生的 。 以绿藻作为种子植物群外
参照物种 , 苏铁对绿藻 的 K 。 u 。 值
为。 . 12 2 , 被子植物对绿藻的 平 均
K
。 。 。 值为 0 . 1 02 , 说明它们的分子
进化速度无明显差异 , 苏铁这一进
化位置并不是由于一个异常的进化
速度所造成的 。
。公六一万沈一 一旅万 ~一一 { , / .U `
图 2 种子植物的 r R N A系统树 ( 用表 1 中 的 K n u c 值
和简单成聚法 ( U P G M A )构建 . 两个物种间 的距
离仅仅与它们在 X轴 ( K n cu )上的总长度成正 比 ,
而 Y 轴上的距离是任意的 )
F i g
.
2 P h v l o g e n e t i e t r e e o f r R N A f r o rn t h e s e e d
p l a n t s ( T h e t r e e 喻 a s e o n s t r u e t e d b y u s i n g
U P G M A 扭 e t h o J w i t h t il e k n u e v a l u e s f r o口
t h e t a b l e l
。
I 众 t h i s r e P r e s e a t a t i o n , t h e d i s -
t a n e e b e t w e e n t w o s P e e i e s 15 P r o P o r t i o n a l t o
t h e s u m o f t h e P r o j
e e t i o n s o n t h e X a x i s
( K n 认 e ) o f t h e b r a n e h l e n g t h s
,
w h i l e d i s t a n e e
o n t h e Y a x i s i , a r b i t r a r y )
关于苏铁在种子植物进化中的位置 , 有三个主要的假说 : ①种子植物的祖先在与蔽
类分歧以后 , 进化成两大分支 , 一支包含银杏 、 松杉类等裸子植物 , 另一支则包含苏铁
类和被子植物 , 它们有一个直接的共同祖先称为种 子 威 ( tP c : i d os p o r m a s ) 〔 ` ’ . ② 苏
第 1期 屈良鸽等 : 苏铁在种子植物进化中的位置
铁类与其它裸子植物特别是松杉类关系较近 , 为一自然类群 , 它们的分歧发生在其共同
祖先与被子植物分歧之后 〔” 。 ③裸子植物本身不是一个自然类群 , 苏铁与松 杉 类等其
它裸子植物关系较远 , 它们沿着不同的路线演化发展 〔 ” , ` 2 ’ 。 我们的研究结果支 持了苏
铁类 、 松杉类等裸子植物作为一个自然类群与被子植物在种子植物进化早期就巳分岐的
假说 〔 “ , , 对苏铁 L s 一 r R N A部分核昔酸序列研究的结果则 与H 。 r i等 〔 3 ’ 对苏铁5 r R N A
研究所得到的结论是一致的 . 研究不同的分子数据 , 对于准确地揭示苏铁类分子进化的
特征和阐明它在种子植物进化中的位置是十分重要的 . 同时 , 随着获得更多的核昔酸序
列数据之后 , 我们将可以对苏铁类与松杉类分歧的年代进行较为精确的计算 .
此外 , 从图 2 还可以看出 , 被子植物某些科属之间的差异巳有足够的分辨率 ( 如禾
本科 、 茄科 ) , 但是 , 在我们分析的这一段核昔酸的序列中 , 没有发现南方红豆杉和水
松之间存在差异 , 这表明它们之间的分子差异小于一些被子植物科属之 间 的 差 异 , 所
以 , 这两种裸子植物的进化关系应该是非常密切的 , 我们这一结果显然与 F l or in 把红豆
杉科从松柏目分立的观点 “ “ , 相异 , 而与 H a r r is 的古生物学研究 〔 ’ ` ’ 及王伏雄 等 从胚胎
发育和解剖学研究所得到的结论〔 ’ 5 〕一致 , 即红豆杉类应该属于松柏目之下 .
今 考 文 做
〔 1 〕 M a r g u l i s L e t a l . , F i t, e k `n夕d o 沉 : , W . H . F r e e m a n , S a n F r a n e i s e o , 198 2
〔 2 〕 B o l d H C , T h e P l a 月* k`n 夕d o 从 , P r e n t i e e 一 H a l l , E n g l e w o o d C l i f f s , N . J . , 1 97 0
〔 3 〕 H o r i H e t a l . , M o l . B f o l. E z, o l . , 4 ( 1 98 7 ) , 5 , 4 4 5~ 4 72
〔 4 〕 Q u L H e t a l . , N u o l e i e 月 e ￡d : R e : . , 1 1 ( 29 53 ) , 5 9 0 3一 5 92 0
〔 5 〕 Q u L H e t a l . , J . M o l。 E o o l . , 28 ( 1 98 8 ) , 1 13~ 1 24
〔 6 〕 F T a k a i w a e t a l . , G e o e , 3 7 ( 29 55 ) , 2 5 5~ 25 9
〔 7 〕 K 15 5 T e t a l . , N u e l e i e A e f d s R e : . , 1 7 ( 19 5 9 ) , 7 96
〔 s 〕 P e r a s s o R e t a l . , N a t 。 , e , 33 9 ( 1 95 9 ) , i 魂2~ 1 4峨
〔 9 〕 K i m u r a M e t a l . , J . M o l . E o o l . , 1 6 ( 1 98 0 ) , 1 1 1~ 1 2 0
〔2 0〕 S n e r t h F H A e t a l 。 . H u m e r i e a l t a x o n o m y , W . H . F r e e m a n a n d e o rn P a n y ,
S a n F r a n e 至5 0 0 , 1 9 7 3
〔1 2〕 C h a m 卜e : l a i n C J , G夕 m ” o s P e r阴 s , S t r u e t u r e a n d E v o l u t主o n . , U n i v e r s i t } o f
C h i e a g o P r o s s
,
C h i e a g o
,
1 9 3 5
〔1 2〕 A书 福斯特等 ( 李正理译 ) , 维价植物比较形态学 , 科学出版社 , 1 9 7 4 , 3 13 一 314
〔1 3〕 F l o r i o R e t a l . , B o t . G a 二 . , 1 1 0 ( 1 94 8 ) , 31~ 3 9
〔1 4〕 H a r r i s T M , 丁人e 阴 e 左 o z o i e 夕夕 ,刀刀 。 了P e r阴 5 . , R e v i e w o f P a l a o o b o t a n y a n d
P a l y n o l o g y 2 1 ( 2 9 7 6 )
,
1
,
1 1 9~ 1 3 4
〔 1 5〕 王伏雄等 , 植物分类学报 , 1 7 ( 1 9 7 9 ) , 3 , i ~ 7
7 6 中山大学学报 ( 自然科学版 ) 第3。卷
M ol e e ul a r E v i den e e f or t he S t a t us of t he C y ea d
Cy
ea s r ev ol ut a i n S e e d一P l a n t E v ol ut i on
口 uL i a ” 夕几。 . Y 赵 Xi a o口i a ” 夕
S hi S “ 无“ a Z 丹a n g H o拄g da
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M r oe t ha n 1 00n e ul e ot i de, o f t五e 引 t e r m i n a l r e g i o n o f L s 一 r R N A f r o m C夕 e a : r e u o ·
I o t a T h u n b
, ,
G I夕P t o : t r o b。 。 P e n s il i忿 ( S t a u n t . ) K o e h a n d T a 二 。 忿 。 a i r e i ( L e m 色e e t
L 己v l ) S . Y . H u w e r e d e t e r m i n e d b y t h e r a p i d r R N A s e q u e n e i n g m e t h o d . T h e p h y ·
l o g e n e t i e t r e e o f r R N A e o n s t r
u e t e d w i t h t h e s e d a t a r e v e a l t五a t t h e C y e a d a n d e o n i -
f e r o u s t .l e e s e o n s t i t u t e a e l o s e l y r e l a t e d s i s t e r g r o u P
,
w h e r e a s t h e a n g i o s P e r m
s
f o : m a n o t五e r m o n o P h y l o t i e g r o 以 P . T h i s P o s i t i o o o f t h e C y e a d 15 n o t t h e r e s u l t o f
a n a b e r r a n t r a t e i n m o l e e u l a r e v o l u t i o n
,
i n d i e a t e d b y P y r a m i m o n a , P a r k e a e a s a n
o u t g r o u P r e f o r e n e e
.
O u
r r e s u l t , u P P o r t t h e h y P o t h e , i , t h a t t h e C y e a d a
n d e o n i f e
-
r o u s t r e e s w e r e a m o n o P h y l a t i e g r o u P a n d t h e s e P e r a t i o n o f t h e s e s P e e i e , o e e u r e d
a f t e r t五e i r s e P e r a t i o n f r o m t h e a n e e s t o r o f f l o w e r i n g P l a n t s -
K e y w o r d s C y e a s r e v o l u t a
,
g y 山 n o s P e r 口 a , P h y l o g e n e t i e e v o l u t i o n , r R N A ,
n u e l e o t i d e s e q u e n e e
. B元0 t e e h n o l o g y R e s o a : e h C 七n t e r