全 文 ：南 方 农 业 学 报 45卷
收稿日期：2014-05-31
基金项目：河池学院人才引进科研启动项目（2008QB-N001）
作者简介：高丽霞（1980-），副教授，主要从事植物种质资源创新研究工作，E-mail：hcxybio@163.com
带叶兜兰遗传多样性的SRAP分析
高丽霞，覃国乐，易桂萍
（河池学院 化学与生物工程学院，广西 宜州 546300）
摘要：【目的】从分子水平上了解带叶兜兰的遗传多样性，为带叶兜兰种质资源的保护和利用奠定基础。【方法】采
用SRAP分子标记技术，对40份采自广西木论自然保护区天然居群的野生带叶兜兰种质资源进行分析，利用Popgene
软件估算遗传多样性参数。【结果】从414对SRAP引物中筛选获得 30对能扩增稳定、清晰可辨条带的引物组合；30对引
物组合可从40份DNA样品中扩增获得256条带，每对引物扩增条带数为6~11条，平均每对引物组合扩增获得8.53条
带；其中多态性条带62条，多态性比例为12.50%~33.33%，平均多态性比例为24.22%。遗传多样性分析结果显示，Nei’s
基因多样性指数为0.1282，Shannon多样性指数为0.1582。【结论】带叶兜兰种质资源群体个体数少，个体间遗传多样性
水平较低。
关键词：野生带叶兜兰；SRAP分子标记；遗传多样性；广西木论自然保护区
中图分类号：S682.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2014）10-1734-05
0 引言
【研究意义】带叶兜兰（Paphiopedilum hirsutis-
simum）是兰科（Orchidaceae）兜兰属地生或半附生草
本植物，多生于海拔700~1500 m的常绿阔叶林下、林
缘石缝中或多石湿润土壤上，是兰科中最原始的类群
之一。因其株形娟秀，被誉为兜兰中的“美娇娘”，是室
内高档盆栽观花植物，具有科研和开发利用价值（沐
建华，2010）。带叶兜兰主要分布于广西西部至北部、
贵州西南部和云南东南部。近年来发现野生带叶兜兰
居群植株数量等分布不均匀且不连续，呈现破碎化现
象（冯昌林等，2012）。兜兰属植物是国内外公认的珍
稀濒危植物（沐建华，2010）。遗传多样性分析是揭示
濒危机制的常用方法，因此利用分子标记技术对带叶
兜兰种质资源的遗传多样性进行分析，对挖掘和培育
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2014.10.1734
南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2014，45（10）：1734-1738
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.cn
Genetic diversity analysis of Paphiopedilum hirsutissimum
by SRAP marker
GAO Li-xia，QIN Guo-le，YI Gui-ping
（Chemical and Biological Engineering College，Hechi University，Yizhou，Guangxi 546300，China）
Abstract： 【Objective】The genetic diversity of Paphiopedilum hirsutissimum was analyzed on the molecular level in
order to lay the foundation for protection and application of its germplasm resources. 【Method】The genetic diversities of
40 wild germplasm resources of Paphiopedilum hirsutissimum collected from Guangxi Mulun natural reserve area were
analyzed by using SRAP marker technology. The indices of genetic diversity were estimated by POPGENE software.
【Results】Among 414 pairs of SRAP-PCR primers, 30 pairs of primer combinations could amplify stable and clear
discernible bands. By using 30 pairs of primer combinations, 256 bands could be amplified from 40 DNA samples.
Each pair primer could amplify 6 -11 bands and the average was 8.53 bands. Out of 256 bands， 62 bands were
polymorphic, which accounted for 12.50%-33.33% with an average of 24.22% . The results of genetic diversity indi-
cated that Nei’s gene diversity index was 0.1282， and Shannon’s information index was 0.1582. 【Conclusion】There is
low level of geneticst diversity amongst individuals of Paphiopedilum hirsutissimum germplasm resources being less
population individuals.
Key words： Paphiopedilum hirsutissimum； SRAP marker； genetic diversity； Guangxi Mulun natural reserve area
10期
带叶兜兰新品种具有重要的实际意义。【前人研究进
展】近年来，已有学者利用各种分子标记技术对兜兰
分类鉴定和亲缘分析等方面进行研究。Min和Tan
（1996）用RAPD分析3种兜兰的遗传多态性，发现小
叶兜兰（P. barbigerum）的RAPD位点的多态性高于胼
胝兜兰（P. callosum）和雪白兜兰（P. niveum）。李昂等
（2002）利用RAPD技术研究硬叶兜兰和麻栗坡兜兰，
认为其遗传多样性偏低而群体间遗传分化较高，主要
原因在于人为的过度采挖和生境的片断化。孙彩云等
（2005）应用RAPD和同工酶对中国兜兰种间亲缘关系
进行分析，其结果与Cribb（1998）和陈心启（1999）的传
统分类大致吻合。陈业等（2013）利用ISSR标记对23种
中国兜兰属植物进行了亲缘关系分析，将其划分为3
个类群。李宗艳等（2013）利用SRAP标记分析了滇东
的硬叶兜兰的遗传多样性，发现其在物种水平上多态
性较高，居群内的多态性较低。【本研究切入点】SRAP
标记因其重复性好、遗传多样性高、引物无物种特异
性，已在越来越多的物种中被广泛应用。带叶兜兰作
为兰科中最为原始的类群之一，但采用SRAP标记对
其遗传多样性进行研究尚未见报道。【拟解决的关键
问题】利用SRAP标记对广西木论自然保护区野生带
叶兜兰资源进行遗传多样性分析，旨在从分子水平对
目前带叶兜兰的遗传背景进行了解，为今后带叶兜兰
种质资源的保护和利用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为40份带叶兜兰，均采自广西木论自然
保护区的天然居群。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 DNA提取 选取新鲜带叶兜兰的嫩叶，清洗、
滤纸擦干后经液氮研磨，按Murray和Thompson（1980）
的CTAB法提取叶片总DNA，用Eppendorf核酸蛋白检
测仪检测DNA质量。
1. 2. 2 SRAP扩增 参照高丽霞等（2008）的方法和
引物进行SRAP扩增。其中，正向引物18条、反向引物
23条（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合
成。共组合成414对引物，用一份DNA样品进行筛选，
选择条带清晰且数目较多的引物组合用作遗传多样
性分析。电泳后拍照，分析带型。
表 1 所用SRAP引物
Tab.1 SRAP primers used in this study
引物名称 Primer name 正向引物（5′-3′）Forward primer 引物名称 Primer name 反向引物（5′-3′）Reverse primer
F1 TGAGTCCAAACCGGATA R1 GACTGCGTACGAATTAAT
F2 TGAGTCCAA ACCGGAGC R2 GACTGCGTACGAATTTGC
F3 TGAGTCCAA ACCGGAAT R3 GAC TGCGTACGAATTGAC
F4 TGAGTCCAAACCGGACC R4 GACTGCGTACGAATTTGA
F5 TGAGTCCAAACCGGAAG R5 GACTGCGTACGAATTAAC
F6 TGAGTCCAAACCGGACA R6 GACTGCGTACGAATTGCA
F7 TGAGTCCAAACCGGACG R7 GACTGCGTACGAATTCAA
F8 TGAGTCCAAACCGGACT R8 GACTGCGTACGAATTCAC
F9 TGAGTCCAAACCGGAGG R9 GACTGCGTACGAATTCAG
F10 TGAGTCCAAACCGGAAA R10 GACTGCGTACGAATTCAT
F11 GTAGCACAAGCCGGAGC R11 GACTGCGTACGAATTCTA
F12 GTAGCACAAGCCGGACC R12 GACTGCGTACGAATTCTC
F13 CGAATCTTAGCCGGATA R13 GACTGCGTACGAATTCTG
F14 CGAATCTTAGCCGGAGC R14 GACTGCGTACGAATTCTT
F15 CGAATCTTAGCCGGCAC R15 GACTGCGTACGAATTGAT
F16 CGAATCTTAGCCGGAAT R16 GACTGCGTACGAATTGTC
F17 GATCCAGTTACCGGCAC R17 GACTGCGTACGAATTGAG
F18 GATCCAGTTACCGGAAT R18 GACTGCGTACGAATTGCC
R19 GACTGCGTACGAATTTCA
R20 GACACCGTACGAATTGAC
R21 GACACCGTACGAATTTGA
R22 CGCACGTCCGTAATTAAC
R23 CGCACGTCCGTAATTCCA
1. 2. 3 遗传多样性分析 对电泳图谱上有差异、易
于识别、清晰、可重复的多态性条带进行统计，统计每
对引物扩增出的总条带数和多态性条带数。同一迁移
位置有清晰且可重复条带记为1，没有条带记为0，由
此生成0和1原始矩阵。采用Popgene软件计算带叶兜
兰的遗传多样性指数。
2 结果与分析
2. 1 SRAP引物筛选
对提取的40份DNA样品进行检测，其OD260/OD280
为1.8~2.0，可以用于SRAP引物筛选和遗传多样性分
析。扩增结果表明，在414对引物中有326对引物能够
扩增出条带，其中30对引物组合的条带清晰、稳定性
高丽霞等：带叶兜兰遗传多样性的SRAP分析 1735· ·
南 方 农 业 学 报 45卷
高、多态性好，可用于遗传多样性分析。在30对引物组
合中，每对引物均扩增获得差异片段，每对引物扩增
的位点数为6~11个，多态性位点数为1~3个，多态性比
例为12.50%~33.33%（表2）。
2. 2 带叶兜兰SRAP-PCR扩增结果
利用筛选的30对引物组合对40份带叶兜兰样品
进行PCR扩增，共获得256条清晰条带，平均每对引物
组合扩增获得8.53条带；其中多态性条带62条，平均每
对引物组合产生2.06条，平均多态性比例为24.22%。图
1和图2为引物组合F9R1、F11R1对40份带叶兜兰DNA
样品的扩增结果。
2. 3 带叶兜兰的遗传多样性
利用Popgene软件对各位点的Nei’s基因多样性指
数（He）和Shannon信息多样性指数（I）等参数进行分
析，结果表明，多态性位点比例平均为24.22%，有效等
位基因数（Ae）为1.235，Nei’s基因多样性指数为
0.1282，Shannon信息多样性指数为0.1582。综上所述，
40份带叶兜兰种质的遗传变异处于较低水平，遗传多
样性不够丰富。
3 讨论
物种遗传多样性复杂程度决定其亲缘关系的远
近，是生态稳定性和选育种的基础。多态性位点比率
在50%以上即被认为物种多样性丰富。近年来，部
表 2 各引物对SRAP-PCR扩增的多态性位点
Tab.2 Polymorphic locations for each pair of primer in SRAP-
PCR amplification
引物组合 扩增位点数 多态性位点数 多态性位点比例（%）
Primer Total loci Polymorphic Polymorphic loci
pair loci proportion
F4R22 9 2 22.22
F12R1 7 2 28.57
F6R4 6 1 16.67
F5R20 8 2 25.00
F11R22 7 2 28.57
F12R2 9 2 22.22
F11R21 8 2 25.00
F12R12 7 1 14.29
F10R17 9 2 22.22
F10R11 8 1 12.50
F11R14 6 2 33.33
F11R15 8 2 25.00
F10R16 9 2 22.22
F10R15 7 2 28.57
F11R7 9 2 22.22
F11R4 7 2 28.57
F11R1 8 2 25.00
F10R23 9 2 22.22
F10R22 6 1 16.67
F10R18 10 2 20.00
F9R1 10 3 30.00
F9R3 9 2 22.22
F9R7 9 2 22.22
F9R12 11 3 27.27
F9R13 10 3 30.00
F9R17 9 3 33.33
F9R15 11 3 27.27
F9R16 9 2 22.22
F9R8 10 2 20.00
F9R14 11 3 27.27
合计 Total 256 62 24.22
图 1 引物组合F9R1对40份带叶兜兰DNA的扩增结果
Fig.1 SRAP-PCR amplification products in DNA samples of 40 Paphiopedilum hirsutissimum by using primer pair F9R1
M：DNAMarker；1~40：40份带叶兜兰材料 Forty accessions of Paphiopedilum hirsutissimum
图 2 引物组合F11R1对40份带叶兜兰DNA的扩增结果
Fig.2 SRAP-PCR amplification products in DNA samples of 40 Paphiopedilum hirsutissimum by using primer pair F11R1
M：DNAMarker；1~40：40份带叶兜兰材料 Forty accessions of Paphiopedilum hirsutissimum
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M
1736· ·
10期
分学者采用SRAP分子标记对不同作物的亲缘关系、
遗传多样性等进行研究（安泽山等，2014；孙建等，
2014；杨海健等，2014）。黄玉仙等（2011）用30对SRAP
引物研究我国94份山药种质资源的遗传多样性，共扩
增出754个稳定扩增位点，其中多态性位点616个，多
态位点比率达81.7%。马红勃等（2011）用29对SRAP引
物组合对来源于不同国家和地区的42个大花蕙兰品
种及4个国兰原生种之间的遗传亲缘关系、遗传结构
和遗传变异进行研究，共扩增获得398个稳定扩增位
点，其中387个存在多态性位点，多态性位比率高达
97.2%。本研究从414对引物组合中筛选出30对谱带清
晰、可重复的引物组合，对40份带叶兜兰种质资源进
行扩增，通过对扩增结果进行统计分析，所选试材的
多态性位点比率为24.22%，与Li等（2002）对兜兰的研
究结果较接近。一个种群多态位点比率较高，说明这
个种群适应环境能力较强；反之，这个种群适应环境
能力较弱，在长期的进化中被淘汰的可能性就越大
（蒿若超等，2007）。在本研究中，40份带叶兜兰的多态
性位点比率较低，可能与居群数少及个体来源地差异
不明显有关。因此，为了利用带叶兜兰种质资源，须扩
大带叶兜兰种质资源的收集地和数量。
Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数
是反应遗传多样性的重要指数，不同物种该指数相差
很大。商韬等（2013）对迎春樱自然居群进行了遗传多
样性分析，发现其Nei’s多样性指数达0.499，Shannon
信息多样性指数达0.8515。濒危植物的多样性指数一
般较低，Li等（2002）对硬叶兜兰、麻栗坡兜兰的遗传
多样性进行研究，发现硬叶兜兰的物种水平Nei’s的
基因多样性指数为0.217，Shannon信息多样性指数为
0.3301；麻栗坡兜兰Nei’s的基因多样性指数为
0.1174，Shannon信息多样性指数为0.1764。在本研究
中，40份带叶兜兰的Nei’s基因多样性指数为0.1282，
Shannon信息多样性指数为0.1582。由此可见，带叶兜
兰的遗传多样性指数和硬叶兜兰、麻栗坡兜兰较接
近，且整体遗传多样性水平相对较低，遗传变异小，
导致其进化潜力有限，很难扩大分布范围和开拓新
的生境。
带叶兜兰遗传多样性水平低，可能与带叶兜兰的
生境、分布范围、采集地点及其自身的遗传变异特性
和濒临稀少等因素有关。野生带叶兜兰主要分布在海
拔700~1500 m的常绿阔叶林下、林缘石缝中或多石湿
润土壤上，随着海拔高度的不同，兜兰的生境呈现垂
直变化；加上采集地域的宽窄，也会造成居群遗传多
样性水平的差异。目前许多珍稀濒危植物正面临种群
数量、面积和生境的破坏，从而加剧了其遗传多样性
的变化。带叶兜兰也正经历着这样的变化，加上居群
个体较少，由于保护不及时，生境遭破坏片段化严重，
易发生遗传漂变，从而导致居群内遗传变异降低，具
体原因还有待于进一步研究。
4 结论
广西木论国家级自然保护区带叶兜兰的天然居
群个体数少，个体间遗传多样性水平较低，导致其分
化潜能有限，难以开发新的生境，需要人工干预以提
高其遗传多样性。
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（责任编辑 韦莉萍）
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