全 文 ：工 艺 技 术
2013年第8期
Vol . 34 , No . 08 , 2013
紫苏叶抗氧化物质超声提取工艺的优化
代 沙，吴 卫*，谢晓娟
（四川农业大学农学院，四川成都 611130）
摘 要：在单因素的基础上，采用正交实验设计对影响紫苏叶超声提取物抗氧化活性因素中的乙醇浓度、超声时间和
料液比3因素进行优化，用总还原能力和·OH清除率反映紫苏提取物的抗氧化活性。结果表明，紫苏叶抗氧化活性物
质最佳提取条件为：体积分数40%的乙醇、料液比1∶45（g·mL-1）、超声提取70min，超声提取2次。在此条件下，总还原能
力为（1.21±0.021），·OH清除率为22.49%±7.94%。
关键词：紫苏，抗氧化活性，正交优化
Optimal extraction of techology antioxidants in the leaves of
Perilla frutescens by ultrasonic
DAI Sha，WU Wei*，XIE Xiao-juan
（Agronomy College，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）
Abstract：An orthogonal array design was applied to optimize ultrasound -assisted extraction of antioxidant
properties from Perrila frutescens. Three relevant factors that influence the antioxidant activity of the Perrila
extract were investigated：ethanol concentration，extracting time and solid-liquid ratio. And the effect of each
factor was estimated using deoxidization ability and elimination ratio of hydroxyl radicals as indicators. The
results showed that optimal conditions for the extraction could be used 40% ethanol as extraction solvent with a
solid-liquid ratio 1 ∶45g·mL-1 for 70min. Under this condition，the deoxidization ability and elimination ratio of
hydroxyl radicals of extractions were the best with value at （1.21±0.021） and 22.49%±7.94%，respectively.
Key words：Perilla frutescens；antioxidant activity；orthogonal array design
中图分类号：TS202 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2013）08-0277-05
收稿日期：2012－10－15 * 通讯联系人
作者简介：代沙（1987-），女，硕士研究生，研究方向：药用植物此生代
谢产物研究。
基金项目：四川省育种攻关项目（2006yzgg12）；校科技成果转化基金
（003523519）。
紫苏（Perilla frutescens）系唇形科一年生草本植
物，是我国传统的中药材[1]。以叶、梗、果实分别入药，
其中紫苏叶具有解表散寒、行气和胃的功效[2]，是我
国卫生部首批颁布的60种“药食同源”品种之一，具
有很高的利用价值。我国资源丰富，很多地区均有
栽培，四川地区紫苏产量高，并且品种多样。在北方
主要以油用为主；南方以药用为主，兼做香料和食
用[3-4]。而现代药理表明，紫苏具有抗氧化、抗炎抗过
敏、降脂保肝、抗癌、增强记忆力等功效。抗氧化剂能
够清除体内过多的活性氧，维持活性氧代谢的平衡，
防止疾病的发生，还能防止食品变质，对人们的生活
具有很重要的作用。紫苏抗氧化活性较为显著，有
报道其含有的迷迭香酸清除自由基离子的能力强
于抗坏血酸，其提取物抗氧化活性也明显强于维生
素C[5-8]。所以，紫苏作为一种天然的抗氧化物质来源
的植物，具有较高利用价值。而超声波提取法能够缩
短提取时间，提高提取效率；并且其提取设备简单，
易操作。虽然已有许多关于紫苏叶超声波提取的报
道，大多是针对黄酮和多酚含量的超声提取优化，而
针对抗氧化活性的物质超声提取报道不多，并且各
个文献结果不完全相同。紫苏新品系P06-4为本课题
组经多年选育的叶用型紫苏新品系，已于2011年通
过四川省中药材新品种审定。本文拟对该紫苏新品
种叶片抗氧化物质进行超声提取优化，通过测定其
抗氧化活性来进行判断提取方法的优劣，试图找出
最佳超声提取方法，为以后进一步利用紫苏叶的抗
氧化活性奠定基础。由于体外抗氧化活性判断的标
准纷繁复杂。基于不同的化学反应原理，其评价的方
式均有很大的不同。为了研究紫苏提取液抗氧化活
性在不同方面的应用，也基于抗氧化研究的标准，本
文选取了两种不同的抗氧化活性的方法，对优化的
条件进行综合的评价。这可以综合考虑紫苏叶在不
同抗氧化活性方面的作用，并且还能够为开发不同
的紫苏天然的抗氧化剂做一定的铺垫。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫苏叶 于2010年将紫苏品系P06-4，在雅安种
植，采用随机区组实验设计，三次重复，小区面积
16m2，小区长宽比4∶1，株行距50cm×60cm，小区间间
隔0.6m，四周设置保护行，3月中下旬至4月上旬播
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种，并于9~10月开花初期，采用五点采样法，对紫苏
叶进行采收，晒干，粉碎，过40目筛，备用；乙醇、盐
酸、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、硫酸亚铁、双氧水、
水杨酸等 均为国产分析纯；水 蒸馏水。
UV-2450型紫外分光光度计 日本岛津公司；
SB-3200 DTD型超声波清洗仪 宁波新芝生物科技股
份有限公司；HH-4型恒温水浴锅 国华电器有限公
司；RE-2000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 提取方法 称取40℃烘干至恒重的紫苏粉末
1.00g于50mL离心管中，加入一定浓度一定料液比的
乙醇溶液，超声提取（频率：40kHz；功率：180W）一定
时间，提取一定次数。过滤，收集滤液，40℃冷凝旋转
浓缩蒸发，提取剂定容到100mL。然后测定提取液总
的抗氧化能力和清除自由基的能力。
1.2.2 单因素实验 参照参考文献[9-11]，在处理条
件一致的情况下，研究不同乙醇浓度（10%、30%、
50%、70%、90%）、不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、
1∶50）、不同提取时间（15、30、45、60、75min）、不同提
取次数（1、2、3、4、5次）对紫苏叶中抗氧化物质抗氧
化活性的影响。
1.2.3 正交实验 在单因素实验基础上，设计正交
实验，优化从紫苏叶中提取抗氧化物质的工艺条件。
选取乙醇浓度、超声时间和料液比为研究对象，采用
正交表L9（34）设计正交实验。
1.2.4 总还原能力的测定 采用普鲁士蓝还原法，参
考Oyaizn M等的研究[12-13]。取1mL试样，加pH6.6的磷酸
缓冲液2.5mL和质量分数为1%铁氰化钾（K3Fe（CN）6）
溶液2.5mL，混合后在50℃放置20min，加入质量分数
10%三氯乙酸溶液2.5mL混合，取混合液2.5mL，加入
2.5mL蒸馏水和质量分数0.1%氯化铁2.5mL，混匀，静
置10min，在700nm处测定吸光度。试剂空白为参比溶
液。吸光度越高，抗氧化性越好，还原能力越强。
1.2.5 羟基自由基清除能力的测定 采用Fenton法[14]
测定体外清除羟基自由基的能力。在25mL比色管中
依次加入7.5mmol·L-1 FeSO4 3mL，1% H2O2 3mL，然
后摇匀，接着加入6mmol·L-1水杨酸3mL，摇匀，于
37℃水浴加热15min后取出，510nm测定其吸光度A0。
然后分别加入一定量一定浓度的待测液，摇匀，继续
水浴加热15min，取出测其吸光度AX。待测液对羟自
由基（·OH）清除率为：·OH清除率（%）=（A0-AX）/A0×
100
1.3 综合指标的确定
由于体外抗氧化活性的评价标准不统一，必须
采取至少2种不同的抗氧化体系进行评价，所以在对
提取方法的优化中，对抗氧化活性的评价指标进行
综合评价。
综合评价的方法选用综合评分法：由于普鲁士
蓝法和Fenton法均表现为数值越大，抗氧化活性越
强。但是由于两个指标的数值单位不同，不能直接用
其数值进行加权表示，所以用“隶属度”来表示分数，
然后进行综合评分。积分越高者，抗氧化活性越强。
隶属度过难关= 指标值-指标最小值
指标最大值-指标最小值
1.4 数据处理
采用DPS对数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 单因素实验分析
2.1.1 乙醇浓度对提取紫苏叶抗氧化物质的影响
不同浓度乙醇对紫苏叶提取物抗氧化活性的影响结
果（见图1）表明，随着乙醇浓度不断增加，总还原能
力不断减小；对·OH的清除率表现为：随乙醇浓度的
增加，变化趋势不具有一定规律性。说明低浓度的乙
醇溶液对具有总还原能力的物体提取更具有高效
性。由于具有抗氧化活性的物质有糖类、皂苷、酚类、
花色素苷等[15]，大部分为亲水性物质，所以低浓度乙
醇溶液提取出具抗氧化活性的物质更多。在乙醇体
积分数为30%和70%时，对·OH的清除率较高。根据
不同乙醇浓度对总还原能力和·OH清除率的隶属度
表（见表2），综合不同乙醇浓度对总还原能力和·OH
清除率影响两个抗氧化活性指标来看，30%的乙醇
浓度综合抗氧化活性积分最高，所以抗氧化活性最
强，说明此浓度为适宜的乙醇浓度。
2.1.2 料液比对提取紫苏叶抗氧化物质的影响 不
同料液比对紫苏叶提取物抗氧化活性的影响结果表
明（见图2），随着料液比的增加，总还原能力先下降
水平
因素
A 乙醇浓度（%） B 超声时间（min） C 料液比（g/mL）
1 40 70 1∶35
2 30 75 1∶40
3 20 80 1∶45
表1 正交实验因素水平表
Table 1 The factors and levels of orthogonal test
图1 不同乙醇浓度对体外抗氧化活性的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the
antioxidant activities
乙醇溶液体积分数（%）
0 20 40 60 80 100
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
羟
基
自
由
基
清
除
率
（
%）
羟基自由基清除率
总还原能力
0.400
0.350
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
总
还
原
能
力
乙醇浓度（%） 10 30 50 70 90
总还原能力隶属度 0.525 1.000 0.450 0.445 0.000
·OH清除率隶属度 0.974 0.760 0.531 1.000 0.000
综合隶属度 1.499 1.760 0.980 1.455 0.000
表2 不同乙醇浓度对总还原能力和·OH清除率的隶属度表
Table 2 Membership of ethanol concentration on the
antioxidant activities
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超声时间（min） 15 30 45 60 75
总还原能力隶属度 0.444 0.000 0.574 0.858 1.000
·OH清除率隶属度 0.693 0.000 0.355 0.458 1.000
综合隶属度 1.137 0.000 0.929 1.316 2.000
表4 超声时间对总还原能力和·OH清除率的隶属度表
Table 4 Membership of extraction time on the
antioxidant activities
后升高；·OH清除率先增加后下降，并在1∶40时达到
最大。综合考虑两方面的抗氧化活性，根据料液比对
总还原能力和·OH清除率的隶属度表（见表3），综合
抗氧化活性的积分在料液比为1∶40时最高，即综合
抗氧化活性最强，所以适宜料液比为1∶40。
2.1.3 提取时间对提取紫苏叶抗氧化物质的影响
不同提取时间对对紫苏叶提取物抗氧化活性的影响
见图3，结果表明，随着提取时间的增加，总还原能力
略微下降后逐渐增加；·OH清除率也呈现先下降后
增加的趋势。说明随着提取时间的增加，活性物质的
提取量是不断增加的。但是一定范围内，随着时间的
增加，提取量的增加缓慢，为了节约能源和成本，选
取适宜的提取时间。根据超声时间对总还原能力
和·OH清除率的隶属度表（见表4）表明，超声提取时
间为75min时，总积分最高，综合抗氧化活性最强，在
设定范围内，75min为较佳的提取时间。
2.1.4 提取次数对提取紫苏叶抗氧化物质的影响
提取次数对紫苏叶提取物抗氧化活性的影响结果
（见图4）表明，随着提取次数的增加，总还原能力不
断增加，提取2次时增加很明显，以后增加缓慢；·OH
清除率也先增加后，趋势变缓，略有下降，提取5次时
又增加。根据超声次数对总还原能力和·OH清除能
力的隶属度表（见表5），超声提取5次抗氧化活性综
合积分最高，所以抗氧化活性最强。但提取次数对
抗氧化活性的影响在提取2次剧烈增加后，再增加提
取次数，抗氧化活性的增加趋势不明显，并且基于节
约能源和资源的角度考虑，认为提取2次为最佳的提
取次数。
2.2 正交实验分析
2.2.1 正交实验设计及结果 根据L9（34）正交实验
设计及结果表（见表6）可知，分析极差R值：从总还原
能力来看，RA＞RD＞RC＞RB，既3个因素对紫苏叶抗氧化
能力中总还原能力的影响：A（乙醇浓度）＞C（料液
比）＞B（超声时间），其中D（空白列）的R值也较大，说
明还有其他因素没有考虑到，根据其他学者对于紫
苏抗氧化物质[16-17]的研究，推测为温度和超声频率；
也有可能是由于各因素之间的交互作用。因素最佳
组合为A1B1C2；而对于·OH清除率的影响：B（超声时
间）＞C（料液比）＞A（乙醇浓度），因素最佳组合为
A3B1C3。从两者的隶属度来看，对紫苏叶提取液综合
抗氧化活性的影响顺序为：C（料液比）＞B（超声时
间）＞A（乙醇浓度），最佳组合为A1B1C3。所以综合两
种抗氧化活性评价体系，最佳超声提取方案为A1B1C3，
即体积分数为40%的乙醇、料液比1∶45（g/mL）、超声
图2 料液比对体外抗氧化活性的影响
Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the antioxidant activities
料液比（g/mL）
0 1∶10 1∶20 1∶30 1∶40 1∶50 1∶60
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
羟
基
自
由
基
清
除
率
（
%）
羟基自由基清除率
总还原能力
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
总
还
原
能
力
料液比（g/mL） 1∶10 1∶20 1∶30 1∶40 1∶50
总还原能力隶属度 1.000 0.424 0.000 0.432 0.502
·OH清除率隶属度 0.000 0.324 0.295 1.000 0.895
综合隶属度 1.000 0.748 0.295 1.432 1.397
表3 料液比对总还原能力和·OH清除率的隶属度表
Table 3 Membership of solid-liquid ratio on the
antioxidant activities
图4 超声次数对体外抗氧化活性的影响
Fig.4 Effect of extraction frequencies on the antioxidant activities
超声次数
0 1 2 3 4 5 6
16.00
14.00
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
羟
基
自
由
基
清
除
率
（
%）
羟基自由基清除率
总还原能力
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
总
还
原
能
力
超声次数（次） 1 2 3 4 5
总还原能力隶属度 0.000 0.827 0.907 1.000 0.995
·OH清除率隶属度 0.000 0.571 0.409 0.432 1.000
综合隶属度 0.000 1.398 1.316 1.431 1.995
表5 超声次数对总还原能力和·OH清除能力的隶属度表
Table 5 Membership of xtraction frequencies on the
antioxidant activities
图3 超声提取时间对体外抗氧化活性的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the antioxidant activities
提取时间（min）
0 10 20 30 40 50 60 70 80
20.00
18.00
16.00
14.00
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
羟
基
自
由
基
清
除
率
（
%）
0.300
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
总
还
原
能
力
羟基自由基清除率
总还原能力
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实验号 A B C D（空白） 总还原能力 ·OH清除率（%） 两者的隶属度积分
1 1 1 1 1 1.060 12.57 1.438
2 1 2 2 2 1.023 11.59 1.281
3 1 3 3 3 1.024 11.49 1.276
4 2 1 2 3 0.924 9.870 0.921
5 2 2 3 1 0.969 14.90 1.367
6 2 3 1 2 0.657 5.990 0.000
7 3 1 3 2 0.910 21.03 1.628
8 3 2 1 3 0.817 14.74 0.979
9 3 3 2 1 1.005 7.740 0.980
总还原能力
K1 3.107 2.894 2.534 3.034
K2 2.550 2.809 2.952 2.590
K3 2.732 2.686 2.903 2.765
R 0.557 0.208 0.418 0.444
·OH清除率
K′1 35.65 43.47 33.30 35.21
K′2 30.7 41.23 29.20 38.61
K′3 43.51 25.22 47.42 36.10
R′ 12.75 18.25 18.22 3.40
两者隶属度积分
K″1 3.994 3.986 2.416 3.784
K″2 2.287 3.626 3.181 2.908
K″3 3.586 2.256 4.271 3.176
R″ 1.707 1.730 1.854 0.876
表6 L9（34）正交实验设计及结果
Table 6 L9（34）orthogonal array design matrix and experimental results
时间为70min。
经过LSR多重比较分析（见表7），由于总还原能
力的方差分析结果表示，因素B的均方MSB（0.007）＜
MSe（0.033）（误差的均方），应该将其归入误差列，
SSe’=SSe+SSB=0.034+0.007=0.041，df’=dfe+dfB=2+2=4，
MSe’=0.041/4=0.010。结果表明，在对总还原能力的
影响中，不同乙醇浓度、超声时间、料液比均无显著
性差异；在对·OH清除率的影响中，料液比、超声时
间两个因素对·OH清除率的作用存在显著性差异
（p＜0.05）。进行综合积分后，三个因素对总的抗氧化
能力的影响均不显著。
2.2.2 验证实验结果 由于最优组合不在正交实验
表中，所以采取最佳组合（A1B1C3）进行2个平行实验，
每个重复3次，提取并测定抗氧化活性，根据表8结果
可以看出，两次验证实验的总还原能力和·OH清除率
均大于正交实验中的所有组合，所以可以验证A1B1C3
的组合为筛选出的最佳组合。
3 结论
通过超声提取法，乙醇溶液为溶剂，通过单因素
实验分析了超声提取过程中乙醇浓度、料液比、提取
次数、提取时间对紫苏叶中提取物质的抗氧化活性
的影响。并且在此基础上，采用L9（34）正交实验，获得
了提取紫苏叶中抗氧化活性物质的最佳条件：体积
分数为40%的乙醇、料液比1∶45（g·mL-1）、超声时间
为70min，超声提取2次。其中各因素中，乙醇浓度对
项目 SS df MS F
A 0.054 2 0.027 2.651
B 0.007 2 0.004 0.359
C 0.035 2 0.017 1.715
误差 0.041 4 0.010
总变异 0.136 10
·OH清除率
A 27.58 2 13.79 13.31
B 66.04 2 33.02 31.87*
C 60.91 2 30.45 29.39*
误差 2.07 2 1.04
总变异 156.61 8
两者隶属度
积分
A 0.530 2 0.265 3.955
B 0.555 2 0.278 4.412
C 0.579 2 0.290 4.321
误差 0.134 2 0.067
总变异 1.798 8
总还原能力
注：*表示差异显著，p<0.05；F0.05（2，4）=6.940；F0.05（2，2）=19.00；
F0.01（2，2）=99.00。
表7 总还原能力、·OH清除率、隶属度的方差分析表
Table 7 Analysis of variance for the antioxidant activities
and memberships
项目 总还原能力 ·OH清除率（%）
验证实验1平均值 1.21±0.021 22.49±7.94
验证实验2平均值 1.19±0.014 21.77±8.28
正交最佳值 1.06 21.03
表8 抗氧化活性的验证实验结果
Table 8 Results of verification tests for the antioxidant activities
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总还原能力的影响最大，超声时间对·OH清除率影
响最大，而综合抗氧活性来看，料液比对总的抗氧化
活性影响最大。在此条件下，总还原能力为（1.21±
0.021），·OH清除率为22.49%±7.94%。与不同中药提
取物的羟基自由基清除能力相比，居于中上水平 [18]。
说明紫苏叶是一种较好的天然抗氧化物质的来源
植物。
参考文献
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证实验结果与预测结果基本接近，表明该优选配方
的合理与可信性。
2.3 最佳配方的验证实验
用回归方程得出的最佳配方和1.2.4节感官评价
系统，得到的实际结果为：
Y验证＝X·R验证＝（0.3，0.4，0.3）·
0.6 0.4 0 0
0.7 0.3 0 0
0.6 0.4 0 0
R1.1＝（0.3∧0.6）∨（0.4∧0.7）∨（0.3∧0.6）=0.4，
R1.2＝0.3，R1.3＝0，R1.4＝0得出Y验证＝（0.4，0.3，0，0），归一
化得：Y0验证＝（0.57，0.43，0，0），最后得分Y＝3.57。验证
实验结果与预测结果基本接近，表明该优选配方的
合理与可信性。
3 结论
采用均匀实验设计原理优化虾味香精的配方，
以感官评定为指标，采用模糊数学原理建立系统的
感官评价方法，确定最优的虾味香精配方。得出优化
配方：酶解液15g、L-蛋氨酸0.6g、L-丙氨酸0.2g、L-精
氨酸0.8g、D-木糖0.6g、阿拉伯糖0.3g、VB1 0.05g、VC
0.20g、盐0.5g和油0.5g。验证实验结果与预测结果基
本接近，表明该优选配方的合理与可信性。最后得出
优化的美拉德反应配方比：虾酶解液80.04%，L-精氨
酸4.27%，L-丙氨酸1.07%，L-蛋氨酸3.20%，阿拉伯
糖1.60%，D-木糖3.20%，VB1 0.21%，VC 1.07%。盐
2.67%，油2.67%。
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