全 文 ：中国农学通报 2010,26(20):61-64
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
辣椒(Capsicum annuum L.)原产于中南美洲，明朝
末年传入中国。辣椒果实中的辣味主要成分是辣椒素
(capsaicin)类物质(capsaicinoids)。辣椒素类物质不仅
可以镇痛止痒、抗炎消肿、调节食欲等，在医药工业中
具有广泛应用，是新型可供开发的绿色环保农药。最
新研究更是表明，辣椒素能促使癌细胞凋亡，同时还不
会伤害周围的健康细胞，有望成为下一代国际抗癌药
物的核心成分。目前在食品添加剂、医药产品和生物
农药等方面具有广阔的开发前景，因而培育高含量辣
基金项目：海南省自然科学基金（80611）。
第一作者简介：龙笛笛，女，1989年出生，海南万宁人。通信地址：570228海南大学园艺园林学院07园艺，E-mail：275821249@qq.com。
通讯作者：成善汉，男，1975年出生，湖北黄石人，硕士生导师，海南大学园艺园林学院副教授，博士，主要从事蔬菜遗传育种与分子生物学研究。
E-mail：chshh81@yahoo.com.cn。
收稿日期：2010-03-08，修回日期：2010-06-09。
海南黄灯笼椒辣椒素合成酶基因克隆及表达研究
龙笛笛，成善汉，王 玲，李 星，申 亮，周 超，谢丽萍
（海南大学园艺园林学院园艺系，海口 570228）
摘 要：辣椒素是辣椒果实最重要的品质性状，在食品、医药和工业上都具有重要应用前景，其含量高低
决定辣椒辣度大小。辣椒素合成酶（CS）被认为是调控辣椒素合成过程关键酶，此研究根据Genbank已
经报道的辣椒素合成酶 csy1基因序列设计引物，通过RT-PCR法从黄灯笼椒中克隆了一片段 csy-h。序
列分析表明，csy-h长 750 bp，与数据库报道的 csy1基因同源性高达 98%以上，蛋白质同源性达 100%。
表达证实，csy-h在辣椒果实胎座组织表达，且随果实发育表达量先增加后下降。研究CS活性和辣椒素
含量发现，随着果实发育，胎座组织CS活性和果实辣椒素、二氢辣椒素含量均呈先上升后下降趋势，前
者最高峰值出现在花后 35天，后者峰值出现在花后 42天。上述结果暗示，csy1基因表达量决定CS活
性，后者决定辣椒素和二氢辣椒素的含量。
关键词：黄灯笼辣椒；csy1基因；表达；辣椒素；CS活性
中图分类号：S 文献标志码：A 论文编号：2010-0607
Cloning of Capsaicin Synthase and its Expression Research for Huangdenglong Pepper
Long Didi, Cheng Shanhan, Wang Ling, Li Xing, Shen Liang, Zhou Chao, Xie Liping
(College of Horticulture and Gardening, Hainan University Haikou 570228)
Abstract: Capsaicin is most important quality trait in the fruits of pepper and has been widely applied to food,
medicine and industry. Capsaicin synthase(CS) is recognized as a key enzyme regulating the process of
capsaicin. Basing on the sequences of capsacin synthase gene csy1 known at Genbank, in this article the
primers were designed to clone a fragment csy-h from Huangdenglong pepper by RT-PCR. Analysis of
sequences showed that csy-h had shared the 98% homologous to csy1 gene known at Genbank, 100%
homologous at protein sequences each other. Expression identified that csy-h expressed at placenta tissue of
pepper fruits with increasly firstly, then decreased. Reseach on activity of CS and content of capsaicin
indicated that CS activity at placenta and content of capsaicin and dihydrocapsaicin decreased after increased
respectly, with the peak of 35 days after flowering at the former and 42 days after flowering in the latter. Above
results showed that the level of csy1 expression determined the activity of CS which dedicated the content of
capsaicin and dihydrocapsaicin.
Key words: Huangdenglong pepper; csy1 gene; expression; capsaicin; activity of CS
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椒素的辣椒对于提高辣椒的附加值具有重要意义[1]。
辣椒因具独特的辣味而深受人们的喜爱。辣椒中
与辣味相关的辣椒素类物质主要有辣椒素(Capsaicin)
和二氢辣椒素 (Dihydrocapsaicin)，约占总辣椒素的
90%，是影响辣度最主要的成分，而提高辣椒素含量已
经成为评价辣椒品质、辣椒制品辣度分级和药效研究
等的重要项目 [1]。辣椒素合成酶（capsaicin synthase，
CS）催化辣椒素合成过程最后一步反应，即 8-甲基-6-
癸烯酰CoA与香草基胺合成辣椒素，被认为是辣椒素
合成调控的关键酶。Narasimha Prasad等[2]从3种不同
类型辣椒包括 C. chacoense、C. frutescens、C. annuum
中克隆了CS蛋白基因，命名为csy1，研究表明，它们核
苷酸序列同源性高达100%。
黄灯笼椒是辣椒属的另外一种极辣类型，拉丁名
为：C. chinense Jacq.，初步测定辣度在 150000SHU左
右（关于辣椒及辣椒制品辣度评价的方法，目前国际市
场通常采用的是美国的“SHU”辣度单位[3]），总辣椒素
含量达9.73 mg/g，被尊称为“辣王”。此研究拟从黄灯
笼椒中克隆辣椒素合成酶基因，并分析该基因表达情
况，研究CS活性与辣椒素含量的关系，为丰富不同辣
椒类型 csy1基因资源和通过基因工程方法调控辣椒
素含量打下基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
黄灯笼椒种植于海南大学农学园试验基地，待开
花后开始取样。
1.2 菌株、质粒、酶和试剂
此试验中使用的大肠杆菌 (Escherichia coli)为
DH5α,所用质粒载体为实验室常备pUC18, Amp抗性，
使用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4-DNA连接
酶、分子量Marker、高保真DNA聚合酶 Pyrobest购自
大连宝生物公司，PCR引物由上海生工生物技术公司
合成，DNA测序由上海基康生物技术公司完成。
1.3 辣椒素合成酶csy1基因部分片段克隆与分析
提取开花后42天辣椒果实总RNA，并反转录合成
第一链 cDNA。在抽提RNA过程中，一方面要严格控
制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制
内源性的RNA酶。
依据数据库已经报道的辣椒素合成酶基因序列
（NCBI assession DQ349223，349224，349225，349226，
349227，FJ157227）设计引物并在引物两端加入BamH
Ⅰ和HindⅢ酶切位点，设计引物为：P1：5’GTG TCC
TCG GAG TTT GCG 3’；P2: 5’ACG GGA GAC CAC
CTA TCA 3’。PCR反应体系为：5 μL 10 ×Pyrobest
buffer，6 μ L dNTPs, 0.5 μ L Pyrobest DNA 聚合酶
（5 U/ul），2 μL P1和2 μL P2（各25 pmol/ul），1 μL DNA
模板链，加水至 50 μL。PCR反应程序为：95℃ 3 min
预变性，95℃ 1 min，50℃ 50 s，72℃ 75 s，30个循环，最
后72℃ 5 min延伸。PCR扩增产物用BamHⅠ和Hind
Ⅲ酶切后连接到 pUC18上，转化大肠杆菌，挑选重组
子检测并送到上海基康公司测序。序列分析通过
Blast和Clustalw完成。
1.4 csy1基因在辣椒果实发育过程中表达与酶活性测
定
csy1基因的表达通过Northern杂交进行分析。从
开花期开始，分别于花后 14、21、28、35、42、49天对辣
椒果实进行取样，采用异硫氰酸胍法抽提果实总
RNA，异硫氰酸胍法提取RNA的原理如下：GIT与β－
巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷
基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放
RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起
变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA
纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建
cDNA文库，因此为大多数人采用。采用Roche公司
生产DIG RNA标记试剂盒进行探针标记，按照试剂盒
上说明进行DIG标记的Northern杂交及检测[4]。辣椒
素合成酶活性测定参考Narasimha Prasad等的方法，整
个反应体系中包含 0.5 M磷酸钾 buffer (pH 6.8), 1 M
MgCl2, 1 M ATP, 5 M香草胺或 8-甲基十二酸，CoA和
每mL反应混合物中加入1 mL酶提取液，反应混合液
在37℃温育2 h后用氯仿萃取浓缩后重新溶于100 μL
甲醇中，最后以HPLC来测定辣椒素的水平。
1.5 辣椒素含量分析
辣椒素、二氢辣椒素含量测定、总辣椒素含量计算
参考王燕等和湖南省地方标准（DB43/T275-2006）[5]方
法进行。
2 结果与分析
2.1 csy1基因部分序列克隆与分析
以黄灯笼椒开花42天后果实提取的总RNA反转
录第一链 cDNA为模板，P1、P2为引物进行高保真扩
增。扩增产物琼脂糖凝胶电泳分离显示，目的片段大
小接近 750 bp（图 1）。回收目的片段，用BamHⅠ和
HindⅢ双酶切后连接到 pUC18上，转化DH5a。抽提
质粒，双酶切结果见图 2，表明目的片段已经连接到
pUC18上，从中挑选重组子进行测序。
测序结果采用 Blast分析（表 1）显示，目的片段
csy-h与NCBI已经报道的辣椒素合成酶基因 csy1和
类似受体蛋白激酶基因（putative receptor-like protein
·· 62
龙笛笛等：海南黄灯笼椒辣椒素合成酶基因克隆及表达研究
kinase gene）同源性高于95%。Clustalw比对目的序列
片段（暂名：csy-h，来自于黄灯笼椒 C. chinense Jacq.）
以 及 FJ157227 （C. frutescens） 、 DQ349227
（C.chacoense）、DQ349226（C. frutescens）、DQ349225
（C.annuum）、DQ349224（C. frutescens）、DQ349223
（C.annuum）表明，csy-h与DQ349223-349227同源性高
达 100%，与 FJ157227同源性为 98%，蛋白质序列
100%相同，说明不同辣椒种csy基因序列没有差异，序
列差异不是导致辣味差异的原因。
2.2 黄灯笼椒果实发育中 csy1基因表达
分别以花后0、14、21、28、35、42、49天辣椒果实胎
座组织以及花后 35、42、49天果皮、胎座组织总RNA
为模板，以DIG标记的 csy-h为探针做Northern杂交。
结果表明，随着黄灯笼椒辣椒果实发育，csy1基因表达
量增加，35天左右表达量出现最高峰，此后表达量虽
有降低但维持高表达态势（图 3），csy1基因主要在果
实胎座中表达，果皮中基本检测不到（图4）。
2.3 黄灯笼椒果实胎座组织CS活性变化
辣椒素合成酶是辣椒素合成中关键酶，定位于果实
胎座表皮细胞的液泡膜上，因而此研究只测定黄灯笼椒
果实胎座CS的活性。结果表明，随着果实发育成熟，CS
活性呈先增加后下降趋势，与 csy1表达量变化趋势相
似，活性最大值出现在花后 35天，达 2.78 nmoL/min
（图5）。
1 2
bp
2000
1000
750
500
bp
925
1 2
1：D，L-2000 marker；2：PCR产物
图1 PCR扩增产物凝胶电泳
1:λ-EcoT14；2:digest分子量标准
图2 重组载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定
表1 测序结果的Blast分析
Accession
FJ157227.1
FJ517664.1
DQ349227.1
DQ349226.1
DQ349225.1
DQ349224.1
DQ349223.1
EF560217.1
AC232776.1
Description
Capsicum frutecens capsaicin synthas(csy1)qene,complete cds
Capsicum frutecens capsaicin synthas mRNA,complete cds
Capsicum chacoense capsaicin synthas(csy1)qene,complete cds
Capsicum frutecens capsaicin synthas(csy1)qene,complete cds
Capsicum annuum capsaicin synthas(csy1)qene,complete cds
Capsicum frutecens capsaicin synthas (csy1)mRNA,complete cds
Capsicum annuum capsaicin synthas(csy1)mRNA,complete cds
Capsicum frutecens putative receptor-like protein kinase qene,com
Solanum lycopersicum chromosome 2 clone C02SLm0132H19,com
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图3 csy1基因在果实发育中表达量变化
0 14 21 28 35 42 49 花后天数/d/rRNA
果皮
胎座
图4 csy1基因在果皮和胎座组织情况
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0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
14 21 28 35 42 49 56
CS活性
2.4 黄灯笼椒果实发育中辣椒素和二氢辣椒素含量变
化
黄灯笼椒果实发育过程中辣椒素和二氢辣椒素含
量变化见图6，结果表明，花后14天即出现辣椒素，而且
随着果实发育成熟，辣椒素含量呈先增加后下降趋势，
含量最高峰出现在花后 42天，达到最高峰 6.21 mg/g。
果实发育过程中二氢辣椒素、总辣椒素含量变化表现
相同的趋势。
3 结论与讨论
辣椒素合成酶调控辣椒素生物合成的最后一步，
该基因的克隆以及与辣味的关系研究是揭示辣椒素生
物合成分子机理的基础。为此，Lee等[6]通过SCAR标
记研究发现，无辣辣椒缺乏C基因，Stewart等[7]克隆了
该基因并命名为AT3，测序表明是一种乙酰基转移酶，
病毒诱导基因沉默证实AT3基因沉默导致辣椒素类物
质积累下降。Narasimha Prasad等则通过纯化蛋白质
末端测序结合 RT-PCR 法从极辣辣椒 M-4（C.
frutescens）中克隆了辣椒素合成酶基因 csy1，并从C.
chacoense、C. annuum中分离了该序列。该研究根据
csy1基因序列设计引物，从海南黄灯笼椒（C. chinense
Jacq.）中克隆了类似基因片段 csy-h，比对结果表明，
csy1和csy-h基因与AT3基因同源性很低。Ben-Chaim
等[8]证实 6个不同主效QTL影响辣椒素类物含量，说
明除 csy1基因外，还可能存在其他基因如AT3基因影
响辣椒素含量。
该研究此外还发现辣椒果实发育中 csy-h基因的
表达量与CS活性大小呈相同的变化趋势，Narasimha
Prasad等还发现辣椒素含量最高峰出现时间较CS活
性出现时间较晚，说明CS活性可能是辣椒素含量增加
的主要原因之一。此外，从来自于该研究黄灯笼椒
csy-h基因片段和来自于 C. chacoense、C. annuum、C.
frutescens csy1基因片段同源性高达 100%，而表达量
不同的结果看，可能 csy1基因存在转录水平的调控机
制。
参考文献
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capsaicinoid content in capsicum, Theor. Appl. Genet., 006,113(8):
1481-1490.
0
2
4
6
8
10
12
14 21 28 35 42 49 56
辣椒素
二氢辣椒素
总辣椒素
图5 黄灯笼椒果实胎座组织CS活性变化 图6 黄灯笼果实发育过程中辣椒素和二氢辣椒素含量变化
S
含
量
/(
m
g/
g)
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