全 文 ：紫苏分离蛋白酶解制备抗菌肽的工艺优化
姜文鑫1，王晓飞2，崔玲玉2，闵伟红2，*
（1.阿鲁科尔沁旗天山镇食品药品监督局，内蒙古赤峰 025550；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，
吉林长春 130118）
摘 要：以紫苏分离蛋白为原料，通过碱性蛋白酶（Alcalase）水解制备紫苏抗菌肽。以大肠杆菌为指示菌，在单因素试
验基础上，运用响应面（RSM）法对水解条件进行优化，并研究了紫苏抗肽的广谱抗菌性、热稳定性和水解度与抑菌性
的关系。结果显示：在加酶量 6.89 %、酶解温度 52.68℃、底物浓度 4.17 %、pH 8.98，水解 3 h的条件下，酶解产物 RSM
的理论预测值为 19.33 mm，实际测量值为 19.40 mm。广谱抗菌试验表明：紫苏抗菌肽对沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金
黄色葡萄球菌均有抑制作用。水解度和抑菌性试验表明：抑菌性随水解度增加而增强，后趋于稳定。
关键词：紫苏；抗菌肽；响应面；酶解
Enzymatic Preparation Optimization of Antimicrobial Peptides from Perilla Protein Isolate
JIANG Wen-xin1，WANG Xiao-fei2，CUI Ling-yu2，MIN Wei-hong2，*
（1. Food and Drug Administration of Tian Shan Town Ar Horqin Banner，Chifeng 025550，Inner Mongolia，
China；2.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，
Jilin，China）
Abstract：In this experiment， perilla seed protein isolate as raw material， through alkaline protease （Alcalase）
was prepared by hydrolysis of Perilla antibacterial peptide. Using Escherichia coli as indicator bacteria， based
on single factor experiments， using response surface （RSM） to optimize the hydrolysis method， we study the
relationship between the Perilla anti peptide antibacterial property， thermal stability and hydrolytic degree and
bacteriostasis. Results： in 6.89 % of the amount of enzyme， hydrolysis temperature 52.68 ℃ ， substrate
concentration 4.17 %， pH 8.98， 3h hydrolysis conditions， prediction theory of enzymatic hydrolysate of RSM
value was 19.33 mm， the actual measured value is 19.40 mm. Antibacterial tests showed that： perilla inhibition
effects of antibacterial peptides on Salmonella， bacillus and Staphylococcus aureus were. Show that the degree
of hydrolysis and the Bacteriostatic Experiment： the antibacterial activity was increased with the increasing
degree of hydrolysis， then tended to be stable.
Key words：Perilla； antibacterial peptide； response surface； enzymatic hydrolysis
作者简介：姜文鑫（1988—），男（汉），硕士研究生，研究方向：发酵
工程。
*通信作者：闵伟红（1971—），女，教授，博士，研究方向：发酵工程、
粮油科学与深加工技术。
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.035
抗菌肽是广泛存在于动植物体内一类小分子多
肽，具有广谱抗菌性、耐热性、无免疫原性和对人体无
毒副作用等特点[1-2]，近年来越来越受到人们的重视。
自 1974年瑞典科学家 Boman[3]等首次发现天蚕素，人
们逐渐在细菌、真菌、植物、昆虫类、两栖类、禽类、和哺
乳动物中相继发现具有类似功能的生物多肽，国内外
的研究主要集中在微生物抗菌肽和动物抗菌肽，而对
植物来源的抗菌肽则相对较少[1]。通过酶解植物蛋白
制备抗菌肽具有成本低廉、来源广泛和工艺简单等
特点[4]。
紫苏（Perilla Prutescens Linn，Britton）为生唇形科
植物一年草本植物[5]，是我国传统的药食两用植物。紫
苏籽中的含油率高达 45 %左右[6]，目前对紫苏籽的研
究主要集中在紫苏籽油的开发利用，而对油料副产物
紫苏籽粕用于饲料或直接丢弃，为提高紫苏资源的利
用价值，本研究以脱脂紫苏粕提取的分离蛋白为原
生物工程
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 2月
第 36卷第 3期
138
料，水解得到具有抑菌活性的多肽，并研究其广谱抗
菌性等理化性质、水解度与抗菌性的关系，为紫苏资
源的开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫苏粕：由敦化广晟生物油脂有限公司。菌种：吉
林农业大学食品科学与工程学院发酵工程实验室。
Alcalase 2.4L蛋白酶：FG Novozymes公司；其余试剂均
为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
EF-20型实验室 pH计：瑞士梅特勒-托利多集
团；Z36HK 高速冷冻离心机：德国 HERMLE 公司；
CL-32L高压蒸汽灭菌器：日本 ALP；GNP-9080培养
箱：上海精宏实验设备有限公司；振 HZQ-F160荡培养
箱：哈尔滨东联电子技术开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 紫苏分离蛋白的制备
紫苏分离蛋白通过碱溶酸沉法制备[6]。
1.3.2 紫苏抑菌肽的制备
取适量蛋白液放入 90℃水浴中加热 15 min，水浴
冷却后调节 pH，按一定体积质量比加入 Alcalase蛋白
酶，在一定温度的水浴条件酶解 3 h，用 NaOH溶液维
持初始 pH，90℃灭酶 15 min，水浴冷却，5 000 r/min离
心 10 min，取上清液进行冷冻干燥，4℃保存备用。
1.3.3 抑菌活性的测定
采用琼脂孔穴扩散法[6-7]。
1.3.4 响应面试验设计
根据 Box-Behnken 中心组合设计原理 [8]，进行响
应面试验，试验设计编码表见表 1。
1.3.5 水解度与抑菌性的关系
在响应面优化的基础上，采用最佳酶解条件对紫苏
分离蛋白进行酶解，研究水解度和抑菌性的关系[9-10]。
pH-star法进行测定[11]。
1.3.6 加热时间和冻融次数对紫苏抑菌肽稳定性的
影响
参照宋茹[11]方法进行。
1.3.7 紫苏抑菌肽在不同 pH条件的抑菌活性
不同 pH条件的抑菌活性参照 Mason[12]方法进行。
1.3.8 紫苏抑菌肽的广谱抑菌性
参照 Das [13]方法进行。
1.4 数据用 origin 7.5和 Design-Expert8.0进行分析，
所有试验为 3个平行。
2 结果与分析
2.1 响应面优化试验结果
2.1.1 响应面试验结果及显著性分析
响应面试验结果及显著性分析如表 2、表 3。
表 1 响应面中心设计法各因素编码值和实际值
Table 1 The factors code value and actual value of center design of
the response surface method
-1 50 8.5 3 50
0 70 9.0 4 55
+1 90 9.5 5 60
X1加酶量/
（μL/g）
X2 pH
X3底物浓度/
（g/100 mL）
X4温度/℃
水平
因素
表 2 Box-Behnken中心组合设计方案及结果
Table 2 The Box–Behnken design for optimizing hydrolysis
conditions with antibacterial zone length（mm）
试验号
变量编码水平 抑菌圈直
径/mmX1 X2 X3 X4
1 -1 -1 0 0 18.2
2 1 -1 0 0 18.2
3 -1 1 0 0 17.9
4 1 1 0 0 17.9
5 0 0 -1 -1 17.7
6 0 0 1 -1 18.4
7 0 0 -1 1 16.6
8 0 0 1 1 18.2
9 -1 0 0 -1 18.4
10 1 0 0 -1 18.5
11 -1 0 0 1 18.1
12 1 0 0 1 17.4
13 0 -1 -1 0 16.5
14 0 1 -1 0 16.4
15 0 -1 1 0 17.5
16 0 1 1 0 17.6
17 -1 0 -1 0 16.6
18 1 0 -1 0 16.6
19 -1 0 1 0 18.2
20 1 0 1 0 17.3
21 0 -1 0 -1 18.7
22 0 1 0 -1 18.3
23 0 -1 0 1 17.7
24 0 1 0 1 18
25 0 0 0 0 19
26 0 0 0 0 19.3
27 0 0 0 0 19.3
28 0 0 0 0 19.2
29 0 0 0 0 19.2
姜文鑫，等：紫苏分离蛋白酶解制备抗菌肽的工艺优化生物工程
139
找出最佳工艺参数以及各参数之间的相互作用。
2.1.3 验证试验
验证试验效果图见图 2。
根据 Design-Expert8.0.6.1软件的分析，得出紫苏
蛋白水解抑菌肽的最佳工艺条件为：加酶量 68.96μL/g、
pH 8.93、底物浓度 4.2 g/100 mL、酶解温度 52.98 ℃，在
此条件下得到的抑菌圈直径预测值为 19.318 9 mm。结
合实际条件，选择加酶量为 69 μL/g、pH 8.93、底物浓度
4.2 g/100 mL、酶解温度 53 ℃，图 2为此条件下的抑菌
效果图，得到的抑菌圈直径为（19.6±1.1）mm与理论预
测值 19.3 mm无显著性差异（0.05﹤P），表明试验所得
模型可以用于预测实际值。
2.2 水解度与抑菌性的关系
水解度与抑菌性的关系如图 3。
如图 3所示，在响应面优化后的最佳工艺条件
下，随着水解时间的增加，紫苏蛋白的水解度逐渐增
加，抑菌逐渐增大。这一结果表明紫苏抑菌肽至少在
水解 7 h的时间内，抑菌性和水解度成正相关关系。与
图 1 各因素交互作用影响还原能力的响应面图
Fig.1 Response surface of mutual influence on the reducing power ability
运用 Design-Expert8.0.6.1软件对结果进行分析，
得抗菌肽抑菌直径的二次多元回归方程为：
Y=19.18-0.17X1-0.12X2+0.65X3-0.3X4-0.25X1X2-
0.15X1X3-0.25X1X4+0.15X2X3+0.25X2X4+0.2X3X4-0.6X12-
0.62X22-1.37X32-0.35X42；
去掉不显著的一次项 X2、和二次项 X1X4、X2X4、
X3X4后最终为：
Y = 19.18 - 0.17X1 + 0.65X3 - 0.3X4 - 0.25X1X2 -
0.15X1X3 + 0.15X2X3 - 0.6X12 - 0.62X22 - 1.37X32 - 0.35X42
由表 3可知，决定系数 R2为 0.976 1，模型可以预
测 97.61 %的响应值变化，模型显著性检验极显著（P<
0.000 1），模型失拟项不显著（P =0.097 6），说明模型拟
合度较好，试验误差较小，可以用此模型对紫苏多肽
的抑菌率的响应值进行分析和预测[14]。各因素对抑菌
性结果影响大小的顺序为：底物浓度＞酶解温度＞加酶
量＞pH。
2.1.2 显著性交互作用影响分析
各因素交互作用影响还原能力结果如图 1所示。
从图中可以直观地反映各因素对响应值的影响，
变异来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性
模型 21.4 14 1.53 40.79 <0.000 1 **
X1 0.33 1 0.33 8.89 0.009 9 **
X2 0.16 1 0.16 4.36 0.055 6
X3 5.07 1 5.07 135.29 <0.000 1 **
X4 1.08 1 1.08 28.82 <0.000 1 **
X1X2 0.25 1 0.25 6.67 <0.000 1 **
X1X3 0.090 1 0.090 2.4 0.021 7 *
X1X4 0.25 1 0.25 6.67 0.143 5
X2X3 0.090 1 0.090 2.4 0.021 7 *
X2X4 0.25 1 0.25 6.67 0.143 5
X3X4 0.16 1 0.16 4.27 0.057 8
X12 2.32 1 2.32 61.96 <0.000 1 **
X22 2.52 1 2.52 67.25 <0.000 1 **
X32 12.23 1 12.23 326.44 <0.000 1 **
X42 0.79 1 0.79 21.00 <0.003 5 **
残差 0.52 14 0.037
失拟项 0.48 10 0.048 3.97 0.097 9 不显著
纯误差 0.048 4 0.012
总离差 21.93 28
表 3 回归模型显著性检验及方差分析
Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression
model
注：*表示差异显著（0.05﹤P）；**表示差异极显著（0.01﹤P）。
90.00
82.0074.00
66.00
58.00
50.008.50
8.708.90
9.10
9.30
9.50
17
17.5
18
18.5
19
19.5
抑
菌
圈
直
径
B：pH A：加酶量
9.50
9.30
9.10
8.90
8.70
8.503.00
3.50
4.00
4.50
5.00
16
17
18
19
20
抑
菌
圈
直
径
C：底物浓度 B：pH
90.00
82.00
74.00
66.00
58.00
50.003.003.50
4.00
4.50
5.00
17
17.5
18
18.5
19
19.5
抑
菌
圈
直
径
C：底物浓度 A：加酶量
16.5
图 2 响应面优化后的紫苏抑菌肽抑菌效果图
Fig.2 After the response surface optimization of Perilla
antibacterial picture
注：1.阳性对照为卡那霉素；2.阴性对照为紫苏蛋白粉；3.号样为未优
化前的样品；4.号样为优化后的样品。
生物工程姜文鑫，等：紫苏分离蛋白酶解制备抗菌肽的工艺优化
140
水解度趋势不同的是，在水解 180 min后，紫苏抑菌肽
的抑菌性增加速度趋于缓慢，这可能是因为随着酶解
反应的进行，蛋白质分子被酶不断水解成较小肽链，
而根据以往的报道，抗菌肽一般为 12个~100个氨基
酸残基的肽链，所以随着酶解的进行，紫苏抑菌肽的
抗菌效果逐渐增大，然而当酶解继续进行时，抗菌肽
可能被进一步水解成更小的寡肽或氨基酸，抑菌性效
果增速降低[15]。
2.3 紫苏抑菌肽在不同 pH条件下的抑菌效果
紫苏抑菌肽在不同 pH条件下的抑菌效果见图 4。
图 4显示了紫苏抑菌肽在 pH 3~11的范围内抑
菌效果对比，由图可知无论在大于或小于 pH 9.0的
条件下，紫苏抑菌肽的抑菌效果都逐渐下降，与之前
宋茹报道的有所不同[16]，这可能是因为紫苏抑菌肽是
在 pH 8和 9的条件下水解得到的，偏离这 pH 8和 9
时对紫苏抑菌肽的结构和周围电荷都有很大的影响，
进而影响了紫苏抑菌肽的抑菌性。值得一提的是在
pH 6.0后紫苏抑菌肽的抑菌性急剧下降，这可能是因
为紫苏抑菌肽的等电点在 pH 5.0左右[4]，在等电点时
紫苏抑菌肽的溶解性最低，进而导致了抑菌效果的
下降。
2.4 紫苏抑菌肽的广谱抑菌性
紫苏抑菌肽的广谱抑菌性效果见图 5。
由图 5可知，紫苏对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球
菌和枯草芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌大肠杆菌和鼠
伤寒沙门菌的生长均具有抑制作用，这表明利用
Alcalase对紫苏分离蛋白在一定条件下水解所得到的
多肽具有广谱抑菌性。
3 结论
在本试验中，以大肠杆菌为指示菌，利用 Alcalase
对紫苏分离蛋白进行水解，分别对加酶量、酶解 pH、底
物浓度和酶解温度进行考察，在单因素试验的基础上
根据 Box-Behnken中心组合设计原理，进一步对酶解
条件进行响应面优化，得出最佳工艺为：加酶量 69μL/g、
pH 8.93、底物浓度 4.2 g/100 mL、酶解温度 53 ℃，在此
条件下的到紫苏抑菌肽抑菌能力和水解度成正相关
性关系，对革兰氏阴性菌大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌，
革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生
长均具有抑制作用，具有广谱抑菌性，并且在 pH9.0左
右的抑菌能力最强。紫苏抑菌肽作为一种潜在的抑菌
肽来源在未来的实际应用中具有很大的潜力。
参考文献：
[1] Li Y, Xiang Q, Zhang Q, et al. Overview on the recent study of an－
timicrobial peptides: origins, functions, relative mechanisms and ap－
plication[J]. Peptides, 2012, 37(2): 207-215
[2] Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms[J]. Na－
ture, 2002, 415(6870): 389-395
[3] Boman H G, Nilsson-Faye I, Paul K, et al. Insect immunity I. Char－
acteristics of an inducible cell -free antibacterial reaction in
hemolymph of Samia cynthia pupae [J]. Infection and Immunity,
1974, 10(1): 136-145
[4] Roy F, Boye J, Simpson B. Bioactive proteins and peptides in pulse
crops: Pea, chickpea and lentil[J]. Food Research International, 2010,
43(2): 432-442
[5] 盛彩虹,刘晔,刘大川,等.紫苏分离蛋白功能性研究[J].食品科
学, 2011, 32(17): 137-140
[6] 孙长江,张建新,汪璇,等.响应面法优化黄粉虫抗菌肽酶解工
21
20
19
18
17
16
15
14
抑
菌
圈
直
径
/m
m
0 100 500
时间/min
200 300 400
36
32
28
24
20
16
12
水
解
度
/%
水解度
抑菌圈直径
图 3 水解度与抑菌性的关系
Fig.3 The relation between degree of hydrolysis and bacteriostasis
21
20
19
18
17
16
15
14
13
抑
菌
圈
直
径
/m
m
2 3 12
pH
4 5 6 7 8 9 10 11
图 4 pH条件与抑菌性的关系
Fig.4 The relation between degree of hydrolysis and bacteriostasis
图 5 紫苏抑菌肽分别对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌
的抑制效果图
Fig.5 Perilla antibacterial peptide of bacillus subtilis，
staphylococcus aureus，salmonella inhibitory effect
姜文鑫，等：紫苏分离蛋白酶解制备抗菌肽的工艺优化生物工程
枯草 沙门金黄 大肠杆菌
141
艺[J].食品科学, 2013, 34(7): 234-239
[7] 苏翔,崔敬爱, 陈晓平. 蚂蚁抗菌肽的分离纯化及其活性[J].食
品科学, 2013, 34(9): 70-73
[8] Tan Y, Ayob M, Osman M, et al. Antibacterial activity of different
degree of hydrolysis of palm kernel expeller peptides against spore-
forming and non-spore-forming bacteria[J]. Letters in applied mi－
crobiology, 2011, 53(5): 509-517
[9] Tironi V A, A觡ón M C. Amaranth proteins as a source of antioxidant
peptides: Effect of proteolysis[J]. Food Research International, 2010,
43(1): 315-322
[10] 李桂峰,赵国建,肖春玲,等.金针菇蛋白酶解制备抑菌肽的工
艺优化及功能评价[J].中国食品学报, 2012, 12(10): 107-112
[11] 宋茹.黄鲫 (Setipinnataty)蛋白抗菌肽的制备及抗菌作用等生物
活性研究 [D].青岛:中国海洋大学, 2011
[12] Mason A J, Gasnier C, Kichler A, et al. Enhanced membrane disrup－
tion and antibiotic action against pathogenic bacteria by designed
histidine-rich peptides at acidic pH[J]. Antimicrobial agents and
chemotherapy, 2006, 50(10): 3305-3311
[13] Das R, Dutta A, Bhattacharjee C. Preparation of sesame peptide and
evaluation of antibacterial activity on typical pathogens [J]. Food
Chemistry, 2012, 131(4): 1504-1509
[14] 黄群,杨万根,余佶,等.杜仲籽粕蛋白酶解制备抗氧化肽工艺
优化[J].食品科学, 2013, 34(17): 205-209
[15] 龚吉军,李振华,李忠海,等.响应曲面法优化油茶粕抗菌肽制
备条件 [J].中国食品学报, 2012, 12(9): 137-143
[16] a觢tag 譕, Popovic L, Popovic S, et al. Hydrolysis of pumpkin oil cake
protein isolate and free radical scavenging activity of hydrolysates:
Influence of temperature, enzyme/substrate ratio and time[J]. Food
and Bioproducts Processing, 2010, 88(2): 277-282
收稿日期：2014-11-16
植物多糖的降血糖作用概述
徐小娟1，徐芳1，毛宇1，贺建华2，*
（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128；2.湖南农业大学动物科学技术学院，
湖南长沙 410128）
摘 要：糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种与遗传因素有关又与多种环境因素有关的慢性全身性疾病，许多植物
多糖具有良好的降血糖功效，现将植物多糖降血糖作用机制的研究进展做一综述。
关键词：糖尿病（DM）；植物多糖；降血糖
Summary of Plant Polysaccharide Fall Blood Sugar Function
XU Xiao-juan1，XU Fang1，MAO Yu1，HE Jian-hua2，*
（1. College of Food Science And Technologe. Hunan Agricultural Universrty，Changsha 410128，Hunan，
China；2. College of Animal Science And Technologe，Changsha 410128，Hunan，China）
Abstract：Diabetes mellitus is a chronic systemic disease which is affected by the genetic factor and
environmental agent . According to the recent study about hypoglycemic effect of the plant polysaccharides and
its mechanisms， Many plants polysaccharides had a good effect on reducing blood sugar. In this paper， the
relevant studies were reviewed.
Key words：diabetes mellitus； plants polysaccharide； reducing blood sugar
基金项目：科技部国际科技合作专项基金（2011DFA30490）
作者简介：徐小娟（1987—），女（汉），在读硕士，研究方向：营养与食
品卫生。
*通信作者：贺建华，男，教授，博士，研究方向：营养与健康。
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.036
1 糖尿病
糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组由于胰岛素
分泌、胰岛素作用低下，或两者同时缺陷所导致的人
体碳水化合物、脂肪、蛋白质、水、电解质等代谢紊乱。
通俗而言是指胰腺产生不了足够的胰岛素或人体无
法有效利用所产生的胰岛素时产生的一种慢性疾病。
其临床表现为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体重减
少。据统计，50 %的 DM患者死于心血管病（主要是心
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
专题论述
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 2月
第 36卷第 3期
142