全 文 ：果 树 学 报 2012，29（4）: 544~549
Journal of Fruit Science
根癌农杆菌介导的 CG1-400-RNase基因
转化创制锦橙转基因再生植株
谭 彬 1，2，李鼎立 1，徐世晓 1，郭文武 1*
（1园艺植物生物学教育部重点实验室·华中农业大学，武汉 430070； 2河南农业大学园艺学院，郑州 450002）
摘 要: 【目的】为了快速有效地利用基因工程的方法获得柑橘无核新种质，【方法】以我国特色多核柑橘优良品种锦
橙实生苗上胚轴切段为外植体，采用根癌农杆菌介导法进行能导致种子败育基因 CG1-400-RNase 的转化；为快速
有效地筛选出转化子，在实生苗上胚轴切段转化再生过程中，根据不同发育阶段的组织或器官对抗生素的敏感程度
不同采用不同的选择压。 【结果】结果表明，在抗性芽再生过程中卡那霉素质量浓度设定为 50 mg·L-1，获得的 362 个
抗性芽转入卡那霉素质量浓度为 100 mg·L-1的伸长培养基中进行伸长培养后，进行早期 PCR 检测，获得 28 个阳性
芽；经过不定芽诱导生根或试管嫁接，获得 22 株完整植株。 【结论】再生植株经 PCR 和 Southern 杂交检测，获得 2 株
目的基因以单拷贝的形式插入锦橙基因组的转基因植株， 为最终获得具有无核性状且可稳定遗传的柑橘新种质奠
定了基础。
关键词: 柑橘； 根癌农杆菌； CG1-400-RNase 基因
中图分类号：S666．4 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)04－0544－06
Creation of transgenic plants in Jincheng orange (Citrus sinensis) with
CG1-400-RNase gene by Agrobacterium-mediated transformation
TAN Bin1，2， LI Ding-li1， XU Shi-xiao1， GUO Wen-wu1*
（1Key Laboratory of Horticultural Plant Biology Affiliate to Ministry of Education·Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070
China； 2College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002 China)
Abstract：【Objective】 The objective of the study was to quickly and effectively obtain the citrus cultivars
with seedless trait by using genetic engineering. Chimeric ribonuclease gene （Barnase） driven by seed-
specific promoter （CG1-400） for reducing seed number， was introduced into ‘Jincheng’ orange， an im-
portant commercial and seeded citrus variety in China， 【Method】 by Agrobacterium-mediated transfor-
mation and using epicotyl segments as explants. 【Result】 To screen the tansformants effectively， different
concentration of kanamycin was used at different developmental stages since the sensitivities of different
tissues and organs to kanamycin were different. The results showed that 362 resistant shoots were obtained
when 50 mg·L-1 Kan was added into the shoot-induction medium， 28 of which were PCR-positive buds
after those were cultivated on the shoot -elongation medium with 100 mg·L -1 Kan. Later twenty two
plantlets were obtained by inducing to root or grafting in vitro. 【Conclusion】 PCR and Southern blot analy-
sis showed that single copy of CG1-400-RNase gene was integrated into two transgenic plants. The study
will facilitate the breeding of transgenic citrus lines with seedless trait.
Key words： Citrus； Agrobacterium； CG1-400-RNase gene
柑橘是一种重要的亚热带常绿果树， 为世界第
一大水果，第 3大贸易农产品。随着经济的发展和人
们生活水平的提高， 市场对柑橘果实的品质提出了
新的要求。 近 30年来，世界鲜食柑橘品种的改良主
要围绕下列育种目标进行:无核、易剥皮、风味浓和
有香味[1]。其中柑橘的无核性状是一个对于鲜食和加
收稿日期： 2012－05－04 接受日期: 2012－05－28
基金项目： 国家 863 计划（2011AA100205），国家自然科学基金项目（31125024）
作者简介： 谭彬，女，讲师，博士，主要从事果树生物技术与遗传育种研究。 E-mail: hntanbin@yahoo.com.cn
觹 通讯作者 Author for correspondence． E-mail: guoww@mail.hzau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.04.012
图 1 质粒 pCG1-400-RNase 构建
Fig. 1 Construction of plasmid pCG1-400-RNase
工都具有重要意义的优良经济性状， 世界各国的育
种工作者都将果实无核列为一项重要的育种目标，
而世界推广范围较广的柑橘品种几乎都为无核品
种。 无核果实以其品质好、风味浓、产量相对稳定和
保鲜贮藏期更长而备受人们的青睐。
运用传统的育种手段进行果实品质改良由于受
到柑橘复杂的生物学特性尤其是童期长的影响而进
展缓慢。随着植物基因工程的发展，近年来人们开始
探索利用转基因技术培育无核柑橘新品种的方法。
诱导无核果实形成的一个分子手段是利用切除策略
即将细胞毒素基因与组织特异性表达启动子融合，
转入植物后，使其在特定组织（种子等）中表达，达到
去除种子的目的。 切除策略已经成功运用于阻止花
粉形成和杂种制种中不育系的生产[2-5]。 这种切除基
因为淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefciens 中的
RNA酶基因（Barnase）。其中的启动子是切除策略的
关键，它不仅要在特定的组织中表达，而且其表达必
须发生在种子发育的早期以抑制种子的形成或使种
子明显变小。 Koltunow等 [6-7] 将种子特异性启动子
CG1 与从豌豆球蛋白基因启动子中获得的 400 bp
序列拼接后构建成嵌合基因 CG1-400-RNase 转入
拟南芥， 获得种子数量明显减少的拟南芥转基因植
株；随后又以西印度莱檬（Citrus aurantifolia Swing.）
上胚轴为外植体转化 CG1-400-RNase 基因，成功获
得种子数量明显减少的果实， 且果实大小及可溶性
固形物含量与对照相比没有明显变化[8]。将此基因转
入其他品质优良但多子的柑橘品种， 可以获得保留
其原有优良品质且种子数明显减少的少核或无核新
品种，从而提高其商品价值。 基于此，我们以我国地
方特色优良品种锦橙（C. sinensis Osbeck.）为试验材
料，以实生苗上胚轴切段为外植体，利用根癌农杆菌
介导的遗传转化方法将 CG1-400-RNase 基因转入
锦橙，以期获得无核的柑橘新种质。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 以锦橙实生苗上胚轴切段为外植
体进行转化研究，以粗柠檬（C. jambhiri Lush）作为
试管嫁接的砧木，2 种材料均采自华中农业大学柑
橘种质资源圃。
1.1.2 菌株和载体 研究使用的农杆菌菌株为
LBA4404。 质粒载体为 pCG1-400-RNase（澳大利亚
CSIRO 的 Koltunow 博士惠赠 ），Barnase 基因位于
CG1-400 启动子与 nos 终止子下，NPT II 基因位于
nos启动子和 nos终止子之间（图 1）。
1.2 方法
1.2.1 外植体的获得 从新鲜的柑橘果实中取出种
子，自来水将种子冲洗干净后，1 mol·L-1 NaOH 中浸
泡 15 min 去除果胶后流水冲洗干净；超净台上将种
子放入次氯酸钠溶液 （有效氯浓度为 3%） 浸泡 15
min（中间摇动 2~3 次）后，无菌蒸馏水清洗 3 次，每
次 5 min；将消毒后的种子在超净台上用无菌手术刀
和镊子剥去内外种皮后接种于装有固体 MT 培养基
的试管，暗培养 35 d 后，切取实生苗上胚轴切段用
于遗传转化，切取方式采用斜切。
1.2.2 农杆菌工程菌液的制备 从超低温冰箱中取
出含有目标质粒的菌液在含 50 mg·L-1 卡那霉素
（Kanamycin，Kan） 和 20 mg·L-1利福平（Rifampicin，
Rif）的固体 LB培养基上划线，28 ℃暗培养 2 d；挑取
单克隆于新的固体 LB培养基 （50 mg·L-1 Kan 和 20
mg·L-1 Rif）上划线，28 ℃暗培养 2 d；用手术刀片刮
取所有菌体于 MT 液体培养基中，180 r·min-1，28 ℃
振荡培养 1.5~2 h 备用（测定菌液浓度，将其调整至
OD600在 0.6~0.8）。
1.2.3 外植体的转化与再生 侵染与共培养:将外植
体浸泡在预先制备好的农杆菌菌液中， 静置 20 min
侵染，侵染完毕用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，
转入共培养培养基 [MT+1.0 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1
KT+0.1 mg·L-1 NAA+20 mg·L-1 乙酰丁香酮 （Ace-
tosyringone，AS）]21℃共培养 3 d。
筛选培养及植株再生: 将共培养后的上胚轴切
段在加有 400 mg·L-1头孢霉素 （Cefotaxime，Cef）的
无菌水中浸泡 5 min，无菌蒸馏水清洗 3 次，用无菌
滤纸吸干表面水分后将锦橙上胚轴切段转入筛选培
养基 （MT+1.0 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1
NAA+400 mg·L-1 Cef+50 mg·L-1 Kan），（26±2） ℃暗
培养 7 d 后转入光/暗培养。 待再生出抗性芽后，将
抗性芽切下转入伸长培养基 （MT+0.1 mg·L-1 BA+
0.1 mg·L-1 IAA+0.25 mg·L-1 GA3+200 mg·L-1 Cef+
100 mg·L-1 Kan）进行伸长培养；当抗性芽>1 cm 时，
将其转入生根培养基诱导生根 [9]或进行试管嫁接 [10]
获得完整植株。
谭 彬等: 根癌农杆菌介导的 CG1-400-RNase 基因转化创制锦橙转基因再生植株
CG1400Barnaseter
LB NcoIEcoRI
NPTIIter
RB
nos
4 期 545
果 树 学 报 29 卷
表 1 锦橙上胚轴切段转化再生植株的 PCR 检测
Table 1 PCR analysis of plants regenerated from epicotyl segments of Jincheng
自根苗及试管嫁接苗移栽:将根长 2~3 cm 的自
根苗和生长健壮的嫁接苗从试管中取出， 洗净根部
的培养基， 并移栽至盛有灭菌的腐殖质土的小塑料
杯（有孔塑料杯，透水保湿），转入温室进行保护培
养，大约 1 个月后，将盖子去掉，炼苗 14~21 d（其间
每隔 5 d浇 1/10的大量元素 1次），视小苗生长情况
将其移栽至大盆。
抗性芽再生率（%）=（产生抗性芽的外植体数/
外植体总数）×100
抗性芽阳性率（%）=（抗性芽阳性数 / 抗性芽总
数）×100
转化率（%）=（抗性芽阳性数/外植体总数）×100
1.2.4 PCR 检测 分别选取抗性芽、转基因小植株
和转基因温室植株，并以非转基因植株为对照，采用
CTAB 小量法提取植物基因组 DNA， 分别对 NPTII
基因和 CG1-400-RNase基因进行 PCR扩增。 NPTII
上游引物 GATACCGTAAAGCACGAGGAA， 下游引
物 GGCTATGACTGGGCACAACA， 预期扩增产物大
小为 678 bp 为小扩增；CG1-400-RNase 上游引物
TTCACCAACTCAACCCATCA， 下游引物 CGGTCT-
GAATTTCTGAAGCC，预期扩增产物 800 bp。 反应体
系 20 μL，反应参数参照 Tan等[11]方法。 扩增产物用
1.0%的琼脂糖凝胶电泳，0.5 mg·L-1的溴化乙锭溶液
染色后在凝胶成像系统检测并拍照。
1.2.5 Southern-blot 检测 随机取 2 株目的基因
PCR 检测呈阳性的温室植株与未转基因植株叶片
分别提取 DNA， 取 15 μg DNA用 NcoI 进行酶切 12
h，酶切产物转移至尼龙膜上。以放射性同位素 32P标
记的 CG1-400-RNase 基因扩增的 PCR 产物为探针
（800 bp），与转好的膜于 65 ℃杂交 16 h，进行洗膜、
曝光和放射自显影。
2 结果与分析
2.1 锦橙实生苗上胚轴切段的转化再生与早期
PCR检测
将 710个经过侵染的锦橙实生苗上胚轴切段转
入含 50 mg·L-1 Kan 的筛选培养基进行光 /暗培养，
约 21 d产生不定芽（图版-A），而未转化上胚轴切段
在筛选培养 10 d左右即产生不定芽；经过 2~3次筛选
培养 ， 共获得 362 个抗性芽 ， 抗性芽再生率为
50.99%。 将获得的抗性芽转入伸长培养基进行抗性
芽伸长培养， 此时培养基中 Kan 质量浓度调整为
100 mg·L-1，待抗性不定生长状态较好，长出 2~3 片
叶子时， 利用 CG1-400-RNase 基因特异性引物对
362 个抗性芽进行初次 PCR 检测， 共获得 28 个阳
性芽，抗性芽阳性率为 7.73%，转化率为 3.94%。 根
据抗性芽本身生长状态对经初次 PCR 检测呈阳性
的 28个抗性芽分别进行诱导生根和试管嫁接，其中
22 个>1.0 cm 的抗性芽转入生根培养基进行不定根
诱导（图版-B），不定根诱导培养基中 Kan 的质量浓
度调整为 20 mg·L-1， 不定根生根率为 54.5%；6 个<
1.0 cm 的不定芽进行试管嫁接 ， 嫁接成活率为
66.67%。 将诱导生根和嫁接成功所获得的 16 株转
基因植株转入温室 14 d 后， 部分植株生长势较差，
叶片变黄最终死亡。其他 10株诱导生根植株和 1株
嫁接所得植株生长正常， 与未转化对照相比没有明
显差异； 同时观察发现由不定芽嫁接至粗柠檬砧木
获得的转基因植株， 其生长势明显优于诱导生根所
获得的转基因植株（图版- C）。
2.2 再生植株生长不同阶段 PCR检测
对转入温室 14 d 后的 11 株转基因植株进行 2
次 PCR 检测， 利用 CG1-400-RNase 基因特异性引
物，以质粒 DNA 为阳性对照，未转化植株为阴性对
照，检测结果显示 11株转基因植株均扩增出与质粒
阳性对照相同大小的产物， 未转化植株中没有扩增
出特异性条带（表 1）。 在进行分子杂交前再次对移
入温室 6 个月的 11 株转基因植株分别以 CG1-
400-RNase 基因和 NPTII 基因特异性引物进行 PCR
检测， 与 2 次 PCR 结果相比，7 株转基因植株（J1，
J2，J4，J6，J7，J8和 J10）均扩增出目标片段（图 2），而
PCR检测
PCR analysis
基因
Gene
转基因植株 Transgenic plants
J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 C
初次 PCR
First PCR
2 次 PCR
Second PCR
3 次 PCR
Third PCR
CG1-400-RNase
CG1-400-RNase
CG1-400-RNase
NPTII
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
－
－
+
+
+
+
+
+
－
－
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
－
－
+
+
+
+
+
+
－
+
－
－
－
－
注: “+”表示 PCR检测呈阳性； “－”表示 PCR检测呈阴性
Note: “+” indicates PCR-positive；“－” indicates PCR-negative
546
4 期
图 3 锦橙转 CG1-400-RNase 基因的 Southern blot 检测
J2 和 J7. 不同的转基因植株； C. 未转化再生植株； M. λ/HindIII 分
子量标记
Fig. 3 Southern blot analysis of CG1-400-RNase transgenic
plants of Jincheng
J2 and J7. Different transgenic plants； C. Non-transformed plant； M.
λ/HindIII molecular mass marker
图 2 锦橙转 CG1-400-RNase 基因的 PCR 检测
J1， J2， J4， J6， J7, J8， J10. 不同的转基因植株； C. 未转化再生小
苗；P. 质粒 DNA；M. 100 bp DNA 分子量标记
Fig. 2 PCR analysis of CG1-400-RNase transgenic plants
of Jincheng
J1， J2， J4， J6， J7，J8， J10. Different transgenic plantlets； C. Non-
transformed plantlet； P. Plasmid DNA； M. 100 bp DNA ladder
4 株转基因植株（J3，J5，J9，J11）未扩增出目标片段
（表 1）， 同时转基因植株 J11 的目的基因和选择标
记基因出现分离（表 1）。 分析产生这种现象的原因
可能是:第 2 次 PCR 检测所选用的材料为移入温室
14 d的小植株， 材料表面可能附着含有目的基因质
粒的 DNA 而导致 PCR 假阳性的产生；此外，由于不
定芽的产生起源于多细胞， 形成的再生植株有可能
是嵌合体，2 次 PCR 检测取样部位不同也可能导致
检测结果不一致。
2.3 转基因植株的 Southern-blot 检测
7 株经第 3 次 PCR 检测呈阳性的转基因植株
移入温室 6个月后，为进一步验证外源基因是否整合
进柑橘基因组，挑选生长比较旺盛的 2株温室转基因
植株（J2和 J7），用 NcoI对 2株转化植株和对照未转
化植株进行酶切转膜，以 CG1-400-RNase 基因 PCR
产物为探针进行杂交。结果显示 2株经 3次 PCR检
测均为阳性的转基因植株 J2 和 J7 均有杂交信号，
由于 NcoI在 T-DNA 区中只有一个酶切位点， 推测
2 株转基因植株中的外源基因为单拷贝不同位点插
入，表明外源基因已成功整合入柑橘基因组（图 3）。
3 讨 论
我国柑橘品种资源丰富，良种很多，但栽培的地
方特色品种多数有核甚至多核， 因而影响了其商品
价值和在国际市场上的竞争力。 随着‘基因热’的兴
起， 转基因技术已广泛应用于柑橘砧木育种和接穗
育种，其技术体系已臻于成熟。但转基因技术在柑橘
果实品质改良尤其是无核育种方面的应用较少，到
目前为止尚未有品种和品系育成。 前人研究表明切
除基因（CG1-400-RNase）转入柑橘可以获得种子数
量明显减少甚至完全无核的果实， 且果实的品质没
有明显变化[8]。 因此，将这类基因转入生产上主栽的
一些多核柑橘品种， 对于培育少核或无核的柑橘材
料具有非常重要的意义。此外，利用转基因技术进行
柑橘品种的无核化改良， 一方面克服了传统育种进
程缓慢且获得的无核果实通常伴有品质低、 果形小
等不良性状的缺点， 另一方面也避免了因采用化学
激素处理诱导无核果实而造成的药剂残留对健康以
及自然环境的危害。 本研究以我国特色多核柑橘品
种锦橙上胚轴切段为外植体转化能导致种子败育的
基因 CG1-400-RNase，获得遗传转化植株，有望最
终获得具有无核性状且可稳定遗传的柑橘新种质。
本研究采用锦橙实生苗上胚轴切段为外植体进
行遗传转化，由于不定芽再生常起源于多细胞，因此
形成的再生植株常出现较多的嵌合体和逃逸体；而
本研究中所转基因 CG1-400-RNase 的 T-DNA 区
没有报告基因的存在， 故本研究中筛选剂的使用时
间和浓度以及早期的 PCR 检测对于有效抑制逃逸
体的再生、 快速筛选出转化体和减少工作量具有重
要意义。 在筛选剂的使用时间和浓度中，段艳欣等[12]
提出了适于柑橘胚性愈伤组织遗传转化的 “5 步筛
选再生法”， 本研究所用外植体为实生苗上胚轴切
段，故在“5 步筛选再生法”的基础上略作修改:初次
筛选培养过程中 Kan 的质量浓度设定为 50 mg·L-1，
筛选早期过高的 Kan 质量浓度对不定芽的再生具
有一定的抑制作用， 抗性不定芽在初次筛选后期陆
续产生； 经过 2~3次筛选培养产生的所有不定芽转
入伸长培养基进行伸长培养，此时将 Kan 的质量浓
度调整为 100 mg·L-1， 高浓度的 Kan 可以有效降低
逃逸体的发生； 待抗性不定芽生长状态较好， 长出
2~3 片叶子时，选取 1 片叶子进行初步 PCR 检测是
一个至关重要的环节， 可以初步鉴定转化体和逃逸
体，减少后期工作量；对于关键的再生步骤，Kan 的
存在可以有效筛选转化体和非转化体， 前人研究 [13]
谭 彬等: 根癌农杆菌介导的 CG1-400-RNase 基因转化创制锦橙转基因再生植株
800 bp
M P C H2O J1 J2 J4 J6 J7 J8 J10
23.1
9.4
6.5
4.4
2.3
2.0
kb
M C J2 J7
547
果 树 学 报 29 卷
表明不定根对于低浓度的 Kan 非常敏感，故在诱导
不定根的过程中添加 20 mg·L-1的 Kan 对其进行再
次筛选。Dominguez等[14]研究不同筛选条件下转基因
沉默发生的频率和机制， 发现在无选择标记基因和
报告基因存在的条件下，超过 30%的转基因株系发
生转基因沉默， 即不经过抗生素的筛选容易导致转
化率低且伴随转基因沉默。 为了防止转基因沉默的
产生和提高转化率， 本实验在转化再生的不同步骤
添加适当质量浓度的 Kan， 尤其是在关键的再生步
骤使用 Kan，同时结合早期的 PCR 检测，可以有效
获得转化体。
本研究分别在锦橙抗性芽伸长培养、 再生植株
移入温室 14 d 和 6 个月后进行 PCR 检测， 结果表
明前 2 次 PCR 检测结果呈阳性的部分植株在第 3
次 PCR 检测中呈阴性。 Oliveira 等 [15]在施文格甜橙
[C. paradise Macf. X P. trifoliata （L.） Raf.]转化中也发
现经过 GUS 染色呈阳性的 2 株转基因植株在
Southern blot 中未检测到阳性信号 （Oliveira et al.，
2009）；Charity 等 [16]在辐射松（Pinus radiata）的转化
中也发现类似现象， 对以合子胚为外植体进行转化
获得的转化体的子叶进行 PCR 检测呈阳性， 而经
Southern blot检测未检测到阳性信号。分析产生这种
现象的原因， 可能是由于上胚轴转化所产生的转化
体起源于多细胞， 形成的转化体可能是转化细胞与
非转化细胞的嵌合体； 随着转基因植株在温室生长
时间的增长以及其生长状态的变化， 外源基因状态
不稳定， 可能会出现基因丢失。 同时也说明单独的
GUS 染色或 PCR 检测不是确定外源基因整合进植
物基因组的可靠方法， 而 Southern blot 是鉴定外源
基因整合进植物基因组的最有效和最可靠的方法。
4 结 论
锦橙是我国地方特色多核柑橘品种， 以该资源
实生苗上胚轴切段为外植体， 将能导致种子败育的
基因 CG1-400-RNase转入锦橙。在转化再生过程的
不同阶段采用适宜的 Kan 筛选浓度并结合 PCR 检
测，获得了 7 株 PCR 检测呈阳性的转基因植株。 经
Southern 杂交检测， 获得 2 株目的基因以单拷贝形
式插入柑橘基因组的转基因植株， 为最终获得柑橘
无核新种质奠定了基础。
参考文献 References:
[1] DENG Xiu-xin. Advances in worldwide citrus breeding[J]. Acta Hor-
ticulturae Sinica， 2005， 32（6）: 1140-1146.
邓秀新 ．世界柑橘品种改良的进展 [J]．园艺学报 ，2005，32（6）:
1140-1146．
[2] MARIANI C， GOSSELE V， DE BEUCKELEER M， DE BLOCK M，
GOLDBERG R B， DE GREEF W， LEEMANS J. A chimaeric ri-
bonuclease-inhibitor gene restores fertility to male sterile plants[J].
Nature， 1992， 357: 384-387.
[3] DENIS M R， DELOURME R， GOURRET J-P， MARIANI C， RE-
NARD M. Expression of engineered male sterility in Brassica napus
[J]. Plant Physiology， 1993， 101: 1295-1304.
[4] REYNAERTS A， VAN DE WIELE H， DE SUTTER G， JANSSENS
J. Engineered genes for fertility control and their application in hy-
brid seed production[J]. Scientia Horticulturae， 1993， 55: 125-139.
[5] GOLDMAN M H S， GOLDBERG R B， MARIANI C. Female sterile
tobacco plants are produced by stigma-specific cell ablation[J]. EM-
BO J， 1994， 13: 2976-2984.
[6] KOLTUNOW A M， BRENNAN P， BARKER S J. Evaluation of
genes to reduce seed size in Arabidopsis and tobacco and their ap-
plication to Citrus[J]. Molecular Breeding， 1998， 4: 235-251.
[7] KOLTUNOW A M， BRENNAN P. Paternal transmission of a seed
size reduction gene varies with age of a primary transformant and
seed set is also influenced by gene expression in maternal tissues[J].
Molecular Breeding， 1998， 4: 253-261.
[8] KOLTUNOW A M， BRENNAN P， PROTOPSALTIS S， NITO N.
Regeneration of west indian limes （Citrus aurantifolia） containing
genes for decreased seed set[J]. Acta Horticulturae（ISHS），2000， 535:
81-91.
[9] GUO W W， CHENG Y J，DENG X X. Regeneration and molecular
characterization of intergenetic somatic hybrids between Citrus retic-
ulate and Poncirus trifoliata [J]. Plant Cell Reports， 2002， 20: 829-
834.
[10] DENG X X， XIAO S Y， ZHANG W C. Interspecific somatic hybrid
of Ichang Papeda with Valencia orange[J]. Chinese Journal of Biotech-
nology， 1993， 9: 128-131.
[11] TAN B， LI D L， XU S X， FAN G E， FAN J， GUO W W. Highly ef-
ficient transformation of the GFP and MAC12.2 genes into preco-
cious trifoliate orange [Poncirus trifoliata (L.) Raf]， a potential model
genotype for functional genomics studies in Citrus [J]. Tree Genet-
ics & Genomes， 2009， 5（3）: 529-537.
[12] DUAN Yan-xin， FAN Jing， LI Ding-li， GUO Wen-wu. Screening
and regeneration of the transgenic embryogenic calli in Citrus [J].
Journal of Huazhong Agricultural University，2008，27（6）: 768-771.
段艳欣，范净，李鼎立，郭文武． 柑橘转基因胚性愈伤组织的筛选
与再生[J]． 华中农业大学学报，2008，27（6）: 768-771．
[13] CHABAUD M，LARSONNEAU C，MARMOUGET C，HUGUET T.
Transformation of barrel medic （Medicago truncatula Gaertn.） by A-
grobacterium tumefaciens and regeneration via somatic embryogene-
sis of transgenic plants with the MtENOD12 nodulin promoter fused
to the gus reporter gene [J]. Plant Cell Reports， 1996， 15: 305 -
310.
[14] DOMINGUEZ A，FAGOAGA C，NAVARRO L，MORENO P， PE譙A
L. Regeneration of transgenic citrus plants under non selective con-
ditions results in high -frequency recovery of plants with silenced
transgenes[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2002， 267: 544-
556.
[15] OLIVEIRA M L P， FEBRES V J， COSTA M G C， MOORE G A， O-
548
4 期
图 版 说 明
A. 抗性芽再生； B. 再生芽诱导生根； C. 转基因植株（左: 嫁接获得；右: 诱导生根获得）
Explanation of plates
A. Regeneration of resistant shoots； B. Root induction； C. Transgenic plants （left: grafting in vitro； right: self-rooted）
谭 彬等: 根癌农杆菌介导的 CG1-400-RNase 基因转化创制锦橙转基因再生植株
TONI W C. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation
of citrus via sonication and vacuum infiltration[J]. Plant Cell Re -
ports， 2009， 28: 387-395.
[16] CHARITY J A，HOLLAND L，DONALDSON S S，GRACE L，WAL-
TER C. Agrobacterium -mediated transformation of Pinus radiata
organogenic tissue using vacuum-infiltration[J]. Plant Cell Tissue
and Organ Culture， 2002， 70: 51-60.
549