全 文 ：收稿日期:2013-06-24
基金项目:国家自然科学基金(31200512);重庆市自然科学基金(cstc2012jjA80018) ;重庆文理学院特色林木种质资源创新重点实验室平
台建设项目;重庆文理学院校级科研项目(Z2012LX07)
作者简介:刘国花(1976-)，女，硕士，副教授，研究方向:植物生物技术;Tel:13883668411，E-mail:hongdou58771@ sina. com。
* 通讯作者:陈泽雄，Tel:15923962393，E-mail:Chenzexiong1979@ 163. com。
根癌农杆菌介导灰毡毛忍冬遗传转化体系的建立
刘国花1，刘奕清1，2，陈泽雄1，2* ，刘周江1
(1. 重庆文理学院林学与生命科学学院，重庆 402168;2. 重庆高校园林花卉工程研究中心，重庆 402168)
摘要 目的:在建立灰毡毛忍冬再生体系的基础上，建立其遗传转化体系。方法:组织培养方法培养幼苗，根
癌农杆菌介导方法转化外植体，gus染色和 PCＲ检测报告基因。结果:侵染时间 8 min 能获得较理想的转化效果。
35 mg /L的卡那霉素和 600 mg /L头孢霉素能得到很好的筛选效果，起主导作用的因素是卡那霉素浓度，其不同的
浓度间抗性芽诱导率达到了极显著差异。对转基因植株进行 gus染色和 PCＲ检测，结果表明 gus基因已整合到灰
毡毛忍冬基因组中。结论:首次建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，EHA105 菌株)介导的叶片为受体的
遗传转化体系。
关键词 灰毡毛忍冬;根癌农杆菌;遗传转化;PCＲ
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)12-1904-04
Establishment of Transformation System of Lonicera macranthoides Mediated
by Agrobacterium tumefaciens
LIU Guo-hua1，LIU Yi-qing1，2，CHEN Ze-xiong1，2，LIU Zhou-jiang1
(1. Department of Forestry and Life Science，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402168，China;2. Garden and
Flower Engineering Ｒesearch Center of Chongqing Colleges，Chongqing 402168，China)
Abstract Objective:Based on the system of regeneration，the genetic transformation system of Lonicera macranthoides was estab-
lished. Methods:Tissue culture method of seedlings，Agrobacterium tumefaciens mediated transformation method of explants，report gene
was detected by gus staining and PCＲ. Ｒesults:The efficient transformation time was 8 minutes of infection. The good transformation
rate was gained with the kanamycin 35 mg /L and cefotaxime 600 mg /L. The concentration of kanamycin had a leading effect on bud
differentiation between two antibiotics，and bud induction rate reached extremely significant difference. Ｒesults of gus staining and PCＲ
proved that the gus gene was integrated into Lonicera macranthoides genome. Conclusion:The genetic transformation system of Lonicera
macranthoides leaves mediated by Agrobacterium tumefaciens EHA105 was established for the first time.
Key words Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.;Agrobacterium tumefaciens;Genetic transformation;PCＲ
灰毡毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.
为忍冬科植物，其花(山银花)具清热解毒、疏散风
热之功效〔1〕。主要有效成分为绿原酸。目前对灰
毡毛忍冬的研究主要集中在化学成分、药用价值以
及资源开发〔2-5〕，其中各种药用成分是研究的重点。
忍冬主要依靠人工栽培来满足市场需要，但产量相
对较少，远不能满足市场及出口的需要。在其人工
栽培中，产量和品质尤其是绿原酸等其他重要的次
生代谢产物含量参差不齐的现象严重，制约了产业
的高效发展，培育高绿原酸含量的优良品种成为当
务之急。因此对灰毡毛忍冬遗传转化体系的研究就
显得尤为重要。笔者在建立灰毡毛忍冬叶片离体再
生体系的基础上，建立其高效的基因转化体系，以期
今后获得绿原酸或其他重要次生代谢产物合成相关
基因高效表达的植株，为进一步运用基因工程手段
进行灰毡毛忍冬分子育种及品种改良奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料 以灰毡毛忍冬“渝蕾 1 号”半木质化带
腋芽茎段为外植体建立无菌体系，茎段经无菌消毒
后接种在初代启动培养基(MB + 6-BA 0. 8 mg /L +
IBA 0. 1 mg /L)上诱导腋芽萌发;外植体腋芽伸长至
2 ～ 3 cm左右时转接到不同的继代培养基中(MB +
6-BA 0. 4 mg /L + IBA 0. 1 mg /L)大量增殖;选取生
长健壮、高度为 4 ～ 5 cm 的继代苗接种到不同的生
根培养基中(1 /3MB + IBA 3. 0 mg /L + IAA 0. 1 mg /
L + AC 100 mg /L)诱导生根。
取继代培养 5 ～ 7 w的无菌苗叶片，去基部在叶
背上平行划 2 至 3 处伤口，作为外植体，农杆菌处理
后接种在添加不同浓度卡那霉素(Kanamycin，Kan)
和头孢霉素(Cefotaxime，Cef)的筛选培养基上，筛选
·4091· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.12.006
基本分化培养基为 MB + 2，4-D 1. 5 mg /L + KT 1. 0
mg /L。
1. 2 农杆菌介导的转化 根癌农杆菌(Agrobacteri-
um tumefaciens)菌株为 EHA105，转化所用载体为
pCAMBIA2301，该质粒携带有卡那霉素抗性基因和
gus(编码 β-葡萄糖醛酸苷酶基因)，通过检测报告基
因 gus的表达来检测转化效率。载体质粒图见图 1。
图 1 载体 pCAMBIA2301 中的 T-DNA区域
将有划痕的叶片外植体接种于分化培养基上，
预培养 2 d。用浓度为 OD600 = 0. 4 的根癌农杆菌
EHA105 菌液［附加 100 μmol /L 的乙酰丁香酮
(AS)］侵染预培养后的外植体，以未侵染的外植体
为对照。
侵染时间为 4、8、12 min，侵染后用无菌滤纸将
外植体周围多余菌液吸干，叶正面朝下转接到分化
培养基上，黑暗条件下共培养 2 d。叶正面朝上转接
入添加有 15、25、35、45 mg /L Kan 和 300、600、900
mg /L Cef的筛选培养基上，每个处理 10 个外植体，
重复 3 次，25 ± 1 ℃，2 000 ～ 3 000 Lx 光强，每天光
照 12 h条件下培养 4 w，每 3 天转接一次，50 d左右
可获再生芽。
取转基因灰毡毛忍冬叶片进行 gus 染色，检测
gus基因在抗性植株中的表达，同时取未转化的植
株叶片为阴性对照。gus 基因表达的组织化学法检
测参照 Ｒueb等〔6〕的方法进行。
1. 3 转基因植株的分子检测 取抗性植株和非转
化植株的幼嫩叶片，采用 CTAB 法提取其基因组
DNA。以提取的基因组 DNA 为模板，检测 gus 基因
的引物序列〔7〕(上海生工):上游引物:P1:5-AC-
CTCTCTTTAGGCATTGGTTTC-3;下游引物:P2:5-
GCACACTGATACTCTTCACTCCAC-3。
PCＲ反应体系为 25 μL，反应条件:95 ℃变性 5
min;95 ℃变性 15 s，58 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 30 s，
35 个循环;72 ℃最终延伸 5 min。采用常规方法进
行 PCＲ扩增。
2 结果与分析
2. 1 侵染时间 用 OD600 = 0. 4 的根癌农杆菌
EHA105 菌液对外植体进行不同侵染时间处理的结
果如表 1 所示，在一定的时间范围内(4 ～ 8 min)，随
着侵染时间的延长，转化率呈上升趋势。但随着侵
染时间进一步延长至 12 min，外植体周围则附着过
多根癌农杆菌，造成外植体褐化死亡。侵染时间 8
min时，抗性芽诱导率最高，为 17. 2%。因此侵染时
间过短或过长，都会影响转化效率。
表 1 侵染时间对灰毡毛忍冬遗传转化的影响
侵染时
间 /min
外植体
总数
抗性芽
诱导率 /% 生长状况
4 360 5． 5 生长正常，叶片稍小
8 360 17． 2 生长正常，叶片稍小
12 360 0 生长受抑，周边褐化，逐渐死亡
2. 2 卡那霉素和头孢霉素对灰毡毛忍冬叶片筛选
压的确定 质粒载体 pCAMBIA2301 携带有卡那霉
素抗性基因，因此在筛选转基因植株时，需加入卡那
霉素(Kan)进行筛选。在进行遗传转化时，被根癌
农杆菌侵染携带 gus基因的外植体转接入分化培养
基时，要在筛选培养基中加入抑菌抗生素头孢霉素
(Cef)来抑制根癌农杆菌的滋生，保证外植体能正常
生长与分化。但同时抗生素均不利于外植体再生。
方差分析结果(表 2)表明，不同头孢霉素浓度对抗
性芽诱导率的影响差异不显著，而不同卡那霉素浓
度对抗性芽诱导率的影响存在极显著差异，因此，对
芽分化起主导作用的因素是卡那霉素浓度。卡那霉
素为 35 mg /L时，外植体还能保持相当的分化率，但
更高浓度的卡那霉素会导致外植体萎蔫或褐变死亡。
因此应尽量降低抗生素的影响，选择有效杀菌的适宜
浓度。由表 3可见，当卡那霉素 35 mg /L和头孢霉素
600 mg /L时抗性芽诱导率为 4. 1%。
2. 3 转化植株的 gus 染色 剪取转基因植株和对
照非转基因植株叶片经 gus 显色反应，37 ℃温育过
夜，70%乙醇脱色。由图 2 可见:转基因植株叶片可
以明显看到 gus酶与底物 X-gluc水解生成的蓝色物
质，而对照非转基因植株叶片没有任何蓝斑出现。
说明外源 gus基因已经稳定地整合进了灰毡毛忍冬
的基因组中，而且能在再生植株叶片中表达。
表 2 卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef)对灰毡毛忍冬抗性芽诱导率的方差分析
变异来源 df SS s2 F F0. 05 F0. 01
Cef浓度 2 33. 5 16. 75 3. 37 4. 26 8. 02
Kan浓度 3 189. 67 63. 2 12. 716＊＊ 4. 07 7. 59
误差 6 29. 83 4. 97
总变异 11 253
注:＊＊表示具极显著性差异
·5091·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
表 3 卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef)
对灰毡毛忍冬不定芽分化的影响
Cef浓度
/(mg /L)
Kan浓度
/(mg /L)
抗性芽诱导率
/%
300 15 5. 2
300 25 3. 1
300 35 1. 3
300 45 0
600 15 15. 3
600 25 6. 2
600 35 4. 1
600 45 0
900 15 11. 8
900 25 6. 2
900 35 2. 2
900 45 0
图 2 灰毡毛忍冬叶片 gus活性的组织化学检测
A、C. 转基因植株叶片的 gus 染色图 B、D. 对照植株叶片
的 gus染色图
2. 4 转基因植株的 PCＲ 检测 经根癌农杆菌
EHA105 转化筛选后，叶片上长出的抗性愈伤组织
进而分化得到转基因植株。结果(图 3)表明，同一
生长期的转基因植株因为培养基中添加了抗生素，
不管是从茎的粗度和叶片大小来说，植株长势明显
弱于非转基因植株，可见抗生素影响了外植体的分
化和生长。
图 3 灰毡毛忍冬愈伤分化苗
A. 对照愈伤分化苗 B．转基因愈伤分化苗
用 CTAB 法提取转基因灰毡毛忍冬植株的
DNA，进行 PCＲ 反应。用 gus 基因的引物进行扩
增，片段大小约 500 bp，PCＲ结果(图 4)证实 gus 基
因整合到了转基因灰毡毛忍冬基因组中。因此，gus
基因是优化灰毡毛忍冬高效遗传转化体系的理想报
告基因。
图 4 转基因灰毡毛忍冬植株 gus基因的 PCＲ检测
1．非转基因植株 2．质粒 pCAMBIA2301 3 ～ 12． 10 个转基
因株系 M. DL2000
3 讨论
高效率的再生及遗传转化体系是外源目的基因
整合到受体植株中的前提和基础。本研究中所采用
的以叶片为外植体的遗传转化过程具有再生速度
快，容易操作的优点，从侵染到分化出愈伤组织需 4
w左右，至抗性芽的出现需 5 ～ 7 w。但是由于抗生
素影响外植体的分化和生长，同一生长期的转基因
植株生长状态和非转基因植株相比有一定的差距。
不管是从茎的粗度和叶片大小来说，植株长势明显
弱于非转基因植株。
关于不同侵染时间对外植体转化效率的影响，
有许多不同的报道。侵染时间因不同植物体的不同
外植体而有所差异，从几分钟〔8〕到几十分钟〔9〕，但
侵染时间过短和过长均会影响转化率。至今灰毡毛
忍冬的遗传转化体系研究尚未见报道，本研究发现，
侵染时间为 8 min 时，抗性芽再生率最高，但随着侵
染时间的延长，转化率呈下降的趋势，这类似于在其
他植物上的研究结果。可能是侵染时间过长会使得
农杆菌生长过度，外植体因吸收不到养分而褐化死
亡〔10〕。
对转化后的再生植株的筛选鉴定是遗传转化的
重要组成部分。而后期的筛选鉴定一般至少利用两
种以上抗生素来达到筛选转基因植株的目的。一种
是载体上的抗性标记，另一种通常是头孢霉素或羧
苄青霉素。而抗生素对不定芽再生起抑制作用，即
使低浓度也强烈抑制转化植株不定芽的分化〔8〕。
本研究发现培养基中添加了抗生素的转基因植株长
势明显弱于非转基因植株，和已有的遗传转化研究
报道一致。同时研究发现两种抗生素对芽分化起主
导影响作用的因素是卡那霉素浓度，其不同的浓度
·6091· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月
间抗生芽诱导率达到了极显著差异。
虽然目的基因中一般含有筛选标记，例如卡那
霉素基因 nptⅡ，但有些植物对此并不敏感，需要进
一步借助于报告基因 gus 等验证〔10〕。本研究除了
在培养基中添加卡那霉素进行转基因植株筛选外，
亦利用报告基因 gus 进行了进一步的 PCＲ 鉴定。
鉴定结果表明，gus 基因整合到了转基因灰毡毛忍
冬基因组中。因此，gus 基因是优化灰毡毛忍冬高
效遗传转化体系的理想报告基因。本研究仅对转化
材料进行了 gus 染色和 PCＲ 鉴定，还需进一步验证
转化的稳定性，后续的鉴定工作还在进行。
参 考 文 献
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收稿日期:2013-04-12
基金项目:国家科技支撑计划(2011BAI05B02)子项目(2011BAI05B0220)
作者简介:漆琚涛(1968-)，男，高级农艺师，主要从事农业试验研究与示范推广工作;Tel:15193484218，E-mail:qijutao@ 126. com。
* 通讯作者:马占川，Tel:13993224132。
栽培模式对当归产量及构成因素的影响
漆琚涛1，许彩荷2，马占川1* ，王万胜1，李应东3，蔺海明4，晋 玲3
(1. 甘肃省漳县农技站，甘肃 漳县 748300;2. 甘肃省漳县园艺站，甘肃 漳县 748300;3. 甘肃省中医学院，
甘肃 兰州 730000;4. 甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070)
摘要 目的:研究栽培模式对当归根重及出苗率、抽薹率、水浸病死率和产量的影响。方法:以白膜半覆、白膜
全覆、黑膜半覆、黑膜全覆、膜侧栽培和双垄沟栽 6 种不同栽培模式与垄作比较，分析栽培模式对当归出苗率、抽薹
率、水浸病死率、小区收获株数、单株鲜重和小区产量的影响。结果:白膜半覆当归产量最高，较对照垄作增产
35. 62%;黑膜半覆次之，较对照增产 28. 88%;黑膜全覆第三，较对照增产 28. 76%;白膜全覆第四，较对照增产
16. 18%;膜侧栽培增产作用不显著;双垄沟栽产量最低。结论:在当归生产中应大力推广白膜半覆和黑膜半覆栽
培技术。
关键词 当归;栽培模式;成药生产期;产量
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)12-1907-04
当归 Angelica sinensis(Oliv. )Diels 是伞形科多
年生草本植物，其根是重要的大宗常用中药材，有补
血、活血、调经、润燥滑肠之功效。当归的栽培生产
中，第一年为育苗期、第二年为成药生产期、第三年
为育籽期〔1〕。甘肃漳县与“中国当归之乡”岷县接
壤，是“岷归”的原产地和主产区，境内自然气候资
源丰富，土壤肥沃，高寒阴湿的凉爽气候非常适宜当
归生长，所产当归产量高品质好，深受中外客商青
睐〔2〕。通过开展不同当归栽培模式试验研究，探索
栽培模式对当归成药生产期的影响，为规范化栽培
提供理论和技术依据。
1 材料与方法
1. 1 试验地概况 试验地位于甘肃省漳县大草滩
乡三友村(北纬 34. 75814°，东经 104. 20488°)，海拔
·7091·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 12 期 2013 年 12 月