全 文 ：第 !"卷 第 #$期
$ % % &年 #$ 月
林 业 科 学
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构树 ’7-8分子标记"
刘志远#，$ 范卫红#，$ 沈世华#
（#2 中国科学院植物研究所 光合作用与环境分子生理学重点实验室 北京 #%%%&9； $2 中国科学院研究生院 北京 #%%%9&）
摘 要： 建立构树 3+-提取方法及最佳 ’7-8:8(7反应体系，用 ’7-8分子标记研究构树种质资源的遗传多样
性。结果表明：’7-8扩增的清晰条带大小在 #%% ; # %%% <=，用 #>对引物对 $#份材料扩增出 !9&条带，其中多态性
条带 9#&条，占 >$2?@，’ABCC0C信息指数（ !）均值为 %2$$> "，物种水平的 +4D基因多样性（"）均值为%2#99 ?，表明构
树的遗传多样性不高。聚类分析结果显示与地理分布有相关性。同时发现一些特异性条带，可以转化为 ’(-7标
记，这为构树的遗传图谱构建、遗传育种等研究提供了参考。
关键词： 构树；’7-8分子标记；遗传多样性；’(-7标记
中图分类号：’>#E2!?；F&!92$ 文献标识码：- 文章编号：#%%# G >!EE（$%%&）#$ G %%"! G %"
收稿日期：$%%E G ## G #$。
基金项目：中国科学院知识创新工程重点方向性项目（H’(I$ G JKG L G %9"）。
" 沈世华为通讯作者。
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#,-.’&/.： ;*)9//)0$+1’ B’B%*1,$*’ DR DS=0TUBCU VDUA DUR 4CWDT0CS4CUB1 =T0U45UD0C WB1M4 BCX 450C0SD5 WB1M4 6 )C UADR T4=0TU，
Q4C4UD5 XDW4TRDUO BCX Q4C4UD5 T41BUD0CRAD= V4T4 BCB1OY4X B’B%*1,$*’ BCX UA4C BC 0=UDSB1 ’7-8:8(7 RORU4S VBR 4RUB<1DRA4X6 ,A4 T4RM1UR RA0V4X UABU UA4 <= V4T4 514BT1O XDR=1BO4X6 - U0UB1 !9& =BDTR 0\ =TDS4TR，BS0CQ VAD5A 9#& B550MCUDCQ \0T S0T4 UABC >$2?@ 0\ UA4 U0UB1 V4T4 T4R=45UDW41O %2$$> " BCX %2#99 ?，VAD5A DCXD5BU4X Q4C4UD5 XDW4TRDUO 0\ ; 6 B’B%*1,$*’ VBR C0U ADQA6 ,A4 51MRU4T BCB1ORDR
T4W4B14X UA4T4 VBR T41BUD0CRAD= <4UV44C UA4 Q4C4UD5 WBTDBUD0C BCX Q40QTB=AD5B1 XDRUTDV4T4 \0MCX4X BCX 50M1X <4 50CW4TU4X DCU0 ’(-7 SBTZ4TR 6 ,ADR T4R4BT5A V0M1X =T0WDX4 T4\4T4C54 \0T SBZDCQ Q4C4UD5 SB= BCX
0)1 23’4-： ;*)9//)0$+1’ B’B%*1,$*’；’7-8 SBTZ4T；Q4C4UD5 XDW4TRDUO；’(-7 SBTZ4T
构树（;*)9//)0$+1’ B’B%*1,$*’），主要分布于中国、
马来半岛、日本、太平洋群岛（郑汉臣等，$%%!），属桑
科（^0TB54B4）构树属（;*)9//)0$+1’），是一种重要的速
生绿化树种。构树具有重要的经济价值，构树皮是
一种十分优良的造纸原料，其叶片也可用作饲料。
此外，构树还具有重要的药用价值（杨小建等，
$%%>）。目前对构树的研究主要集中于栽培、生理以
及药理方面，在分子生物学方面的研究较少，仅见报
道过从光叶楮（;*)9//)0$+1’ B’B%*1,$*’）中克隆肌动蛋
白基因片段（李岩等，$%%>）。构树集诸多优良性状
于一身，具有广阔的发展前景，但由于其遗传背景不
清楚，因而给遗传育种及推广带来了很大困难。
遗传标记作为基因型的易于识别的表现形式，
在植物种质资源研究和育种工作中有着重要的地
位。随着分子生物学的发展，遗传标记已经从形态
学标记、细胞标记、生化标记发展到第 !代———3+-
分子标记。序列相关扩增多态性（’7-8）分子标记
技术是 .D和 FMDT0R（$%%#）发明的可用来研究植物遗
传育种的一种新颖有效的分子标记技术，又称基于
序 列 扩 增 多 态 性（ R4_M4C54:=01OS0T=ADRS，’‘-8），其最大特点是针对基因的阅读
框区域设计引物进行扩增而产生多态性，同时也具
有简便、中等产量、高共显性、重复性好、易于分离条
带及测序等优点（李巧燕等，$%%?）。本研究建立了
构树基因组 3+-的提取方法及构树的 ’7-8反应体
系，通过 ’7-8分子标记对我国以及日本典型分布
区的构树资源进行遗传多样性检测，分析不同地区
构树的遗传资源多样性，同时找到一些特异性条带
可转 化 为 !"#$（ %&’(&)*& *+,-,*.&-/0&1 ,234/5/&1
-&6/7)%）标记，为研究构树的遗传多样性及育种奠定
基础。
8 材料与方法
!"! 主要试剂和材料
"9#:提取缓冲液：;< "9#:，8== 2274·>? 8
9-/%@A"4（3A BC=），;= 2274·>? 8 DE9#（3A BC=），8<
FGF（分子质量：H= I(），8CH 2274·>? 8 J,"4。
供试材料来源见表 8，采样分布地区见图 8。
表 ! 供试的构树材料来源
#$%&! ’()* +, ! & "#"$%&’(%# -+.$-(*/
编号
J7
来源地
>7*,4/.K
8 云南西双版纳 L/%+(,)6M,)),，N()),)
; 云南西双版纳 L/%+(,)6M,)),，N()),)
O 云南西双版纳 L/%+(,)6M,)),，N()),)
H 广东广州 P(,)60+7(，P(,)617)6
Q 湖南靖州 R/)60+7(，A(),)
S 湖南靖州 R/)60+7(，A(),)
T 湖南靖州 R/)60+7(，A(),)
B 日本 R,3,)
U 贵州黎平 >/3/)6，P(/0+7(
8= 重庆綦江 V/W/,)6，"+7)6’/)6
88 重庆武隆 X(47)6，"+7)6’/)6
8; 重庆彭水 F&)6%+(/，"+7)6’/)6
8O 重庆酉阳 N7(K,)6，"+7)6’/)6
8H 四川都江堰 E(W/,)6K,)，!/*+(,)
8Q 河北元氏 N(,)%+/，A&M&/
8S 北京 :&/W/)6
8T 北京 :&/W/)6
8B 北京 :&/W/)6
8U 辽宁大连 E,4/,)，>/,7)/)6
;= 辽宁大连 E,4/,)，>/,7)/)6
;8 辽宁大连 E,4/,)，>/,7)/)6
图 8 ;8份构树样品分布图
Y/6Z 8 E/%.-/M(./7) 75 ;8 %,234&% 75 ! Z "#"$%&’(%#
!"0 方法
8C;C8 构树基因组 EJ#提取 大量 EJ#提取采用
改进的 "9#:法。称取 =CQ 6 新鲜构树叶片，用液氮
研磨成粉末，倒入盛有 Q 2> "9#:溶液的离心管中，
先加入 =C8 6 FGFF，再加入 ;=!>"?巯基乙醇，轻轻
摇匀，SQ [水浴 HQ 2/)，冷却至室温。加入等体积
的氯仿\异戊醇（体积比为 ;H ] 8），颠倒数次，静置 8=
2/)。8= === -\2/)? 8离心 8= 2/)，取上清加入等体积
氯仿抽提。8= === -·2/)? 8离心 8= 2/)，取上清加入
8\;体积的氯化钠溶液（Q 2274·>? 8），再加入等体积
的预冷异丙醇 ? ;= [沉淀 O= 2/)。TQ<乙醇洗沉淀
;次，于超净工作台上晾干。加入 Q==!>双蒸水溶
解，取 ;=!> EJ#溶液进行琼脂糖凝胶电泳检测后
保存于 ? ;= [。
8C;C; EJ# 扩增 !$#F 的 F"$ 程序参考 >/ 和
V(/-7%（;==8）的方法，所用 !$#F 引物见表 ;。F"$
反应程序：UH [预变性 Q 2/)，反应前 Q 个循环：UH
[ 8 2/)，OQ [ 8 2/)，T; [ 8 2/)；后 OQ个循环：UH
[ 8 2/)，Q= [ 8 2/)，T; [ 8 2/)；最后 T; [延伸
T 2/)。最佳反应体系建立参照正交试验设计原则，
先确定反应体系中的最佳模板浓度，在此基础上再
分别确定 1J9F 浓度和 ^6; _ 最佳浓度比、引物和
^6; _最佳浓度比，进而确定最佳反应条件。
表 0 试验所用 1234引物
#$%&0 1234 56(786) 9)8: (; *<8 8=586(78;*
上游引物
Y7-‘,-1 3-/2&-%（Qa!Oa）
下游引物
$&b&-%& 3-/2&-%（Qa!Oa）
^D8 9P#P9""###""PP#9" D^8 P#"9P"P9#"P##99#"P
^D; 9P#P9""###""PP#9P D^; P#"9P"P9#"P##99#P"
^DO 9P#P9""###""PP##9 D^O P#"9P"P9#"P##99#"9
^DH 9P#P9""###""PP##" D^H P#"9P"P9#"P##99P""
^DQ 9P#P9""###""PP9#" D^Q P#"9P"P9#"P##99P#"
^DS 9P#P9""###""PP9#9 D^S P#"9P"P9#"P##99P#P
^DT 9P#P9""###""PP"#9 D^T P#"9P"P9#"P##99P"P
^DB 9P#P9""###""PP"99 D^B P#"9P"P9#"P##99"#9
^DU 9P#P9""###""PP9#P D^U P#"9P"P9#"P##99"P9
^D8= 9P#P9""###""PP99" D^8= P#"9P"P9#"P##99""9
D^88 P#"9P"P9#"P##999P"
D^8; P#"9P"P9#"P##999"P
8C;CO 聚丙烯酰胺凝胶电泳 扩增产物在浓度为
S<的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺
质量比为 ;S ] 8）中电泳，电极缓冲液为 8 c 9:D
M(55&-，电流 Q= 2#，恒电流跑约 ; +，直至指示剂二甲
苯青距玻璃板下部边缘 8\O处停止。
8C;CH 银染 参照 !,)6(/)&../等（8UUH）的方法。
8C;CQ 图像扫描与分析 凝胶用 d^#L F7‘&- >77I
;8==扫描仪（^,e/(29&*+，9,/3&/，"+/),）扫描（分辨率
O== 13/）。
!"> 数据处理与分析
结果记录的标准是在同一迁移率上，有带记为
“8”，无带记为“=”，转换成 = 8矩阵。数据统计利
用 J9!N!3*;C8=&（$7+45，8UUB）软件分析，用 !A#J程
QQ第 8;期 刘志远等：构树 !$#F分子标记
序中的 !"#$%（&’()*+,-). /0*1 +12&/ 3)-,2. &4*’+
01*-,3)-*5 06)10+)）方法进行聚类分析，并通过 71))
/82-模块生成聚类图。同时运用 "2/+)’)9:;< 软件
进行遗传多样性分析、=,0’’2’信息指数及物种水平
的 >)*基因多样性等分析。
!"# 大连构树特异性片段扩增引物
上游引物 $9：?@A77B77#B7%#7B%B##7777%
%777A;@，下游引物 $<：?@A#7%##%##%###%#BBB
%7%##777A;@。"BC扩增反应：预变性DE F ? 3*’；
DE F ;G 4，?H F ;G 4，I< F ;G 4，共 EG个循环；最后
I< F延伸 9G 3*’。9J琼脂糖凝胶电泳检测 "BC扩
增结果，目的片段回收并测序。
< 结果与分析
$"! 构树叶片 %&’的提取
K>%的提取质量是决定 =C%"标记成功与否的
关键。由于构树叶片中含有大量的糖类及酚类等杂
质，而一般 B7%L方法（王关林等，9DDM）去除多糖效
果不明显，多糖等杂质残留在点样孔周围（图 <%），
所以与多糖理化性质很相近的 C>%等杂质很难除
去，所提的构树 K>%质量较差，严重影响了后续试
验操作。而本试验中加入的高浓度的盐有效地减少
了多糖，改进后的方法所提的 K>% 质量明显提高
（图 图 < <种方法所获得的构树基因组总 K>%
N*+O < #)’23*5 K>% 2P ! O "#"$%&’(%# QR -(2 3)-,2.4
$：标记物 $01S)1 O 下同。7,) 403) Q)82(O
$"$ ()’*反应体系建立
通过正交试验设计，确定最佳 =C%"A"BC 反应
体系各成分浓度为：模板 K>% E ’+·!T
U 9，$+< V浓度
<:G 3328·TU 9，.>7" 浓度 G:H 3328·TU 9，引物浓度
G:M 3328·TU 9，)#* K>%聚合酶 G:GI? !·!T
U 9，可以
扩增出清晰、多态性高及重复性好的谱带（图 ;）。
$"+ 构树遗传资源多样性及地理分布相关性
从 99I对引物（表 ;）。这 9I对引物对 <9份样品扩增共
产生 E;D条扩增带，平均每对引物产生 图 ; 引物组合 $WEXW$M扩增 <9份构树样品的结果
N*+O ; %3/8*P*50-*2’ 2P K>% P123 <9 403/8)4 2P ! O "#"$%&’(%#
&4*’+ /1*3)1 523Q*’0-*2’ $WEXW$M
其中多态性条带有 ;9D条，占 I<:HJ以上；9对引物
最多能产生 ;G条多态性片段，多态性比率最高的有
9GGJ，可见 =C%" 多态性还是较高的。经聚类分
析，从图 E可以看出，遗传距离差距最大的是云南西
双版纳和日本的构树；在相似系数 G:?I 附近，可以
将 <9 份构树样品分成 < 大类：一类为中国大陆构
树，另一类为日本构树。这可能是因为日本很久以
前就和大陆分离，其构树和其他地区（大陆）构树之
间基因交流间断，因而进化缓慢或者很少发生变化，
从而导致 <个地方构树之间遗传距离差距巨大。在
G:M?附近，大陆构树又可以分成 < 大类：云南西双
版纳和其他地区 <个派系；在 G:D9附近，广东广州
和湖南以及贵州构树聚为一类，重庆、四川、河北、北
京以及大连构树聚为一类，基本上和地理气候分布
一致（图 9）。
表 + !,对 ()’*引物扩增结果
-./0+ -12 3245674 89 !, :.;34 89 ()’*
:3;<234 .<:6;9;=.7;8>
引物组合
"1*3)1
523Q*’0-*2’
多态性条带
"28R321/,*5
Q0’.4
总条带数
72-08 ’&3Q)1
2P Q0’.4
多态性比率
")15)’-0+) 2P
/28R321/,*5 Q0’.4XJ
$W9GXW$< M 99 I<:I
$WMXW$; $W;XW$E ;G ;I M9:9
$W;XW$? 99 $WIXW$? $WIXW$H H D HH:I
$WHXW$H $WIXW$I <; ;G IH:I
$WDXW$I $WEXW$M 9H $W?XW$M 9H $WDXW$M ;G ;H M;:;
$W9GXW$9G <; ;G IH:I
$WIXW$99 << << 9GG:G
$WEXW$99 9; $W$WMXW$9< 9; 9D HM:E
总计 72-08 ;9D E;D I<:H
H? 林 业 科 学 E?卷
用 !"#$%&%’()* 软件分析，+%, 常数均值为
-(’)) .，/01&&"&信息指数均值为 -(**2 3，总体上构
树的遗传多样性不高，与其近亲桑树（!"#$%）相差不
大（赵卫国等，*--4）。
图 5 *’份构树样品聚类图
6,$7 5 8%&9:"$:1; $%&%:1<%9 => /?@! 91<1 AB,&$
C!DE@ ;%<0"9 1;"&$ *’ B1;#F%B "G & 7 ’(’)#*+,#(
’ H *’见表 ’。
’ H *’ B%% I1=7 ’ 7 下同。I0% B1;% =%F"J7
!"# 大连构树特征性条带
用引物 EK4LKE’*进行扩增发现大连构树的 ’
条约 5-- =#的特征性条带，回收、测序，序列见图 3。
设计引物 E’LE* 再对 *’ 份样品进行扩增，发现得
到 *条稳定的特征性条带（图 .），经测序证实条带 ’
为以引物 E*为上游引物、E’为下游引物扩增所得
到的，条带 *为目的条带，与图 5中特征性条带序列
一致，可能成功转化为大连构树 /M@?标记。
图 3 大连构树特异性片段全序列
6,$7 3 N0"F% B#%O,G,O B%PA%&O% "G 81F,1& & 7 ’(’)#*+,#(
横线处为引物序列。
I0% #:,;%:B 1:% A&9%:F,&%97
图 . 大连构树 /M@?标记
6,$7 . /M@? ;1:Q%: "G 81F,1& & 7 ’(’)#*+,#(
) 讨论
构树作为一种优良的速生造纸原料，同时也是
一种具有重要经济价值和环保价值的树种，由于其
遗传背景知之甚少，严重制约了其推广应用。因此
如何拓宽构树种质资源，挖掘有价值的种质资源材
料已成为当今构树产业化一个急需解决的问题。随
着现代科学技术的快速发展，应用现代生物技术与
传统常规技术结合，可通过种质创新与分子辅助育
种为构树的推广应用奠定良好的基础，而 /?@!分
子标记技术为实现这一目标提供了一条良好途径。
虽然 /?@!标记技术具有很多优点，但它同样
是一种基于 !M?的分子标记技术，依然会受到诸多
因素的影响，包括模板 8+@质量、E$* R、9+I!、引物
浓度等（邹喻萍等，*--’）。本试验中在 8+@提取过
程中加入了少许 !S!!来吸附色素，巯基乙醇防止
酚类氧化，去除酚类等杂质效果较明显，尤其加入高
浓度的盐可以有效地除去多糖类物质，因而可以获
得质量较高的基因组 8+@（图 *T）。在 /?@!反应体
系中，通过设计正交试验，充分考虑各种因素，建立
最佳体系，为后续试验奠定了良好基础。
目前，/?@!分子标记在遗传多样性检测（6%::,"F
,- (. 7，*--)；KB#UB,<" ,- (. 7，*--2）、基因定位（潘俊松
等，*--3）、特异表型性状定位（郭庆华等，*--2）、遗
传图谱构建（林忠旭等，*--)；D1" ,- (. 7，*--4）、比较
基因组学（V, ,- (. 7，*--)）、遗传多样性分析（W1& ,-
(. 7，*--4）、植物分子育种（+1$F ,- (. 7，*--2）、8+@指
纹图谱分析（@0;19 ,- (. 7，*--4）等方面都得到了广
泛应用。本试验中，’2 对 /?@!引物扩增出 5)X 条
带，其中多态性条带 )’X 条，比例超过 2-Y。对 *’
份材料进行聚类分析表明，’-个不同地方的构树可
以分为日本和大陆 *大类，可能是由于日本作为一
个岛国和大陆分离久远，和大陆构树之间基因交流
中断，加上面积狭小，品种之间基因交流缓慢，因此
二者遗传距离差距较大。大陆构树从聚类分析结果
来看，其分布基本上都和特定地理条件相关，因此挖
掘一些具有能够适应极端气候条件基因资源的构
树，对于构树应用、品种选育具有重要实质意义。本
试验找到 ’个大连构树特有片段并转换成稳定性更
好的 /M@?标记，但尚需扩大样本进一步验证，可能
对实践具有一定的指导意义。
参 考 文 献
郭庆华，郭美丽 7*--2 7与红花苞叶刺性状紧密连锁的 /?@!分子标记
研究 7药学学报，5*（2）：2X5 H 2X27
23第 ’*期 刘志远等：构树 /?@!分子标记
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医学杂志，$（)）：)$* + )$, !
李 岩，李 冠 !"##* !光叶楮肌动蛋白基因片段的克隆及其序列分
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（责任编辑 徐 红）
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