全 文 ：书江西农业学报 2012，24(9) :60 ～ 62
Acta Agriculturae Jiangxi
槟榔 SSR反应体系的建立
战晴晴，周亚奎，杨 云，甘炳春* ，卢丽兰
收稿日期:2012 －06 －21
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目 (2011BAI01B07) ;海南省自然科学基金(311094，310109);海南省中药现代化专项(2011ZY008)。
作者简介:战晴晴(1984─) ，女，黑龙江人，研究实习员，主要从事药用植物分子生物学研究。* 通讯作者:甘炳春。
(中国医学科学院、北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所 海南省南药资源保护与开发重点实验室，海南 万宁 571533)
摘 要:以鸡心槟榔为试材，用 QIAGEN公司的 DNeasy Plant Mini Kit 提取基因组 DNA，对 SSR 反应体系进行建立与优
化，探讨了槟榔 SSR技术中 PCR体系的主要成分对扩增结果的影响。最终确定了引物 C7549 的最佳退火温度为 56 ℃，在
PCR反应体系中最佳条件:Mg2 +浓度为 3． 0 mmol /L，dNTPs浓度为 0． 1 mmol /L，Taq酶量为 1． 5 U，引物浓度为 0． 8 μmol /L，
DNA模板为 2． 0 ng /μL。利用此反应体系对部分槟榔品种进行 PCR扩增并 Page胶电泳检测，扩增结果清晰且有较高的多态
性，表明该体系适合槟榔的亲缘关系分析。
关键词:槟榔;SSR;反应体系
中图分类号:S792． 91 文献标识码:A 文章编号:1001 －8581(2012)09 －0060 －03
Establishment of SSR Reaction System for Areca catechu
ZHAN Qing － qing，ZHOU Ya － kui，YANG Yun，GAN Bing － chun* ，LU Li － lan
(Hainan Branch of Medicinal Plant Research Institute，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College;
Hainan Provincial Key Laboratory of Southern Medicine Resources Protection and Development，Wanning 571533，China)
Abstract:Genomic DNA was extracted from betelnut (Areca catechu L．)variety“Jixin”by DNeasy Plant Mini Kit of QIAGEN
Company，the SSR reaction system for betelnut was established and optimized，and the effects of key components of PCR system in the
SSR technology for betelnut on the amplification results were explored． The results showed that the best annealing temperatures for the
primer C7549 was 56 ℃，and the optimum 20 μL PCR reaction system included 3． 0 mmol /L Mg2 +，0． 1 mmol /L dNTPs，1． 5 U Taq
DNA polymerase，0． 8 μmol /L primer，2． 0 ng /μL DNA template． The PCR amplification and Page gel electrophoresis detection on
some betelnut cultivars were conducted by using the above reaction system． The amplification results were distinct and had high poly-
morphism，indicating that this system was suitable for the analysis of betelnut phylogenetic relationship．
Key words:Betelnut;SSR;Reaction system
槟榔(Areca catechu L．)为棕榈科槟榔属常绿乔木，
因其具有重要的药用价值而被誉为四大南药之首。在我
国槟榔已有两千多年栽培历史，主要种植于海南和台湾。
在长期的自然进化和人工栽培驯化的过程中，形成许多
变种、品种和类型。目前，国内外应用分子标记技术对槟
榔资源研究的报道只有一篇，任军方［1 －2］利用 ISSR分子
标记对海南省保亭县 3个地点的槟榔进行了遗传多样性
分析。因为有效分子标记的缺乏，一定程度上影响了对
槟榔种质资源的研究与利用。
SSR (Simple Sequence Repeat，简单重复序列)是一
类由几个碱基组成的基序串联重复而成的 DNA序列，通
常又称为微卫星 DNA。SSR分子标记具有以下优点:数
量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高;多等位基因
特性，提供的信息量高;以孟德尔方式遗传，呈共显性。
被认为是研究群体遗传变异最好的标记方法之一［3 －5］。
该技术已在椰子［6］、橡胶［7 －8］等棕榈科植物的种质资源
遗传多样性及遗传图谱的构建中得到应用，但有关槟榔
SSR的研究国内外还未见报道。SSR 反应涉及很多因
素，每个因素都会对整个反应体系有较大的影响，因此，
本研究对槟榔的 SSR反应体系进行建立与优化，以期为
槟榔种质资源鉴定和遗传多样性的研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 槟榔分别取自海南省的三亚、琼海、万宁等
县市的当地槟榔植株。取健康植株的叶片，－20 ℃冰箱
保存。反应体系的优化以鸡心槟榔为模板。SSR多态性
分析以椭圆槟榔、西瓜槟榔、红心槟榔、越南槟榔、长圆槟
榔、大腹槟榔、尖圆槟榔、圆形槟榔、粉心槟榔为试材。
DNA提取所用试剂盒购自北京拜尔迪生物技术公司，
PCR所需试剂购自上海生工。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA的提取与分离 用 QIAGEN公司的 DNeasy
Plant Mini Kit提取基因组 DNA，用紫外分光光度法和琼
脂糖凝胶电泳法检测 DNA 的纯度和质量浓度。稀释至
所需质量浓度后，置于 －20 ℃冰箱中保存。
1． 2． 2 PCR扩增 所用引物是由我课题组针对槟榔基
因组开发了具有较高多态性的槟榔 SSR引物，由上海生
工合成。随机选择引物 C7549 用于本实验。PCR 反应
体系 20 μL，其中 Mg2 + 2． 0 mmol /L、dNTPs 0． 2 mmol /L、
Taq DNA聚合酶1． 0 U、引物浓度为0． 6 μmol /L、DNA模
板质量浓度为 2． 0 ng /μL。当一种成分进行浓度梯度或
用量梯度实验时，其他成分浓度不变，比较不同处理对扩
增结果的影响。其中各成分的梯度设置如表 1 所示。
扩增程序为:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 1 min，56
℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，30 个循环，72 ℃延伸 10
min。根据该引物的理论退火温度 Tm ± 5 ℃范围内，将
退火温度设为 47、50、53、56、59 ℃，寻找最适温度。PCR
扩增在 Bio － RAD的 PTC －200上进行。
表 1 PCR反应体系中处理因素和水平
水平
因素
dNTPs浓度 /(mmol /L)引物浓度 /(μmol /L) 模板 DNA质量分数 /(ng /μL) Taq聚合酶用量 /U Mg2 +浓度 /(mmol /L)
1 0． 05 0． 2 1． 0 0． 5 0． 5
2 0． 10 0． 4 1． 5 1． 0 1． 0
3 0． 20 0． 6 2． 0 1． 5 2． 0
4 0． 30 0． 8 2． 5 2． 0 3． 0
5 0． 40 1． 0 3． 0 2． 5 4． 0
1． 2． 3 PCR产物检测 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
PCR产物，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制:8 mL 29∶ 1
的聚丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺，18． 7 mL 蒸馏水，3 mL
10 × TBE，30 μL的 TEMED和 210 μL 10%的过硫酸铵，
混匀。取扩增产物 3 μL 加 1 μL 6 倍上样缓冲液混匀，
上样，稳压 120V，1 h，剥胶染色。
电泳结束后，去下凝胶进行银染。首先将胶放入
10%冰醋酸中固定 15 min;然后用蒸馏水漂洗 2 次，每次
10 s;再转入染色液(AgNO3 0． 5 g，37%甲醛 0． 75 mL，蒸
馏水定容到 500 mL)中;用蒸馏水冲洗 1 次，转入显影液
(无水碳酸钠 15 g，37%甲醛 2 mL，硫代硫酸钠 0． 1 g)
中，在摇床上显影直至条带清晰为止;最后将胶放入蒸馏
水中漂洗，保存。
2 结果与分析
2． 1 退火温度对 SSR 扩增的影响 本实验以引物
C7549为例，由退火温度对 PCR 扩增结果可以看出(如
图 1) ，不同的退火温度对槟榔 SSR扩增产物的带型影响
不同。退火温度低时，有非特异性条带;当退火温度为
56 ℃时，条带明亮、清晰，且没有非特异性条带;退火温
度升高到 59 ℃时，PCR扩增产物量明显减少，条带亮度
明显减弱。因此，将 56 ℃定为槟榔 SSR － PCR反应体系
中的最佳退火温度。
M:Marker;1:47 ℃;2:50 ℃;3:53 ℃;4:56 ℃;5:59 ℃
图 1 退火温度对 SSR扩增的影响
2． 2 Mg2 +浓度对 SSR 反应的影响 本实验设置了 5
个 Mg2 +浓度梯度，从图 2 可以看出，Mg2 + 浓度为 3． 0
mmol /L时，PCR扩增结果最佳;当浓度过低时条带不清
晰，且有非特异性条带;当浓度达到 4． 0 mmol /L 时，PCR
的扩增量明显降低，条带非常模糊不清。因此，将 3． 0
mmol /L确定为槟榔 SSR反应体系最佳 Mg2 +浓度。
M:Marker;1:0． 5 mmol /L;2:1． 0 mmol /L;
3:2． 0 mmol /L;4:3． 0 mmol /L;5:4． 0 mmol /L
图 2 Mg2 +浓度对 SSR扩增的影响
2． 3 dNTPs 浓度对 SSR 反应的影响 由图 3 可见，
dNTPs浓度为 0． 05、0． 1、0． 2 mmol /L 时，均有条带出现，
但不同浓度的 dNTPs 扩增条带的亮度强度存在差异。
当 dNTPs的浓度为 0． 1 mmol /L 时，条带亮度最强，最稳
定，0． 2 mmol /L的次之;当 dNTPs的浓度达到 0． 4 mmol /
L时，则无产物。dNTPs作为 PCR反应的重要底物，其含
量不足会直接影响 PCR的扩增产量，而过量的 dNTPs会
与聚合酶竞争结合 Mg2 +，抑制 PCR 反应。因此 dNTPs
的浓度确定为 0． 1 mmol /L。
2． 4 Taq DNA聚合酶用量对 SSR反应的影响 由不
同的 Taq DNA聚合酶量对 SSR扩增结果如图 4所示，在
槟榔 SSR反应体系中，随着 Taq 酶量的逐渐增加，其扩
增条带产物量也逐渐增大。当 Taq 酶量为 1． 5 U 时，条
带亮度和清晰度达到最强，产物量最多，当 Taq酶量达到
2． 0 U时，条带亮度开始降低，产物量下降。因此将 1． 5
U确定为槟榔 SSR反应体系的最适 Taq DNA聚合酶量。
2． 5 引物浓度对 SSR反应的影响 由不同引物浓度对
SSR扩增结果如图 5所示，引物浓度为 0． 4、0． 6、0． 8、1． 0
μmol /L时，均可扩增出电泳条带，但只有 0． 6 μmol /L的
引物浓度扩增的条带最亮和清晰度最强。当引物浓度为
169 期 战晴晴等:槟榔 SSR反应体系的建立
0． 2 μmol /L时，由于浓度过低，未能扩增出条带;随着引
物浓度的逐渐增加，PCR 产物量也逐渐增加，当引物浓
度超过 0． 6 μmol /L时，条带亮度降低，PCR产物量减少。
因此，将0． 6 μmol /L确定为槟榔 SSR反应体系的最佳引
物浓度。
M:Marker;1:0． 05 mmol /L;2:0． 1 mmol /L;
3:0． 2 mmol /L;4:0． 3 mmol /L;5:0． 4 mmol /L
图 3 dNTPs浓度对 SSR扩增的影响
M:Marker;1:0． 5 U;2:1． 0 U;3:1． 5 U;4:2． 0 U;5:2． 5 U
图 4 Taq DNA聚合酶用量对 SSR扩增的影响
M:Marker;1:0． 2 μmol /L;2:0． 4 μmol /L;
3:0． 6 μmol /L;4:0． 8 μmol /L;5:1． 0 μmol /L
图 5 引物浓度对 SSR扩增的影响
2． 6 DNA模板质量浓度对 SSR 反应的影响 不同槟
榔 DNA浓度对 SSR反应结果如图6所示，当模板浓度过
低时，扩增条带非常弱，且模板浓度为 1． 0 ng /μL 时，有
非特异性条带;随着浓度逐渐增加，PCR 产物量逐渐增
大，浓度分别达到 2． 0 和 2． 5 ng /μL 时，条带最为清晰。
从节省模板用量的角度考虑，将 2． 0 ng /μL 确定为槟榔
SSR反应体系的最佳 DNA模板浓度。
2． 7 部分槟榔品种 SSR多态性分析 采用上述优化条
件对槟榔 9 个品种进行 SSR 扩增，以检测确立的槟榔
SSR反应体系的效果，结果如图 7 所示，扩增条带清晰，
多态性高，条带大小均在 100 ～ 300 bp 之间。表明确立
的 SSR反应体系稳定可靠，可应用于槟榔亲缘关系和系
统发育等研究。
M:Marker;1:1． 0 ng /μL;2:1． 5 ng /μL;
3:2． 0 ng /μL;4:2． 5 ng /μL;5:3． 0 ng /μL
图 6 DNA模板浓度对 SSR扩增的影响
1:椭圆;2:西瓜;3:红心;4:越南;5:长圆;
6:大腹;7:尖圆;8:圆形;9:粉心
图 7 不同槟榔品种 SSR扩增结果
3 讨论与结论
SSR分子标记因同时具有丰富的多态性、共显性遗
传、重复性好等优点，成为一种较为理想的分子标记，已
成为植物遗传和育种研究中不可缺少的分子标记。但
SSR分析时引物的获得需要预知核酸序列，其广泛应用
常受限于从特定物种中分离 SSR 位点的难度和耗费。
获得 SSR标记的常用方法是从基因组文库中得到含有
微卫星的阳性克隆，或是通过检索 GeneBank、EMBL、DD-
BJDNA序列数据库获得微卫星序列［9］。槟榔在我国种
植历史悠久，在长期自然进化和人工栽培驯化的过程中，
形成许多变种、品种和类型。目前有效的分子标记对槟
榔品种间的历史演化、亲缘关系等都未有研究。本实验
是基于 454 － FLX测序技术，获得槟榔 EST文库，首次开
发得到槟榔 SSR 引物，旨在为槟榔种质亲缘关系、遗传
多样性分析和分子育种提供有效的分子标记。
虽然 SSR 技术在其他植物上得到了广泛的应
用［10 －13］，但是SSR反应体系中涉及诸多因素，每个因素
对整个反应都有较大的影响，所以建立稳定的反应体系
(下转第 68页)
26 江 西 农 业 学 报 24 卷
杆菌WP 500倍液对草莓斜纹夜蛾的防效达 79． 74%，具
有较好的防治效果，而对草莓蓟马的防治效果不佳。以
上植物源及微生物农药不是很稳定，见光易分解，需要选
择在阴天或傍晚使用才能达到较好的防效。此外，生物
农药必须选择合适的防治时期才能获得较好的防治
效果［6 －7］。
在本试验中，自制果实醋(柿醋)对草莓蚜虫的防治
效果不佳。但糜林等［8］的研究结果表明，果实醋除能创
造一个不适宜病菌繁殖的 pH 环境外，还能诱导植物提
高抗病能力，对果树病害有一定的防治效果。试验发现，
每隔 7 ～10 d对草莓叶片喷施 1 次果实醋，对蚜虫有一
定的趋避作用，不仅能预防虫害，而且还能防病。
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(责任编辑:黄荣华
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)
(上接第 62页)
是 SSR技术应用的基础。退火温度是决定引物与模板
特异性结合的重要因素，退火温度的高低与引物本身的
碱基组成、长度和浓度有关。PCR扩增时，过量的 dNTPs
会与聚合酶竞争结合 Mg2 +，抑制 PCR反应，其他成分的
浓度过高，会引起引物与模板错配，产生非特异性条带;
过低影响 PCR扩增的产物量，因此，筛选出各成分的最
佳浓度对槟榔 SSR反应尤为重要。本实验引物为 C7549
时，槟榔 SSR反应的优化体系是:退火温度为 56 ℃，在
20 μL反应体系中，Mg2 +浓度为2． 0 mmol /L，dNTPs浓度
为 0． 1 mmol /L，Taq 酶量为 1． 5 U，引物浓度为 0． 8
μmol /L，DNA模板为 20 ng /μL。该优化体系可靠，适合
应用于槟榔亲缘关系分析。
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(责任编辑:周 军
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(上接第 65页)
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