全 文 ：山东农业大学学报 (自然科学版 ) , 2仪万 , 37 ( 3 ) : 3 39 ~ 34
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以 of hS a n d o gn A幼 c ul t u ar 】Uin ve sr iyt ( N at u司 cS i en ce )
山东抗寒石楠茎段再生体系的建立
刘 静` , 王长宪 ` ,黄艳艳 , , 胡淑芳 ` , 张 虹 ` ,王厚新` ,孙仲序“ ’
( 1
. 泰安市泰山林业科学研究院 , 山东 泰安 27 l lX旧 ; 2 . 山东农业大学园艺学院 , 山东 泰安 27 10 1 8)
摘要 :利用石楠茎段水培 、 种子无菌催芽建立无菌外植体 ,研究并筛选了嫩茎启动培养和嫩梢增殖培养基以
M s + 6 一 BA I
.
o m岁 L + N A Ao . l m『 L 和 M S + 6 一 B AZ . o m岁 L + N AA o . s m岁 L 为好 ,经茎段再生诱导正交试验得出 ,
最佳组合为 M S + 6 一 B2A . o m岁L + N AOA . l m岁L ,影响茎段再生分化的因素种类排列为 6 一 B A > N从 > 茎段部
位。
关健词 :石楠 ;侧芽分化 ;继代 ;茎段再生
中图分类号 :阶2 . 36 文献标识码 : A 文章编号 : l x x ) 一 2324 《2 X() 6 ) 03 一 0 339 一 06
E S T A B L IS HM E[ N T O F RE G E N E R A T I O N SY S T E M O F SH A N D O N G C R n J
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,
H UA N G Y an
一 y a n , H u S H U 一 fa gn
,
Z H O N G H o n g
,
WAN G H O U 一 x i n
,
SU EN Z h o n 一 x u
( 1
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A b s str
e t : E s abt il
s h e d a s e p t i e e x p lan t b y H yd or 卯n i e s o f S et m eS gln e n t a n d irP m i n g se e d s of 卢人o t in i a s e洲 -
阮 a iL n d l , an d i n ve s it 邵 t e d ht a t ht e s u i t a b l e m e d i u m o f in i t i a l fo r hP o ti n i a s e im l a at U n d l s h o t 15 M S m e d i u m
s u 一 p P l e m e n t e d w iht 6 一 B A 1
.
o m岁 L an d N A A 0 . l m岁 L , an d ht e s u iabt l e m e d i u m of er P n 记u e it o n 15 M S
m e d i u m s u 一 Pp l e m e n t e d w iht 6 一 BA 2
.
o m岁 L a n d N A A 0 s m岁 L . B y P先O t in 她 s e r 以a at 几耐之 st e m s e目rn e n t
i n d u e it o n o rt h o即 n al d e s i , e却 e ir m e n t , i呷 or v i n g ht e o P ti m al m e d i u m 15 M S m e d i u m s u 一 p P l e m e n t e d w iht 6 -
B A 2
.
o m岁 L an d N A A 0 . l m岁L . aF e to o h a v e e fe e st o n s t e m s e卿e n t er d i fe er n t ia it o n 15 6 一 B A > N AA >
s t e m s e目l l e n t .
K ey w o r ds
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u d er d ife er
n ti a ti o n
,
M u l i it p il e a it o n e u l tu er
,
le af 花 ge n e ar t ion
由于受地域及气候影响 ,我国北方广大地区常绿树种多为针叶树 , 阔叶树种大多是落叶树 , 基本没有
常绿阔叶乔木树种 。 植物转基因技术为解决植物耐寒问题提供了有效途径 。 利用抗寒基因转化园林植物
优良品种 , 培育转基因抗寒良种 ,将对丰富园林绿化树种 , 达到三季有花四季常绿的效果 , 具有重要意义 。
本研究通过对山东长期抗寒驯化的石楠 (尸ho t iin a : e厅以a at 几dln )顶芽 、种子 、幼苗叶片愈伤组织的诱导 , 旨
在获得抗寒转基因的石楠再生体系 ,进而增加北方地区常绿阔叶树的良种 。
1 材料与方法
1
.
1 试验材料
1
.
1
.
1 外植体采集 1 月中旬 ,从泰山林科院内石楠树上剪取多年生枝条 , 先用 3% 的洗衣粉水浸泡 10
一
20 m in 并用毛刷刷洗 ,再用自来水冲洗 1 一 h2 。 放人光照培养箱进行水培催芽培养 ,待幼芽长至 1 一 cZ m
后 ,剪取幼嫩茎段作为外植体 。
1
.
1
.
2 种子处理 将去年沙藏的石楠种子放在光照培养箱中进行光照催芽 , 待新芽自动脱去种皮时以
收稿日期 : 2 X() 5 一 05 一 25摹金项目 :山东省科技厅 “ 自然科学基金 ” 资助项 目
通讯作者 : Ahut or for e~ ep
n d e n o e
.
E 一 m越 l : xz s mt @ s d a u , e d e . e n
·30 4
· 山东农业大学学报 (自然科学版 )第 3 7卷
新芽为外植体进行试验 。
l L
·
3嫩茎的采集以接种的幼嫩新梢诱导侧芽萌发 ,获得无菌苗后 , 从无菌苗上剪取嫩茎 , 进行培养 。
以上材料在光照培养箱中进行培养时温度乃℃左右 , 光赚时间 12 丫 d . 为保持培养液新鲜不生杂菌须每 2
天换水一次 。
1
.
2 试脸设计
根据以往的组培经验并借助其他文献资料 ,进行嫩茎启动和增殖培养配方设计见表 1。
表 1 嫩茎启动和增班培养配方设计 (以 MS 为基本培养甚 )
介愁触 1 h . 时叫皿 d因加 or 七日u d加. . 翻 p . 甲明护目. 。山灿稗 Or 成 . . 阳沙耽川
激攀组合
H面 m旧n e . , , . n丫明 6叭
6 一 B人( m扩 L ) N A A ( 印了L )
嫩茎的启动培养 1 0 . 5 0 . 1
In d u e it on J s et m 2 0
.
5 0
.
5
邵目口 e n st e ul 加比 3 1 . 0 0 . 1
4 1
,
0 0
.
5
嫩茎增殖培养 1 1 , 0 0 . 05
巧叩卿 it on e o l t” J吧 2 1 . 0 0 . 1
试 at 翎 韶小阴” t 3 1 0 0 . 5
4 2
.
0 0
.
0 5
5 2
。
0 0
.
1
6 2
.
0 0
,
5
剪取嫩茎分化的幼苗茎段 ,进行再生分化诱导 ,采用 珍 ( 34 )的正交试验设计 , 如表 2 所示 :
表 2 19 《3 4 }正交试脸设计表
T a b加 2 0动昭o画 山川 , 协 ( 3 4 )
水平
肠 , e l
因素
F朗 lor
茎段部位
反em se 因m e in
B A ( m g/ L ) N A (
m『L )
嫩 2 . 0 0 . 5
中 1 . 0 0 . 1
老 , 0 . 5 0 . 05
1
.
3 试脸方法
1
.
3
.
1 外桂体处理 方法一 :将水培催芽获得的 l 一 cZ m 嫩茎切下泡人无菌水中浸泡 30 而叭接种 。 方法
二 :进行光照催芽的种子当子叶展开并弹掉种皮时用无菌水把种皮冲洗掉 , 冲洗 2 次后 , 浸泡在无菌水中
备用 。 在无菌条件下把外植体分别放人 70 % 乙醇中浸 15 ,随后用 0 . 1% H gC I: 消毒 5 一 s m in ,不断摇动 ,
使其充分接触消毒液 。 无菌水冲洗 3 一 5 次 。 将材料放在灭菌的滤纸上吸干水 ,将嫩茎基部剪去 0 . sc m
后 , 接种到空白培养基上进行无菌苗的筛选 ;将催芽的种子直接接种到空白培养基上进行无菌苗的筛选 。
1
.
3
.
2 茎段分化的诱导 .筛选出无菌苗后 , 从无菌苗上剪取嫩茎 ,进行分化培养 ,从长出的侧芽中剪取
老 、 中、嫩 3 个层次茎段 ,长度 2 一 3c m ,将茎段周围叶片去掉 , 用刀片划几道伤口 , 平铺于培养基表面 。
1
.
3
.
3 培养条件及统计方法 培养温度 25 士 2℃ ,光照强度约为 2 (拟 )1。 ,光周期为 12 丫d 。 另外 ,茎段诱
导需进行 7 一 14 d 二的黑暗培养 ,然后见光培养 。 根据不同材料 、不同试验目的 , 间隔不同时间进行调查 。 调
查指标为 : 污染率 (% ) = 污染数 /接种数 x 10 ;存活率 ( % ) = 存活数 /接种数 x 10 ;侧芽萌发率 (% ) 二 萌
发数量 /接种数量 、 10 ;
第 3期 刘静等 :山东抗寒石楠茎段再生体系的建立 3 41
2结果与分析
2
.
1不同外植体的无菌体培养
2
.
1
.
1嫩茎培养 采用水培嫩芽和室外嫩芽 2种外植体进行对比接种 ,外植体处理方法相同 。 10 d 后两
者污染率与存活率的对比见表 3 。
表 3 不同外植体的灭菌效率
aT b le 3 E n笼e t of c on at m加旧柱on co n仕 0 1 of ht e d i月阮. e n t e却肠口妇
灭菌材料
M . er n al
接种瓶数 真菌污染率 (% )
Con t
a p , i n , 6 on 成
旬 n ig
细菌污染 (% )
C o n t抓种亩朋石on of
ba e t州 a
存活率 ( % )
S u州 v司 m t e
水培嫩茎
T e n d e r 阳目m e nt i n
sol
u d o n
室外嫩茎
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n d er se 脚e n t
ou st id e
由表 3 可以看出 ,无论是水培的嫩茎还是室外的嫩茎 ,细菌污染要 比真菌污染严重 , 主要因为其内生
菌含量较高或者消毒不彻底 。 另外 ,水培嫩芽接种后污染率要低于室外材料 , 而且存活率高 , 以后的生长
和分化状况也较好 , 这是由于室外菌量较大 ,所以带菌多 ,灭菌困难 。
2
.
1
.
2 种子培养 将催芽的种子接种在空白培养基上 10 d 后污染率与存活率的结果见表 4 。
表 4 种子灭菌后污染率与存活率的对比
T a b le 4 C o n t n ” t or ht e ar et o f c o n . , m i n ,廿加 如 d s以哟 ve “ 吮e r st e d n ” 廿。 n
灭菌材料
M at e ir al
接种瓶数 真菌污染 (% )
uF
n
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n at 川 ian it on
细菌污染 (% )
Bac t ier
a c on 加 m in a石。
存活率 (% )
uS 州 via 花 t e
种子
S沈 d
由表 4 可以看出 ,种子的污染以细菌为主 ,这是因为种子内生菌含量较高 ;存活率不高是因为新萌发
种子的幼嫩组织易受消毒液的损伤所致 。
2
.
2 启动培养
外植体消毒接种后 ,经 15 d 之后 , 获得无菌苗 ,采用不同浓度细胞分裂素 6 一 B A 和生长素 NA A 启动
石楠侧芽生长 ,共设 4 个处理 ,每个处理重复 10 瓶 , 调查结果如表 5 所示 。
表 5 不同浓度的 6 一 B A 和 N A A 配比对分化率的影响
T a b】e S E月兔d of d理er 代 nt co o c e n tr a吐o n of 6 一 B A 仙d N A A o n ar t e of 创晚er n柱a t io n
处理号
N u m be r
6 一 B A ( m岁L ) NA ( m岁L ) 接种个数
A m o u n t
萌发个数
C吧m i
n a it o n a l l ,ou n t
萌发率 (% )
几 t e of 罗m l in心。
由表 5 可看出 ,侧芽启动的较好培养基为 M S + 6 一 B A I . o m g/ L + N AAO . l m g/ L , 当生长素的浓度为 0 .
s m岁 L 、细胞分裂素浓度为 0 . s m岁 L 时 , 基部愈伤组织体积较大 ,侧芽分化率很低 。 由试验看出生长素和
细胞分裂素浓度太低时 , 芽的分化率较低 。 总体来看 ,各组合的分化率都不高 ,生长素的范围比较窄 。
·
3 4 2
· 山东农业大学学报 (自然科学版 )第 3 7卷
2
.
3增殖培养
将上述无菌苗转接到分化培养基上 ,进行继代培养 ,周期为 3d0 。 经观察 ,最初转人时增殖系数较低 ,
经过 2 一 3 次的继代培养 ,丛生芽的分化数目增多。 这是由于经多次继代培养后幼芽逐渐积累 6 一 BA ,适
应了瓶内环境 , 因此繁殖系数增加 。
为进一步探讨石楠嫩茎的最佳分化培养基 ,进行了如下试验 。 采用不同浓度的 6 一 B A 与不同浓度
NA A 组合研究分化配方 。 培养 40 d 后 ,调查结果见表 6 。
表 6 6 一 BA 和 N A A 不周浓度配比对芽.J 殖的影晌
T a b l e 6 E肠eC t or d比er r e n t 0 . 改旧臼 , 目oL n ou P r雌明笋 U o n or b u d
处理号 N u喇比 r 6 一 BA ( m了 L N A A ( m了 L 接种 个数
人 -
m 0 Unt
分化个数 A-
m ou n t of d沐
fe r e n it如。
分化 率 (% )
枷把 of d苗 er r .
即 6州 。 n
颜色 CO肠 u r 生长势 C田俐 h
弱中强0 . 0 5
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.
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.
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黄绿
绿
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绿
浓绿
,J内joō43509
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30
5051,.0.0,…1进,`,妇
2
内`à
4气一6
从试验结果可以看出 ,分化较好的配方组合为淤 + 6 一 B2A . o m岁 L + NA Ao . s m g/ L ,用此配方培养 , 分化侧芽数量较多 ,且苗木粗壮 ,颜色浓绿 ,但基部仍有如花生米大小的绿色愈伤组织 。 当细胞分裂素浓度由
1
.
o m岁 L增加到 2 . o m留L 且 N从 从 0 . 05 功以 L增加到 .0 s m岁 L时 , 芽增殖明显 。 另外 , 由结果可 以看
出 ,当 6 一 B A 为 2 . Om岁 L ,且与 N AA 两者比值为 20 倍左右时 ,增殖率相对较低 , 当两者比值为 4 倍左右
时 ,增殖率较高 , 可达 93 . 3% 。
2
.
4 茎段再生分化诱导试验
用 MS 为基本培养基 ,设计 6 一 B A 、 N A AZ 种激素以及不同取材部位和处理 (见表 2 ) , 每个处理因素设
3 个水平 。 采用 19 ( 3礴 )正交试验设计 , 每个组合重复至少 3 瓶 , 每瓶 3 一 5 个茎段 , 30 天后调查侧芽分化
个数 、萌芽长度和生长势 ,结果见表 7 。
表 7 不同组合对石楠茎段再生分化诱导的影晌
1切翻协 7 祝示戏 or d l价卿耐 ~ M
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因素 L , e l 试验组号 茎 段 部 位
N u倒比 r S t颇 阴即祀 nt N A ( m了 L )
侧 芽分化 个 萌芽 平均 长
6 一 B A ( m叮 数 儿加朋 t 试 度 Av e n唱 e 生 长 势
L ) 拍山氏 . m i西on le叫 h of ht e G刊附 ht
bdu ha d (
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1 7
.
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.
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.
8 5 1
.
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.
0 8
3 3
.
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. 砚为 5 . 3 2
2 5
.
6 3 1
.
2 1 3
.
5 0
3 4
.
50 1
.
17 3
.
2 0
1 3
.
7 5 1
.
16 3
. 《犯
3 4
.
4 1 1
.
2 2 4
.
2 5
8 3 2 2 5
.
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.
3 0 4
.
7 5
9 3 3 1 4
.
7 5 1
.
17 5
.
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_
_
_ ~ - 一一 一 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~由图 l 可看出 , 不同组合对石楠茎段再生分化侧芽的影响 , 以第 l 、 2 组合 , 即剪取嫩茎部分 + MS + 6
一
BI
.
0一 OA娜酬L + NA冉D . 1一刃 . s m以 L 对侧芽分化最好 。由图 2 可看出 ,不同组合对右楠茎段再生分化侧芽长度的影响 , 以第 1 、 8 组合 , 即剪取嫩茎部分采用
第 3 期 刘静等 :山东抗寒石楠茎段再生体系的建立
·
3 43
·
6一 2 B
.
OA m留 L+ NAA O. sm留 L对侧芽长度生长最好 ;其次是剪取老茎部分采用 6一 I B. OA m岁 L+ NAA O.
l m岁 L对侧芽长度生长较好 。
侧穿个掀
人对口 . 目t o
溯黔如
2 , 咤 5 6 7 8 9 组馆目 砚岭川
图 1 不同组合对石楠茎段再生分化侧芽的影响
iF g 1 hT
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^ , . 即如咖 。如加 d (甲〕 - - - - - - - - - - - - - - - -— -— 组含, 沉~图 2
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e e任戈 et of d i月er er nt
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不同组合对楠茎段再生分化侧芽长度的影响
w n山 i n it on fO l at e司 b u d l e n hgt o n th e 况d汪比二 int on fO c ih sne e p ha it 滋a
1 2 3 4 5 6 7 8 9
扭合
T . 川 . 云.
由图 3 可看出 ,不同组合对石楠茎段再生分化侧芽生长势的影响 ,仍以第 1 一 2 组合 , 即剪取嫩茎部分
+ M S + 6 一 B l
·
0 一 2
,
OA m岁L + NA AO . 1 一 0 . s m岁L 对侧芽生长势最好 。
表 8 不同组合对石楠茎段再生分化诱导影响极差分析
T ab l
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an 公ys is of v iar iat on art e il 面 it ng e fe e t of d迁er enr t co mb in iat on of H~
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e 护月i feT 肥n it iat on of C ih n es e hP o l i n i a
极差 U面 it ng d证er er ~ 因素 F a c otr 茎段部位 St e m eS g m e n t NA ( m岁L ) 6 一 BA ( 印『L )
726153048.5.4L.40知xZ3侧芽分化数
A〔口o u n t of
d i氏 r , n 6俩行on bu d
5
.
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.
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.
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.
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.
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5
,
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5
.
9
4
.
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1
.
6 9
1
.
2 7
1
.
25
1
.
16
0
.
1 1
4
.
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4
.
7 8
觅一x2劝R孙犯萌芽平均长度
A v e班 ge 俪加 of
ht e b u d
生长势
C m 峨h
x3 4
.
6 7 4
.
4 4
.
26
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.
8 6 0
.
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.
70
. .
- -
.一 .一- ~ . - - .一- . ~一 .- .一 . - .一. - .一- . ~一~ . - ~ - - - .- 曰- -从极差分析结果得出 ,影响茎段侧芽分化的因素种类排列为 6 一 B A > N A A > 茎段部位 , 最佳组合为 :剪取嫩部茎段 + M S + 6 一 B2A . Om岁 L + NAOA . l m岁 ;L 影响萌芽平均长度的因素种类排列为 6 一 B A >
·3 4
· 山东农业大学学报 ( 自然科学版 ) 第 7 3卷
NA A >茎段部位 ,最佳组合为 : 剪取嫩部茎段 + M S + 6 一 B2A . o m岁 L + N AOA . s m『 L ;影响萌芽生长势的因
素种类排列为茎段部位 > NA A > 6 一 B A ,最佳组合为 : 剪取嫩部茎段 + M S + 6 一 B2A . o m扩 L + N A A o .
s m梦 L 。
2
.
5 种子苗分化培养 将经过筛选的种子苗接种在已筛选出的最佳分化培养基上进行继代培养 ,
20 d 后种子苗基部形成愈伤组织 , 40 d 后接近愈伤组织的茎基部抽出新芽 , 6d0 后在新抽出的茎段上形成
丛生芽 。 经过 2 次继代培养后丛生芽生长迅速 ,形成直径 1 一 c4 m 的芽团 。
3 小结
3
.
1 试验证明石楠内生菌含量高是引起石楠外植体细菌污染的主要原因 。 石楠种子萌发前附着粘
液 ,灭菌困难 ,最好待种子萌发后 ,先剥去种皮 ,再灭菌可以降低灭菌的难度 。
3
.
2 石楠启动培养的最适培养基是 M S 培养基 ,且培养基附加 6 一 B AI . o m岁 L + NA AO . l m岁 L 时启
动培养效果明显 ,降低 6 一 B A 浓度或提高 N AA 浓度都会降低侧芽分化率 。
3
.
3 有利于石楠增殖的激素种类是 6 一 BA 和 NA A ,石楠增殖的最佳培养基是 M S + 6 一 B A 2 . Om酬 L
+I BOA
.
s m扩 L , 用这一配方培养 2 一 3 代后石楠侧芽增殖明显 ,增殖率最高可达 93 . 3% , 但基部仍有如花
生米大小的绿色愈伤组织且在叶片的伤口处也有少量白色愈伤组织 ,这可能是在继代培养中激素积累的
结果 。
3
.
4 石楠茎段再生分化诱导的最佳培养基为 :剪取嫩部茎段平铺在 M S + 6 一 B A 2 . Om岁 L + N A AO .
l m留L 上 , 30 d 之可诱导出 3 一 7 个丛生芽 ,这较茎段直立竖插在培养基增殖系数增加 2 一 3 倍 ,基本能满
足基因转化的再分化需要 。
3 5 利用种子进行培养可大大缩短石楠苗的分化时间并能获得质量较高的丛生芽 。
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Sh o t 二罗 n e art i o n 阮 m l e af e却 lan ts Of dw 涌 n g a p p le 、 t s t朋 k〔J〕. J lP an t p hy s i o l , 19 2 , l 4() ( 2 ) : 22 3 一 2 2 8
〔玉3〕 马翠萍 , 孙仲序 ,赵春芝 ,张演义 , 植物组培污染防治的研究概况 ,生物技术 , 2 00 2 , 8 , 12 ( 4) 46 一 47