全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 10期，第 2722-2724页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.10, 2722-2724
研究报告
Research Report
‘榕瓠 2号’瓠瓜杂交种纯度的 SSR鉴定
许端祥 * 高山 陈中钐 杜文丽 林峰 林碧英
福州市蔬菜科学研究所,福州, 350111
*通讯作者, ltxzi@126.com
摘 要 以‘榕瓠 2号’杂交种及其亲本为试验材料，利用 SSR技术进行杂交种子的纯度鉴定。从 32对 SSR
引物中筛选出 1对共显性的引物 S23，通过对 100株‘榕瓠 2号’瓠瓜进行纯度鉴定，结果有 1个只有母本特
异带而没有父本特异带，与大田检测的结果完全一致，杂交率达 99%。
关键词 瓠瓜,‘榕瓠 2号’, SSR,种子纯度
Identification of Seed Purity of‘Ronghu NO.2’Bottle Gourd by SSRMarkers
Xu Duanxiang * Gao Shan Chen Zhongshan Du Wenli Lin Feng Lin Biying
Fuzhou Institute of Vegetable Science, Fuzhou, 350111
* Corresponding author, ltxzi@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.002722
Abstract It is an effective method to construct a rapid, accurate and reliable purity identification technique for
controlling bottle gourd hybrid purity. In this study, SSR markers technique was used for identifying the purity of
bottle gourd variety‘Ronghu NO.2’. After repeated trial and error, from 32 primer pairs were screened out one pairs
of primers to amplify characteristic out of F1. According to the purity test of 100 bottle gourds,‘Ronghu NO.2’, there
was only one bottle gourd showing female-specific band without male-specific band, in keeping with the field
testing results whose hybrid rate 99%.
Keywords Bottle gourd,‘Ronghu NO.2’, SSR, Seed purity
基金项目：本研究由福建省星火项目(2015S0106)和福州市科技项目(2013-N-55)共同资助
瓠瓜(Lagenariasiceraria (Mol.) Stand.)属于葫芦
科葫芦属一年生草本植物，是我国南方地区春、夏季
重要的瓜类蔬菜作物之一，在福建省内广泛栽培。近
年来，在福建省各级政府的大力支持下，设施农业得
到了大力发展，我省设施蔬菜发展迅速，在省内部分
地区形成了许多大规模的瓠瓜设施生产基地。‘榕瓠
2号’是我们研究所新培育成的优质、高产、耐低温、
弱光瓠瓜杂交品种，适合福建省地区设施大棚早春
栽培。目前已在省内闽侯、长乐、屏南、沙县、漳州等
地推广种植，种植后瓠瓜杂交品种表现出适应性强、
高产、抗病等优点，使得广大农民群众纷纷表示了扩
大种植面积的意愿。然而随着种植面积的扩大，伴随
着用种量的增加和制种规模的扩大，种子质量的控制
难度也大大增加。特别是种子纯度的控制，控制不好
不仅会影响产量和产品品质，严重的还会导致纠纷。
分子生物学技术迅猛发展，为基于 DNA分子标记技
术，从基因组水平上检测杂交种纯度奠定了基础，并
已在浙蒲、哈密瓜、白菜、苦瓜的杂种纯度检测中取
得了良好效果(王玲平等, 2008;翟文强等, 2002;李丽
和郑小鹰, 2006;张菊平等, 2004;林珲等, 2011;许端祥
等, 2011;陈龙正等, 2014)。SSR (simple sequence re-
peats)标记法因为在染色体上具有均匀分布性、高多
态性、良好的稳定性和重复性及其丰富的数量、共显
性遗传、操作简单等诸多优点，是目前最常用的、最
值得信赖的 DNA 分子标记之一。刘子记等(2013;
2014)利用 SSR技术对热研一号、热研二号苦瓜种进
行鉴定，与田间形态学鉴定结果完全一致。李梅等
(2015)用 SSR技术对‘圆梦’苦瓜商品种进行鉴定，纯
度均达到标准要求。鲁忠富等(2012)利用 SSR技术
建立了浙蒲 2号、浙蒲 6号等 5个 5个浙江主栽品
种的指纹图谱纹，可高效鉴别瓠瓜种子真伪及纯度。
本研究以‘榕瓠 2号’及其父、母本为材料，利用 SSR
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
标记建立‘榕瓠 2号’瓠瓜杂种纯度鉴定技术体系，为
保证其制种种子质量安全和生产应用提供科学依据。
1结果与分析
1.1提取瓠瓜基因组 DNA
为获得无细胞膜残留，并且能使核酸与多糖物
质、蛋白质、细胞质杂质能更好地分离开来，这里采
用了改良的 CTAB法来提取瓠瓜基因组 DNA。这样
获得的 DNA还具有完整性好、纯度高、RNA消化完
全的特点，可用于下一步 PCR扩增(图 1)。
其中 100个单株并编号种植于大田中。摘取 1~100
编号单株的幼叶提取 DNA，利用引物 S23 分别对
100株‘榕瓠 2号’进行杂交种纯度鉴定。鉴定结果表
明，其中有 99个杂交单株可以得到双亲互补型特异
性条带；1 个杂交单株得到与母本一致的特异性条
带，而这很可能是母本自交得到的假杂种。田间成株
期鉴定结果发现 1株确与母本性状一致。根据纯度
计算公式，计算出‘榕瓠 2号’的杂交率为 99%。
2讨论
目前为止，瓠瓜的分子生物学研究大幅落后于黄
瓜、西瓜、甜瓜、苦瓜等其它瓜类。以往瓠瓜杂交种的
纯度鉴定工作主要依靠田间种植鉴定，为了保证纯
度鉴定的真实有效，田间鉴定需要一定的种植规模，
需要占用土地，从播种、育苗、定植到开花结果的观
察鉴定过程至少需要 2个半月时间，要耗费大量人力、
物力、财力。由于鉴定时间长，使得杂交种的销售等不
及纯度鉴定的结果所需要承担风险变得很大。SSR分
子检测技术可以将观察鉴定时间(算上播种, DNA提
取到扩增产物检测的时间)缩短到 20天以内，这样就
能提供纯度鉴定的结果。SSR分子检测技术具有试验
鉴定结果与大田鉴定结果高度一致，而且从基因型上
检测更加客观、可信的优点。此项技术易于掌握、成本
低并且一般实验室都能完成，而且瓠瓜基因组的 SSR
标记多态性十分丰富，可以作为理想的杂交种鉴定的
方法，为‘榕瓠 2号’的安全使用提供了科学支撑。
3材料与方法
3.1供试材料及试剂
参试材料：‘榕瓠 2号’瓠瓜杂交种及其亲本。来
源单位：福州市蔬菜科学研究所瓠瓜课题组。育苗：
50孔育苗盘。试验样本：长到 2片真叶的幼苗嫩叶。
试验试剂：SSR引物、Taq酶和 dNTP等，来源：上海
生工生物工程技术有限公司。
1.2 SSR引物筛选
利用 SSR分子标记技术对 榕瓠 2号 及双亲
进行引物筛选，结果筛选出表现多态性的引物有 4
对。32对 SSR引物进行试验和比较，筛得 1对共显
性(codominant)基因组 SSR引物 S23，用其对杂交种
的单株健康嫩叶基因组 DNA进行扩增，可以将‘榕
瓠 2号’及其双亲区分开来(图 2)，杂交种的带型为
父母本的互补型(图 3)，条带清晰，差异明显，重复
性好。
1.3‘榕瓠 2号’杂交种纯度鉴定
为了验证筛选出的 SSR引物 S23对‘榕瓠 2号’
杂交种纯度鉴定的实用性，随机抽取 200个瓠瓜种
子播种于穴盘中，待播种幼苗长至 2片真叶时，抽取
图 1‘榕瓠 2号’瓠瓜基因组 DNA电泳
Figure 1 Electrophoretogram of ‘Ronghu NO.2’bottle gourd
genomeogram
图 2‘榕瓠 2号’基因组 SSR引物筛选
Figure 2 Screening of polymorphic ssr primers of‘Ronghu NO.2’
bottle gourd
图 3‘榕瓠 2号’杂交种纯度鉴定
Figure 3 Purity identification of‘Ronghu NO.2’F1 hybrids
2723
‘榕瓠 2号’瓠瓜杂交种纯度的 SSR鉴定
Identification of Seed Purity of‘Ronghu NO.2’Bottle Gourd by SSR Markers
3.2基因组 DNA提取与检测
以瓠瓜幼苗为材料提取总 DNA。‘榕瓠 2号’及
其父、母亲本各随机抽取 20株，取瓠瓜幼苗健康嫩
叶。基因组 DNA的提取：改良 CTAB法。OD值的测
定、DNA质量和浓度的检测：紫外分光光度计，λ1=
260 nm，λ2=280 nm。PCR扩增模板：n=30 ng/μL。
3.3 SSR分析法
在 Eppendorf Mastercycler gradient (PCR)仪上进
行扩增反应，总体积为 25 μL，各取 1 μL 10 μmol/L
正向引物、1 μL 10 μmol/L 反向引物，17.3 μL 灭
菌 ddH2O，10 X reaction Buffer (MgCl2) 2.5 μL，2 μL
2 mmol/L dNTP，1 μL模板 DNA (30 ng/μL)，0.2 μL
5 U/μL Taq DNA聚合酶。
PCR扩增程序设定为：预变性：94℃ 5 min→变
性：94℃ 45 s，延伸：72℃ 30 s，退火：58℃~60℃ 45 s，
35个循环→延伸：72℃ 7 min→保存：4℃冰箱。
使用 80 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶对 PCR 扩
增结产物进行电泳、银染快速检测。
作者贡献
许端祥、高山是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；许端祥、高山及陈中钐完成数据分析，论
文初稿的写作；杜文丽、林峰、林碧英参与实验设计，
试验结果分析；许端祥是项目的构思者及负责人，指
导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者
都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由福建省星火项目(2015S0106)和福州市
科技项目(2013-N-55)共同资助。感谢南京农业大学
陈劲枫老师在实验研究方面提供的帮助。
参考文献
Chen L.Z., Xu H., Song B., Zhang H., Kuang Y.Y., and Yuan X.
H., 2014, Identification of bitter gourd hybrid purity by IS-
SR markers, Nanfang Nongye Xuebao (Journal of Southern
Agriculture), 44(12): 1949-1953 (陈龙正,徐海,宋波,张慧,
况媛媛,袁希汉, 2014,利用 ISSR分子标记鉴定苦瓜杂
交种纯度,南方农业学报, 44(12): 1949-1953)
Li L., and Zheng X.Y., 2006, Utilization of AFLP molecular
markers in identification of Chinese cabbage varieties, Fen-
zi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 4(5): 685-
689 (李丽,郑晓鹰, 2006, AFLP分子标记应用于白菜品种
鉴定,分子植物育种, 4(5): 685-689)
Li M., Zhang B., Liu L., Liu X., Wen F.Y., Luo Z.M., Liu X.H.,
Wang C.N., and Huang Z.Y., 2015, Identification on purity
of bitter gourd hybrid “Yuanmeng 08”by SSR marker,
Zhongzi (Seed), 34(4): 113-117 (李梅, 张斌, 刘莉, 刘翔,
闻凤英,罗智敏,刘晓晖,王超楠,黄志银, 2015, “圆梦
08”苦瓜杂交种纯度的 SSR鉴定,种子, 34(4): 113-117)
Lin H., Lin Y.P., Zhu H.S., and Li D.Z., 2011, RAPD determina-
tion on purity of hybrid bitter gourd seeds, Fujian Nongye
Xuebao (Fujian Journal of Agricultural Sciences), 26(6):
977-980 (林珲,李永平,朱海生,李大忠, 2011,应用 RAPD
标记鉴定苦瓜杂种纯度,福建农业学报, 26(6): 977-980)
Liu Z.J., Niu Y., and Yang Y., 2013, Identification of bitter gourd
‘Reyan No.1’seed purity by SSR markers，Redai Zuowu
Xuebao (Chinese Journal of Tropical Crops), 34(11): 2179-
2182 (刘子记,牛玉,杨衍, 2013,热研一号油绿苦瓜种子
纯度的 SSR鉴定,热带作物学报, 34(11): 2179-2182)
Liu Z.J., Zhan Y.F., and Yang Y., 2014, Hybrid purity identifica-
tion of reyan No. 2 using SSR markers, Shengwu Jishu
Tongbao (Biotechnology Bulletin), (2): 75-78 (刘子记 , 詹
园凤,杨衍, 2014,利用 SSR标记鉴定热研二号油绿苦瓜
杂交种纯度,生物技术通报, (2): 75-78)
Lu Z.F., Xu P., Wu X.H., Wang B.G., Wang S., Liu Y.H., and Li
G.J., 2012, A rapid and precise SSR-based procedure for
bottle gourd seed quality survey, Zhejiang Nongye Xuebao
(Acta Agriculturae Zhejiangensis), 24(4): 578-581 (鲁忠富,
徐沛,吴晓花,汪宝根,王莎,刘永华,李国景, 2012, SSR
分子标记技术在瓠瓜种子纯度快速鉴定中的应用,浙江
农业学报, 24(4): 578-581)
Wang L.P., Dai D.L., Wu X.H., Wang B.G., and Li G.J., 2008,
Application of AFLP markers in fast determination of seed
purity in gourd, Lagenaria siceraria cv. Zhepu No.2, Zhe-
jiang Nongye Xuebao (Acta Agriculturae Zhejiangensis), 20
(2): 84-87 (王玲平,戴丹丽,吴晓花,汪宝根,李国景，2008,
AFLP分子标记技术在浙蒲 2号种子纯度快速鉴定中的
应用,浙江农业学报, 20(2): 84-87)
Xu D.X., Gao S., Lin B.Y., and Fu R.Q., 2011, Identification of
seed purity of Jiamei bitter gourd by SRAP marker,
Changjiang Shucai (Journal of Changjiang Vegetables), (18):
16-17 (许端祥,高山,林碧英,傅睿清, 2011,佳美苦瓜纯度
的 SRAP鉴定,长江蔬菜, (18): 16-17)
Zhai W.Q., Tian Q.Z., Jia J.Z., and Dong Y.C., 2002, Identifica-
tion of purity of hami melon hybrid with AFLP fingerprint,
Yuanyi Xuebao (Acta Horticulturae Sinica), 29(6): 587 (翟
文强,田清震,贾继增,董玉琛, 2002,哈密瓜杂交种纯度
的 AFLP指纹鉴定,园艺学报, 29(6): 587)
Zhang J.P., Zhang X.Z., and Zhang C.Y., 2004, Studies on bilv
No.3 of balsam pear (Momoradica charantia L.) seed purity
tested by RAPD markers, Zhongzi (Seed), 23(1): 25-26 (张
菊平,张兴志,张长远, 2004,碧绿 3 号苦瓜种子纯度的
RAPD检测研究,种子, 23(1): 25-26)
2724