全 文 ：蒲葵根提取物的体外抗肿瘤实验研究
钟振国1 ,张凤芬 1 ,张雯艳 1 ,崔建国2
(1.广西中医学院新药研究开发中心 ,广西南宁 530001;2.广西师范学院 ,广西南宁 530001)
　　摘要　目的:用体外细胞培养法研究蒲葵根提取物对七种肿瘤细胞株生长的抑制作用。方法:采用 MTT法 、细
胞集落形成法 、生长曲线法测定蒲葵根提取物对白血病细胞株 L1210和 P388D1、宫颈癌细胞株 H e la、人胃癌细胞
株 SGC7901、黑色素瘤细胞株 B16、神经性肿瘤细胞株 NG108-15、人肝癌细胞株 H ele 7404生长的抑制情况。结果:
M TT法 、细胞集落形成法 、生长曲线法测定的结果均显示 ,当蒲葵根提取物浓度在 5. 0 μg /m l以上时 , 7类肿瘤细胞
株的生长均受到明显抑制。结论:蒲葵根提取物在体外具有抗肿瘤作用。
关键词　蒲葵;肿瘤细胞株;抗癌作用
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)01-0060-04
Study on the Anticancer E ffec ts ofExtracts from Roots ofLivistona chinensis in V itro
ZHONG Zhen-guo1 , ZHANG Feng-fen1 , ZHANG W en-yan1 , CUI Jian-Guo2
(1.Guangxi Co llege of T rad itional Ch ineseM ed icine, Nanning 530001, Ch ina;2. GuangxiNo rm al Co lleg e, N ann ing 530001, China)
Abstrac t　Objec tive:To observe the effe cts of ex trac ts from root of Livistona chinensis on the g row th inh ibition in seven carcinom a
ce ll lines.M ethods:The g row th inh ib ition w as ana lyzed byMTT, ce ll co lony and ce ll grow th curvem easu rem en technique in the stom-
ach carcinom a SGC7901, Lymphocy tic leukem ia L1210, Lym phoid neop lasm P388D1, tumo r of cervix uteri H e la, hepa r carcinom a
he le 7404, me lanom a B16 and m ouse neu roblastom ax ra t g liom a hybrid NG108-15 ce lls lines. Resu lts:The g row th of all tum or ce lls
w ere inh ib ited by ethy l aceta te of a lcoho l ex tract from roots o fL iv istona ch inensis. The g row th o f a ll tum or ce lls w ere no t affec ted by low
dose ex trac ts(0. 5μg /m l). The g row th o f all tumo r ce lls we re obv iously inhibited by highe r do se ex tracts(5.0μg /m l). The g row th of
all tumo r ce lls w ere inh ib ited in g row th cu rve m easu rem ent. Conclusion:The resu lts show tha t e thy l aceta te of a lcoho l ex trac ts from
roo ts L ivistona ch inensis possesse s the role o f an titum or in cell cu ltu re.
K ey words　Livistona chinensis;Tumo r ce ll line s;Anti-Cance r e ffect
基金项目:国家自然科学基金地区联合资助项目(批准号:30160095);广西科技厅资助项目的部分研究内容(桂科能 05112011-3A1);广西高校人才小高地建设创新团队资助计划作者简介:钟振国 ,男 ,教授 ,医学博士 , 中医学博士后 ,主要从事教学与中药新药的研究开发。
　　蒲葵(Livistona chinensisR. B r.)为棕榈科植物 。
蒲葵籽具有治疗各种癌症的功效 〔1〕。由蒲葵籽 、喜
树果等中药组成的复生康胶囊用于增强胃癌 、肝癌
放疗 、化疗的疗效 ,可极大改善肝癌患者的临床症
状 〔2〕。但尚未发现对蒲葵做系统的抗癌作用的实
验研究 ,特别对蒲葵根的抗癌研究。为此 ,我们将蒲
葵根提取物在体外进行了抗癌活性筛选 ,发现蒲葵
根乙酸乙酯提取物抗癌活性较强。现将实验结果报
告如下 。
1 　材料与方法
1.1 　材料
1.1.1　蒲葵根提取物:蒲葵根用乙酸乙酯反复浸
提后 ,得到提取物的浓缩部分 (以下简蒲葵根提取
物 ),药液临床用前用 DMSO溶解后无菌过滤备用。
1.1.2 　肿瘤细胞株:白血病细胞株 L1210和
P388D1、宫 颈癌细 胞株 Hela、人 胃癌 细胞株
SGC7901、黑色素瘤细胞株 B16、神经肿瘤细胞株
NG108-15等均购自上海细胞生物研究所细胞库 ,人
肝癌细胞株 H ele 7404由广西医科大学药理教研室
提供 。
1.1.3 　试剂:MTT(四甲基噻唑蓝)为德国 Sigma
公司产品 ,批号:020609;FBS(胚胎牛血清 )为美国
Hyclone公司产品 ,批号:0405;RPM I1640和 DMEM
培养基为美国 G ibco公司产品 , 批号:1120708和
0311;T rypsin(胰蛋白酶 )由天津市灏洋生物制品有
限责任公司提供 , 批号:200503;DMSO (二甲基亚
砜)购自天津汇英化学试剂有限公司 , 批号:
20030526。
1.1.4 　实验仪器:CO 2培养箱 (Thermo Fo rma),美
国产 。倒置显微镜 (O lympus), 日本产。酶标仪
(B iocell),奥地利产。
1.2　实验方法
1.2.1 　MTT法:参考文献报道 〔3〕 ,在 96孔培养板
(NUNC)中每孔加入 200 μl(含有 5000个 /m l肿瘤
细胞 )含 10%FBS的 RPM I1640培养基的细胞悬液
(除 NG108-15细胞用含 10%FBS的 DMEM培养基
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外 ),置 37℃10%CO 2培养箱中培养 24 h后 ,实验组
分别加入最终浓度 0.5 μg /m l、1.0 μg /m l、5.0 μg /
m l的蒲葵根提取物的培养液 ,对照组则加入等浓度
体积溶液的培养液 ,每组 4孔 ,重复 4次 。置 37℃,
10%CO 2培养箱培养 5 d后 ,弃去上清液 ,加入 200
μl /孔新鲜配制的含 0.2 mg /m lMTT的无血清培养
液 , 37℃继续培养 4 h。弃上清液 ,加入 200 μlDM-
SO ,振荡混匀后 ,在酶标仪上以波长为 550 nm ,参比
波长为 450 nm测定 OD值 ,计算结果。按下式计算
药物对肿瘤细胞生长的抑制率 。
肿瘤细胞生长抑制率%=(1 -实验组平均 OD值 /对照
组平均 OD值)×100%
1.2.2　集落形成法:参考文献报道〔4〕 ,取对数生长
期的贴壁细胞 (He la、SGC7901、B16)用 10%FBS的
RPM I1640培养液 和 NG108-15 用 10% FBS 的
DMEM培养液配成 500个 /m l细胞悬液 ,接种于 35
mm培养皿(NUNC)中 , 4个为一组 ,每个 2m l;实验
组加入终浓度为 0.5 μg /m l、1.0 μg /m l、5.0 μg /m l
的蒲葵根提取物的细胞悬液 200 μl。对照组加入等
浓度等体积溶剂的细胞悬液 200 μl。置 5%CO 2的
37℃培养箱中静置 7 d;弃去培养液 ,用瑞氏-姬姆萨
染色后计数含 50个细胞以上的细胞集落 。对悬浮
细胞(L1210和 P3 88D1)用 10%FBS的 RPM I1640
培养液配成 1000个 /m l细胞悬液 ,置 37℃预温;取
35 mm培养皿 (NUNC), 4个为一组 ,实验组分别加
入浓度为 0.5 μg /m l、1.0 μg /m l、5.0μg /m l的蒲葵
根提取物 ,对照组则加入等体积溶剂;取已融化的
5%琼脂液 1份 ,加入到 9份 37℃含 15%FBS的新
鲜 RPM I1640培养液中 ,摇匀加入平皿中 , 每个 1
m l,置室温使其凝固;取预温的细胞悬液按每 9.4m l
加 5%琼脂 0.6m l的比例混匀 ,加到已铺底层琼脂
的平皿中 ,每个 1 m l,置 37℃、5%CO2培养箱中培
养 7 d;在显微镜下计数含 50细胞以上的细胞集落 。
按下列公式计算药物对细胞集落形成抑制百分率。
肿瘤细胞集落形成抑制百分率%=(1 -实验组细胞集
落数 /对照组细胞集落数)×100%
1.2.3　生长曲线法:参考文献报道〔5〕 ,将 L1210、
P388D1、He la、SGC7901、B16、H ele7404细胞接种于
含 10%FBS的 RPM I1640培养基 , NG 108-15则用含
10%FBS的 DMEM培养基 ,分别配成 10×103个 /m l
的细胞悬液 ,然后加入 96孔培养板中 ,每孔 200 μl,
实验组加入最终浓度为 0.5 μg /m l、1.0 μg /m l、5.0
μg /m l的蒲葵根所取物 ,对照组加入等浓度等体积
溶剂 ,每种细胞每浓度设三孔 ,重复 4次 ,置 10%
CO2 37℃温箱中培养 ,然后按 0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5
d、6 d、7 d各取样 40μl,加入 0.4%台盼蓝液 10μl,
计数活细胞数 。每孔计数 4次 ,取均值 ,再累计 3孔
均值 ,根据细胞浓度值的对数值与时间作用绘成图 ,
即为细胞生长曲线 。
1.2.4 　统计学处理:以 SPSS10.0统计软件分析 ,
两组间的均数比较采用 t检验 。
2　实验结果
2.1　MTT法测定不同浓度蒲葵根提取物对肿瘤细
胞株生长的抑制　结果见表 1。
　表 1　　　　　不同浓度蒲葵根提取物对
肿瘤细胞抑制的影响(%)
组别 提取物浓度(μg /m l)
0.5　　 1.0　　　 5.0　　　
He la - 0.96±3.93 11.66±2.10▲▲▲▲ 38.24±3. 37▲▲▲▲
B16 　4.49±1.28▲ 22.32±1.99▲ 52.22±6. 34▲
SGC7901 - 2.33±1.95▲ 11.96±2.60▲ 56.89±2. 11▲▲▲▲
P388D1 28.66±7. 40▲▲ 36.78±6.15▲▲▲ 94.89±0. 93▲▲▲▲
L1210 - 0.26±2.42 16.60±3.82▲▲ 32.66±7. 71▲▲▲▲
He le7404 　2.43±6.84 21.81±1.63▲ 45.25±8. 26▲▲▲▲
NG108-15 - 4.45±7.30▲ 23.63±3.36▲ 53.00±8. 13▲▲▲▲
　　注:与对照组 比较 , ▲ P < 0.05, ▲▲ P < 0. 01, ▲▲▲ P <
0. 005, ▲▲▲▲ P<0. 001。表 2同
　　结果显示 ,蒲葵根提取物对 7类种肿瘤细胞株
有抑制作用 ,并与浓度有关 。当提取物浓度较低
(0.5 μg /m l)时 ,药物对肿瘤细胞作用不明显 。随
着药物浓度升高 ,药物对肿瘤细胞的抑制杀伤越来
越明显。其中药物对白血病细胞株 P388D1较为敏
感。
2.2　集落形成法观察不同浓度蒲葵根提取物对肿
瘤细胞抑制作用　结果见表 2。
　表 2　　　　　不同浓度蒲葵根提取物对
肿瘤细胞抑制的影响(%)
组别 提取物浓度(μg /m l)
0.5　　 1.0　　　 5.0　　　
He la 　1.74±1.63▲ 13.11±2.10▲▲▲▲ 43.90±4. 09▲▲▲
B16 　1.37±0.98▲ 26.17±3.21▲ 63.18±5. 35▲
SGC7901 　3.13±2.29▲ 27.01±3.93▲ 45.79±4. 86▲
P388D1 25.34±6. 18▲ 41.33±4.03▲ 89.08±10.04▲▲▲
L1210 　2.15±5.01 21.53±3.08▲ 46.25±6. 13▲▲▲▲
He le7404 　0.85±2.13 34.92±7.04▲ 64.31±8. 13▲▲▲▲
NG108-15 - 0.47±1.03▲ 21.95±3.22▲▲▲ 43.90±1. 34▲
　　集落形成法的结果显示 ,蒲葵根提取物对 7类
肿瘤细胞株的集落形成有抑制作用。其结果与
MTT法是较一致的 。
2.3　生长曲线法不同浓度蒲葵根提取物对肿瘤细
胞株生长的影响过程　结果见图 1 ～ 7。
结果显示 ,蒲葵根提取物对肿瘤细胞生长过程
有抑制作用。蒲葵根提取物以对白血病细胞株
P388D1较为敏感 。结果与前两种方法是一致的。
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图 1　蒲葵根提取物对 L1210细胞生长曲线的影响
(—◆— 0.5对照;—◇— 0.5根提取物;—▲— 1.0对照;—△—
1. 0根提取物;—●— 5. 0对照;—○— 5. 0根提取物;下图同)
图 2　蒲葵根提取物对 Hele740细胞生长曲线的影响
图 3　蒲葵根提取物对 H ela细胞生长曲线的影响
图 4　蒲葵根提取物对 P388D1细胞生长曲线的影响
3 　讨论
本实验通过采用三种不同的实验方法 ,研究蒲
葵根乙酸乙酯提取物在体外抗肿瘤作用 。MTT法
和集落形成法的结果显示 ,提取物对 7类肿瘤细胞
图 5　蒲葵根提取物对 B16细胞生长曲线的影响
图 6　蒲葵根提取物对 NG108-15细胞生长曲线的影响
图 7　蒲葵根提取物对 SGC7901细胞生长曲线的影响
株生长均有抑制作用 ,其抑制率随着药物浓度增加
而相应增高。细胞生长曲线法所示结果与 MTT法
和集落形成法的结果相吻合 。提示蒲葵根乙酸乙酯
提取物在体外对肿瘤细胞生长具有抑制作用 。
MTT法 、集落形成法 、生长曲线法和 Hoechst
33258荧光染色法是观察体外抗肿瘤活性的常用方
法 ,尤其 MTT法快速简便 ,常作为抗肿瘤药物体外
初筛试验 〔6〕 ,本研究采用几种实验方法的联合应用
增加了实验结果的可靠性。
对恶性肿瘤目前尚无十分理想的治疗药物。近
年来 ,从天然植物中寻找新的抗肿瘤药物已成为新
药研究的主要发展方向之一 〔7〕。蒲葵子和蒲葵根
提取物均具有抗肿瘤作用。研究表明 ,蛋白激酶 C
(PKC)是一种 Ca2+和磷脂酰丝氨酸 (PS)激活的蛋
白激酶 ,在细胞跨膜信号传递中起着重要作用 〔8〕。
已有证据 〔8 ～ 10〕表明 ,蛋白激酶 C与细胞增殖有关 ,
62 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 1期 2007年 1月
许多蛋白激酶 C抑制剂对细胞增殖有抑制作用 ,而
一些抗癌药本身就是蛋白激酶 C的抑制剂。有研
究表明 100μg /m l的蒲葵子醇提物对蛋白激酶活性
的抑制率为 66.6%,降低药浓度抑制作用减弱 ,提
示蒲葵子抗癌活性可能与对蛋白激酶 C的抑制有
关 ,蒲葵根乙酸乙酯提取物仍是一个复合物 ,其抗癌
活性成分仍不清楚 ,作用机理是否与蛋白激酶 C的
抑制有关 ,还是与其他的抗肿瘤机理有关 ,或是几种
抗肿瘤理结合起作用 ,有待于进一步的研究。
参 考 文 献
[ 1] 江苏新医学院 . 中药大辞典(下册 ). 上海:科技出版
社 , 2001:2459.
[ 2] 黄瑞松 ,叶云峰 , 苏青 , 等 . 复生康胶囊质量标准的研
究 .中草药 , 2003, 34(8):698.
[ 3] 钟振国 ,张同芬 , 甄汉深 . 韦汉燕美叶猕猴桃根提取物
抗肿瘤作用的实验研究 . 中国中医药学刊 , 2004, 22
(9):1705-1707.
[ 4] 钟振国 , 张雯艳 ,张凤芬 . 中越猕猴桃根提取物的体外
抗肿较瘤活性研究 . 中药材 , 2005, 28(3):215-218.
[ 5] 宋维华 , 许超迁 , 孙建平 , 等 . MTT法测定矿物质提取
物 M ICOM及中药提取物 AN4的体外抗肿瘤活性 . 哈
尔滨医科大学学报 , 2001, 35(6):402-403.
[ 6] 陈百先 . 肿瘤的中药防治 . 同济大学学报 , 2002, 23
(2):164-165.
[ 7] H art IR, GoodeNT, W ilson RE.M olecular aspec ts o f the
m e tasta tic cascade. B iochem b iochem biophys Acta,
1989, 989:65.
[ 8] 丁毅鹏 , 徐永健 ,张珍祥 . 蛋白激酶 C与肿瘤 . 国外医
学呼吸分册 , 2000, 20(4):184.
[ 9] 程坚 , 陈宝安 ,戴艳美 . PKC在肿瘤细胞凋亡研究中的
新进展 . 临床肿瘤学杂志 , 1999, 4(4):69.
[ 10] 黄才 ,覃燕梅 , 梁念慈 .石上柏和蒲葵子对蛋白激酶 C
活性的影响 .中草药 , 1995, 26(8):415.
(2006 - 07 -05收稿)
复方黄芩提取物对小鼠体内流感病毒 mRNA
复制和干扰素 (IFN)表达的影响
初　明 1 ,初正云2 ,王丹丹 2
(1.北京大学医学部基础医学院 ,北京 100083;2.辽宁中医药大学药学院 ,辽宁沈阳 110032)
　　摘要　目的:研究复方黄芩提取物对小鼠体内流感病毒( influenza v irus, Ⅳ )mRNA复制的抑制作用和干扰素
( interfe ron, IFN)表达的诱生作用。方法:以流感病毒鼠肺适应株 A /FM /1 /47(H1N1)感染的小鼠肺炎为模型 ,采用
RT-PCR技术测定小鼠体内流感病毒 mRNA和干扰素含量。观察复方黄芩提取物对小鼠体内流感病毒 mRNA复制
和 IFN表达的影响。结果:复方黄芩提取物对小鼠体内流感病毒 mRNA表达有较好的抑制作用(P<0.01),对干扰
素的表达有诱生作用(P>0.05)。结论:复方黄芩提取物具有诱生干扰素 、抑制流感病毒在小鼠体内的复制作用。
关键词　复方黄芩提取物;流感病毒;mRNA;干扰素
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)01-0063-03
The Extract of Compound Radix Scute llariae on mRNA Replication
and IFN Expression of Influenza V irus inM ice
CHU M ing1 , CHU Zheng-yun2 , WANG Dan-dan2
(1.Departm ent o f Imm uno logy, Schoo l o f BasicM edicine, Peking Unive rsity, Be ijing 100083, China;2. Pharm acy departm ent L iaon-
ing University of T raditiona l Ch ineseM edicine , Shenyang 110032, China)
Abstrac t　Objective:To study the ex trac t of compound Radix Scu te llariae on inhib iting the mRNA rep lication and inducing the
INF expre ssion of influenza v irus in m ice’ s v ivo. M ethods: Influenza v irus infec ted m ice pneum ono-adaption stock A /FM /1 /47
(H1N1) evoked m ice pneumonia taken as an im al model. RT-PCR w as adop ted to m easu re the con tent o f influenza v irus′smRNA and
INF in m ice to study the effec t o f the ex tract on mRNA replica tion and IFN expre ssion. Results:The ex tract o f compound Radix Scute l-
lariae cou ld inh ib it influenza v irus’ s mRNA replication (P<0.01) and induce interfe ron expre ssion in m ice(P>0. 05). Conc lusion:
The extract o f com pound Radix Scute llariae can induce interfe ron and inhibit in fluenza v irus replica tion in m ice.
K ey words　The ex trac t of com pound Rad ix Scu te lla riae;In fluenza v irus;mRNA; Interferon
作者简介:初明(1984-),男 ,北京大学医学院基础医学院 , 2003级基础医学班直博生。 Tel:13488687175, E-m ail:yf fl 118@ sina. com。
63 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 1期 2007年 1月