全 文 ：中国农学通报 2011,27(9):347-351
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
紫苏（Perilla frutescens）为唇形科紫苏属一年生草
本植物，是国家卫生部首批颁布的既是食品又是药品
的 60种中药植物之一[1]，含有多种具有生理活性的化
学成分，其中迷迭香酸的含量高达1.29%[2]。迷迭香酸
（Rosmarinic acid，简称RosA，RA）化学名称为[R(E)]
α-[[3-(3,4-二羟基苯基)-l-氧代-2-丙烯基]氧基]-3,4-
二羟基苯丙酸，是一种具有一定生理活性的酚酸类化
合物，已被证实具有如抗氧化[3]、抗菌[4]、消炎[5]、抑制
HIV-1（Human immunodeficiency virus）整合酶[6]、抑
制透明质酸酶[7]等活性，在医药、食品、化妆品等领域
具有广泛的用途。然而紫苏野生型植株的迷迭香酸含
量较低，而且极易受病虫害、地理、气候、季节等因素的
影响，远远不能满足实现其商业化生产的要求。
1970年Ellis等首次应用放射性同位素标记法确
定了苯丙氨酸和酪氨酸是迷迭香酸生物合成的前体；
Petersen等先后报道了迷迭香酸生物合成的 8种酶及
合成途径。对迷迭香酸生物合成途径的研究表明，其
生物合成途径包括两条平行的苯丙氨酸支路和酪氨酸
支路，共包括几步酶促反应，两条支路的产物4-香豆酰
基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)（2007AA100401）。
第一作者简介：吕晓玲，女，1960年出生，安徽省人，教授，硕士，从事食品与生物化学方面的教学与研究工作。通信地址：300457天津经济技术开发
区第十三大街29号，天津科技大学食品工程与生物技术学院，Tel：022-60601445，E-mail：lxling@tust.edu.cn。
收稿日期：2010-12-31，修回日期：2011-03-21。
紫苏苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆及序列分析
吕晓玲，孙雪梅，王 芳，郝 磊，孙晶磊
（天津科技大学，天津 300457）
摘 要：苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸支路的关
键酶，它催化苯丙氨酸生成肉桂酸，完成该支路第一步反应。本实验利用同源克隆方法成功克隆了紫苏
PAL基因 cDNA片段，命名为PerPAL-1（GenBank登录号：HQ388347.1），该片段长399 bp，编码133个氨
基酸。通过氨基酸序列比对分析，发现其氨基酸序列与丹参和藿香PAL该片段的同源性分别高达96%
和95%。PAL系统进化树表明PerPAL-1与唇形科植物的PAL亲缘关系最近。PerPAL-1基因在叶中表
达最强，根中次之，而在茎中表达最弱。
关键词：紫苏；苯丙氨酸解氨酶；基因克隆；序列分析
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：2010-3809
Molecular Cloning and Sequence Analysis of Phenylalanine Ammonia-lyase Gene Fragment
in Perilla frutescens
Lv Xiaoling, Sun Xuemei, Wang Fang, Hao Lei, Sun Jinglei
(Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457)
Abstract: Phenylalanine ammonia-lyase (PAL), responsible for catalyzing the conversion of phenylalanine to
cinnamic acid to finish the first step of phenylalanine pathway, was the key enzyme during the biosynthesis of
rosmarinic acid. The cDNA fragment of PAL gene was successfully cloned by homology cloning method
(Accession No. HQ388347.1), 399 bp and encoded 133 amino acids. It was designated as PerPAL-1. The
results of amino acid sequence analysis showed that the identity of the sequence of PerPAL-1 amino acid with
that of Salvia miltiorrhiza and Agastache rugosa was 96% and 95%, respectively. Phylogenetic tree analysis
revealed that PerPAL-1 had closer relationship with PALs from Lamiaceae plants than those of other plants.
The expression of PerPAL-1 gene was the strongest in young leaves and the weakest in stems.
Key words: Perilla frutescens; phenylalanine ammonia-lyase; gene cloning; sequence analysis
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CoA和 3,4-二羟基苯乳酸在迷迭香酸合成酶(RAS)的
作用下生成迷迭香酸。苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酪氨
酸氨基转移酶（TAT）是迷迭香酸生物合成途径中的切
入点酶[8]（关键酶）。目前不少植物中迷迭香酸的生物
合成酶基因已经被分离克隆（如丹参[9]和彩叶草[10-11]中
迷迭香酸合成途径中的对羟基苯丙酮酸还原酶基因和
TAT基因），但在紫苏中均尚未见报道。本研究的重点
在于通过基因克隆方法得到紫苏代谢相关 PAL基因
片段，为进一步得到紫苏 PAL基因全长，阐明紫苏中
迷迭香酸的代谢途径打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试紫苏种子来自黑龙江省饶河县饶河农场，于
25℃的光照培养箱内培育40天后，取第三对嫩叶作为
实验材料。
1.2 酶及试剂
氯仿、异丙醇、乙醇购自天津市风船化学试剂科技
有 限 公 司 ；RNAiso Plus，Ribonuclease Inhibitor，
Reverse Transcriptase M-MLV，Taq酶均购自TAKARA
公司；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限
公司；引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。
1.3 方法
1.3.1 设计引物 根据已报道的唇形科植物丹参及藿香
的 PAL基因核苷酸序列进行同源性分析，设计紫苏
PAL 基因片段（命名为 PerPAL-1）的引物，上游：
5’-AAGCGGATGGTGGAGGAGTTC-3’；下 游 ：
5’-TTTCGAATCTGATGCCGGAGTAG-3’；同时，根据
已报道的紫苏β-Actin序列（AB002819.1）设计引物，上
游 ：5’-GATCTGGCACCACACCTTTT-3’；下 游 ：
5’-GATCACGACCAGCAAGATCC-3’，片段长度为
302 bp。
1.3.2 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成 使用
RNAiso Plus提取紫苏真叶中的总RNA，取 2 μL作为
模板，反转录合成 cDNA第一链，反转录产物置
于-80℃保存，备用。
1.3.3 目的基因的扩增 采用 20 μL反应体系，以 1 μL
反转录产物 cDNA为模板，反应条件为：94℃ 2 min；
94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，34 个循环；72℃
10 min。产物用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用
DNA凝胶回收试剂盒回收目的扩增产物，送至上海生
工生物工程技术服务有限公司测序。
1.3.4 PerPAL-1序列生物信息学分析 利用ClustalW2
在线分析DNA和蛋白质同源性(http://www.ebi.ac.uk/
Tools/clustalw2/ index.html)，然后使用 Clustalx1.83对
PerPAL-1和其他植物已知的 PAL序列进行多序列比
对分析，通过MEGA4.1软件NJ（Neighbor-Joining，邻
接法）构建PAL的系统进化树[12-16]。
1.3.5 PerPAL-1基因的组织表达特异性检测 分别提
取同株紫苏叶、茎、根的总RNA，反转录合成 cDNA第
一链，用紫苏β-Actin基因作内标参照，调整 cDNA量
和循环数，使内标基因的表达丰度一致，以调整后的
cDNA 模板量进行 PerPAL-1 基因扩增 [14]，并采用
Quantity one软件进行相对表达量分析。
2 结果与分析
2.1 紫苏真叶总RNA的提取
取 3 μL提取后的总RNA，在 1%的琼脂糖凝胶上
进行电泳检测（图 1）。结果表明，提取的紫苏真叶中
总RNA完整性好，可以进行后续反转录实验。
2.2 PerPAL-1基因的克隆及测序
根据设计的 PerPAL-1基因引物，进行 RT-PCR。
扩增得到的产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳，如图 2所
示，产物片段长度与预期一致。
将目的片段回收，经上海生工正反双向测序，得到
28 S
18 S
5 S
图1 紫苏真叶总RNA
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1
M：DNA Marker DL2000；1：PerPAL-1基因的PCR产物
图2 PerPAL-1基因PCR产物
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吕晓玲等：紫苏苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆及序列分析
长度为 399 bp的PerPAL-1基因序列，共编码 133个氨
基酸（图 3）。将 PerPAL-1基因序列提交到GenBank
中，获得的登录号为HQ388347.1。
2.3 氨基酸序列比对及进化树分析
2.3.1 氨基酸序列比对分析 通过 ClustalW2在线对
PerPAL-1基因片段序列与其他物种进行比对，结果表
明，所得的片段核苷酸序列与已报道的唇形科植物丹
参（ABD73282.1）及藿香（AAK15640.1）的PAL基因相
应片段同源性分别为92%，89%，氨基酸序列同源性则
分别达 96%，95%（图 4），与洋地黄（AJ002221.1）PAL
基因相应片段的核苷酸序列同源性为 85%，同时与甘
薯（M29232.1），长春花（AB042520.1）的也达 80%以
133 AAGCGGATGGTGGAGGAGTTCAGGAAGCCGGTGGTCAAGCTCGGCGGAGAGACCCTCACC
K R M V E E F R K P V V K L G G E T L T
193 ATATCGCAGGTGGCGGCAATCGCAGCCCGGGATAATGCTGTGGCGGTGGAGCTGGCGGAG
I S Q V A A I A A R D N A V A V E L A E
253 TCGGCCAGGGCCGGCGTCAAGGCCAGCAGTGATTGGGTTATGGAGAGCATGAATAAAGGG
S A R A G V K A S S D W V M E S M N K G
313 ACCGACAGTTACGGCGTCACCACCGGTTTTGGTGCCACGTCACACCGGAGGACTAAGCAG
T D S Y G V T T G F G A T S H R R T K Q
373 GGTGGCGCTCTTCAGAAGGAGCTCATTAGGTTCCTGAATGCCGGAATATTCGGAAATGGG
G G A L Q K E L I R F L N A G I F G N G
433 ACAGAATCGAACCACACATTGCCGCATTCGGCAACTCGAGCAGCAATGCTTGTTAGGATC
T E S N H T L P H S A T R A A M L V R I
493 AATACACTTCTGCAGGGCTACTCCGGCATCAGATTCAAA
N T L L Q G Y S G I R F K
图3 PerPAL-1基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
图4 PerPAL-1与丹参及藿香PAL氨基酸序列比对
上，说明已经克隆到了紫苏真叶中的PAL基因片段。
2.3.2 进化树分析 使用 Clustalx1.83和MEGA4.1软
件，选用南欧海松（Pinus pinaster）作为 PAL进化树分
支参考，构建紫苏与其他几种植物PAL的系统进化树
（图 5）。由图 5 可见，裸子植物南欧海松（Pinus
pinaster）为一类，单子叶植物玉米（Zea mays），甘蔗
（Saccharum officinarum）为一类，其余的双子叶植物为
另一类，无论是单子叶植物，双子叶植物，还是裸子植
物，都是由共同的祖先进化来的，且双子叶植物的遗传
距离小于单子叶植物。还可看出，紫苏（Perilla
frutescens）与藿香（Agastache rugosa）、丹参（Salvia
miltiorrhiza）等唇形科植物的 PAL蛋白质可以归为一
类，因而可以认为紫苏PerPAL-1基因与唇形科其他植
物的亲缘关系较近，氨基酸序列同源性较高，也说明了
克隆到的紫苏 PAL基因片段是 PAL基因家族成员之
一。
2.4 PerPAL-1基因的组织表达特异性分析
以紫苏β-Actin基因作内标，采用半定量RT-PCR
法分析 PerPAL-1基因在根、茎、叶的相对表达量（图
6）。结果表明 PerPAL-1基因在根、茎和叶中均有表
达，其中在叶中的表达丰度最高，在根中次之，而在茎
中的表达丰度最低。由此推断迷迭香酸在紫苏根、茎、
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叶中的含量可能不同，且在叶中最高。
3 结论与讨论
到目前为止，已对核桃[12]、国槐[13]、海桐花[14]、银杏[15]、
毛竹[16]等多种植物的PAL基因进行了克隆，对于紫苏
尚未见相关基因的报道。对丹参中迷迭香酸的生物合
成途径苯丙氨酸支路的研究，为紫苏迷迭香酸合成途
径中 PAL基因的克隆及代谢研究提供了有益的借
鉴。本研究使用同源基因克隆的方法首次从紫苏叶片
中获得PAL基因cDNA片段PerPAL-1。通过与其他植
物核苷酸、氨基酸序列比对及进化树分析表明，
PerPAL-1基因cDNA序列与其他植物中已分离的PAL
基因相应序列具有很高的同源性。同时，研究还表明，
PAL基因在紫苏叶、茎和根中的表达具有组织特异性，
由相对表达丰度的分析结果推断各组织中迷迭香酸的
含量可能不同。
本实验的研究成果为进一步采取克隆方法获得
紫苏PAL基因全长，对其在迷迭香酸生物合成途径中
的功能进行生物信息学分析奠定了理论基础，并且，对
于未来通过基因工程手段提高紫苏迷迭香酸含量都有
着重要的现实生产意义。
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??Agastache rugosa
??Salvia miltiorhiza
??Glycine max ???Catharanthus roseus
???Rudbeckia hirta ??Morus alba
???Arabidopsis thaliana ??Zea mays
??Saccharum oficinarum
????Pinus pinaster
100
85
83
62
48
27
31
99
PAL的GenBank登录号为：藿香（AF326116.1），拟南芥（L33678.1），长春花（AB042520.1），大豆（GQ220305.1），桑树（HM064433.1），南欧海松
（AY321089.1），黑心菊（EF070337.2），甘蔗（EF189195.1），丹参（DQ408636.1），玉米（NM_001111864.1）
图5 利用Neighbor-joining法构建的PAL系统进化树
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
根 茎 叶
PAL
相
对
表
达
量
/%
A：根、茎、叶中PAL相对表达量；B：根、茎、叶中PerPAL-1及β-Actin的PCR产物
图6 PerPAL-1基因在不同组织中的表达
紫苏 rill
藿香 gastache rugosa
丹参 alvi milti rrh a
大豆 l cine max
长春花 thar thus roseus
黑心菊 dbeckia hirta
桑树 ru alba
拟南芥 r bidopsis thaliana
玉米 ea ays
甘蔗Saccharum officinarum
南欧海松Pinus pinaster
8
62
100
4
3
B
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