全 文 ：文章编号:0490-6756(2004)02-0409-04
盐生杜氏藻 Ugd基因的 cDNA克隆及序列分析
李音 ,乔代蓉 ,易弋 ,贺庆华 ,李良 ,孙辉 ,曹毅＊
(四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘要:作者对不同物种 Ugd基因的同源序列进行相似性分析后设计一对兼并引物 ,利用 RT-
PCR技术获得一条 200bp左右的片段 ,测序分析显示其同芋头(Colocasia esculenta)的 Ugd 基
因的编码区有 71.7%的相似性.然后再以此片段为模板设计引物 ,通过 RACE 技术获得盐生
杜氏藻 Ugd基因的全长序列.经克隆测序作blastx分析发现其同芋头(Colocasia esculenta)、大
豆(Soybean)、水稻(Oryza sat iva)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 Ugd基因有 78%到 81%
的同源性.
关键词:同源克隆;兼并引物;Ugd;RACE
中图分类号:Q78　　　文献标识码:A
植物细胞壁主要是由多聚糖构成的复杂的网络结构 ,它给细胞提供机械的支撑作用 ,对整株植物来
说 ,细胞壁的功能还包括细胞间识别 、防御 、防御反应 、维持一个适宜的细胞环境[ 1～ 3] .生长的植物细胞有
一个显著特征是细胞壁前体的不断合成 ,维持细胞壁的不断加厚和完整.双子叶植物的细胞壁大约由
30%的纤维素和 60%的多聚糖(半纤维素和胶质)组成 ,这些多聚糖的各种前体都是由不同的单糖在高尔
基体里合成的[ 4] .这些前体的合成是以核苷二磷酸核糖为底物的 ,特别是尿苷二磷酸核糖.而这些尿苷二
磷酸核糖几乎都有一个共同的前体:尿苷二磷酸(UDP)葡萄糖醛酸.许多生化研究表明 UDP 葡萄糖醛酸
的合成是细胞壁生长的关键限速反应[ 5 , 6] .UDP 葡萄糖脱氢酶催化 UDP 葡萄糖※UDP 葡萄糖醛酸这个
反应 ,但该酶和接下来几步反应的酶相比 ,它的活性很低[ 7 ,8] .UDP 葡萄糖脱氢酶由 Ugd 基因编码 , Ugd
基因最早是在大豆里得到克隆[ 9] .Ugd基因在植物物种之间的保守性很高 ,和牛的 Ugd基因也有 70%的
相似性[ 10] .研究 Ugd 基因对研究植物的生长发育和提高植物抗外界胁迫有很重要的意义.杜氏藻
(Dunaliel la.)是一种单细胞真核绿藻 ,属于真绿藻纲 、团藻目 、杜氏藻科[ 11] .它广泛分布于世界各地的盐
湖和海洋 ,可在 0.1 ～ 5.5 mol/L 的 NaCl溶液生存[ 12 ,13] .杜氏藻是研究植物耐盐机理的一个好的模式物
种.本实验的目的是想把盐生杜氏藻的 Ugd基因的 cDNA进行全长克隆 ,为下一步将该基因转入农作物 ,
分析它在逆境下和正常环境下的表达差异 ,看其是否能够提高农作物的抗逆性奠定基础.
1 材料与方法
1.1　材料
盐生杜氏藻采用 D .Sal ina ,大肠杆菌 JM 109 、T/A克隆载体购自 Takara公司 , 5 -RACE 试剂盒和反
转录酶购自Clontech公司 , 3-RACE试剂盒 、Taq酶和 DNA M arker购自 Takara公司 ,胶回收试剂盒购自
华舜公司 , Trizol试剂购自 Invit rogen公司 ,引物合成和测序由上海生物工程公司完成.
收稿日期:2003-10-29
基金项目:国家 863 项目(2002AA213021);国家自然科学基金(30270711)
作者简介:李音(1977-), 女 , 2001 级硕士研究生.
＊通讯作者
2004年 4月
第 41卷第 2期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Universi ty (Natural Science Edition)
Apr.2004
Vol.41　No.2
1.2 方法
1.2.1　盐生杜氏藻培养 按 10%接种量接种 ,在(28±1)℃和 16h 光照 、8h暗室的环境中培养.培养液成
分参照文[ 14 ,15]的方法配制.
1.2.2　盐生杜氏藻总 RNA 的提取　离心收集培养至生长期的盐生杜氏藻细胞 ,加入 1mLTrizol试剂 ,按
照使用说明操作来分离总 RNA ,并增加用乙酸铵/乙醇来沉淀总 RNA.
1.2.3　盐生杜氏藻 Ugd基因部分 cDNA片段的克隆　取盐生杜氏藻总 RNA进行反转录 ,反转录体系各
组分按反转录酶的使用说明添加 ,反转录条件为 72℃水浴 2min ,冰上急冷 2min , 42℃反应 1.2h.反转录后
对其进行 PCR分析 ,PCR引物为兼并引物 ,PCR体系各组分按 Taq酶的使用说明添加 , PCR条件为 94℃
预变性 1min , 94℃变性 30s , 55℃退火 50s , 72℃延伸 2min , 35 个循环.PCR反应液经 1%琼脂糖(0.5×
TBE)凝胶电泳分离 ,用胶回收试剂盒回收目的片段 ,回收的目的片段用 T/A克隆载体进行连接转化大肠
杆菌 JM 109 ,挑选阳性克隆子测序.
1.2.4　盐生杜氏藻 Ugd基因全长 cDNA的构建　3 RACE 反应按 Takara 3 RACE试剂盒的说明进行 ,
完成后用 1%琼脂糖(0.5×TBE)凝胶电泳分离 ,回收目的片段 ,进行克隆和测序.5 RACE反应参照Clon-
tech公司的 5 RACE试剂盒的说明并略作改进 ,完成后用 1%琼脂糖(0.5×TBE)凝胶电泳分离 ,回收目
的片段 ,进行克隆和测序.利用 Vector N TI软件包对 Ugd基因的 3 末端和 5 末端序列结果进行拼接 ,获
得全长 cDNA ,对其进行 ORF 分析 ,并在 OFR的两端设计一对引物进行 RT-PCR ,从而获得 Ugd基因的
ORF(所用引物序列见表 1).
表 1 实验用引物序列＊
引 物　　　 序 列　　　
兼并引物 上游引物下游引物
5 -TGCTTYCARAAGGAYATYCTGAAY-3
5 -DGTRTCCTTCT TRAANGCRAA-3
RACE 引物 3 RACE 引物
5 RACE 引物
5 -TGCTTCCAAAAGGACATTCTCAACC-3
5 -ACCTCTGCTTCTGGTAGTCGTTCAT-3
ORF引物 上游引物下游引物
5 -GCTCTAGAATTAACACAATGGCCACCCC-3
5 -GAGCTCGAGCTCAGTAGACCTTCTGC -3
　　　　＊Y , R ,D , N 为 Nucleot ide ambiguity codes
2　结果
2.1　盐生杜氏藻总 RNA的质量分析
由附图 a可以看出 , Trizol试剂提出的盐生杜氏藻总 RNA 在电泳条件下看不见有基因组 DNA 和蛋
白质的污染 ,23S 核糖体 RNA与 18S 核糖体 RNA 的带型比较清晰 ,无拖尾现象 ,两条带的亮度比基本上
呈 2∶1的关系 ,由此说明此 RNA 完整性比较好.为了进一步确定此 RNA的质量 ,还对在 220nm ～ 320nm
的紫外波长范围内进行扫描(表 2), A260nm/ A230nm =2.078 ,大于 2.00 , A 260nm/ A280nm =1.950 , 在
1.90 ～ 2.00之间 ,表明 RNA 的纯度很高 ,不存在蛋白质 、多糖和酚类的污染.
表 2 总 RNA 的紫外分析结果及 PCR电泳图
A 230 A260 A280 A 320 260/230 260/ 280 Conc.(×10-6g/μL)
0.652 1.355 0.695 0.015 2.078 1.950 0.125
2.2　盐生杜氏藻 Ugd基因部分 cDNA 片段的克隆
利用 RT-PCR技术 ,经胶收成功地获得一条约 200bp 的片段(如附图 b),测序分析显示其同芋头
(Colocasia esculenta)的 Ugd基因的编码区有 71.7%的相似性.
410 四川大学学报(自然科学版) 第 41卷
2.3　盐生杜氏藻 Ugd基因全长 cDNA 的构建
通过 3 和 5 RACE技术分别克隆了盐生杜氏藻 Ugd基因的 3 和 5 末端片段(如附图 c、d),测序后
利用 VectorNTI 软件包对 Ugd基因的 3 末端和 5末端序列进行拼接获得一条 1910bp的序列 ,并成功利
用 RT-PCR技术获得 Ugd的 ORF(如附图 e).
1　　M M　　1 1　　M 1　　M 1　　M
a b c d e
附图　 Ugd 基因克隆的电泳结果
a.总 RNA 电泳;b.RT-PCR结果;c.3 RACE结果;d.5 RACE结果 ;e.Ugd基因的 ORF
2.4　序列分析
本次测序由上海生工完成 ,基因长度为 1910bp ,此基因已申请专利.以所有 GENBANK 中该序列记
录为比较对象用 BLAS T2.0(Advanced)对拼接后的基因进行 blastx 分析 ,结果发现 ORF 读框(+2)长度
为 1446bp与 NCBI上的多种生物的 Ugd基因有很好的相似性.ORF 读框(+2)与芋头(Colocasia escu-
lenta)的 UDP-葡萄糖脱氢酶相同性为 71%(275/386),相似性为 80%(312/386),与大豆(soybean)的
UDP-葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.22)相同性为 70%(273/386),相似性为 80%(312/386),同拟南芥(Ara-
bidopsis thaliana)的 UDP-葡萄糖脱氢酶基因相比 ,相同性为 69%(270/386),相似性为81%(313/386).此
ORF 读框(+2)与 NCBI 上登录 Ugd基因 ORF 长度相近 ,故认为该序列为盐藻的 Ugd基因的 cDNA 全
长.
3 讨论
分析芋头(Colocasia esculenta)、大豆(Soybean)、亚麻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thal iana)
等高等植物的 UDP-葡萄糖脱氢酶 ,发现他们的氨基酸序列的同源性达到 84%左右.Ugd基因在植物物种
之间的保守性很高 ,和牛的 Ugd基因也有 70%的相似性[ 10] ,这就为盐生杜讼藻 Ugd 基因的同源克隆创
造的条件.根据保守结构域内的两段氨基酸序列(图表 1),设计了一兼并引物.经 RT-PCR扩增 ,得到一条
约 200bp左右的特异扩增带 ,与所设计的两条引物间的距离相吻合 ,克隆测序分析发现其同芋头(Coloca-
sia esculenta)的 Ugd基因的编码区具有 71.7%的同源性 ,结果表明这样一条克隆路线是可行的.
筛选文库和 RACE(Rapid Amplification of cDNA End)是两种常用的获得全长 cDNA 的方法 ,但相对
于筛选文库 , RACE 具有简便 、快捷 、廉价等优点 ,是目前普遍采用的克隆全长 cDNA 的技术.Clontech 公
司发明的 SMART-RACE专利技术借助于其公司独特的 SMART Ⅱ寡核苷酸引物和逆转录酶 ,反转录后
获得完整的 5 和 3 末端的 cDNA ,然后再利用合成的第一链 cDNA为模板直接进行 RACE反应 ,这样 ,不
仅能方便快捷克隆基因的 5 和 3 末端 ,同时又避免了连接接头的问题 ,现已成为克隆全长基因的一项有
效手段.为了增加 RACE的特异性 ,根据 1.2.3 步克隆的 cDNA 片段又重新设计了一对特异引物 ,利用
RACE试剂盒分别进行 5 和 3 RACE反应.两次 RACE结果经克隆测序后 ,利用 VectN TI软件包对其进
行拼接 ,从而成功地构建盐生杜氏藻 Ugd基因全长 cDNA.序列分析发现 ,这一全长 cDNA 包含一个长为
1446bp的ORF ,翻译产生一条 482个氨基酸的蛋白质 ,作 blastx 分析发现其同芋头(Colocasia esculenta)、
411第 2期 李音等:盐生杜氏藻 Ugd基因的 cDNA克隆及序列分析
大豆(Soybean)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 Ugd基因有 78%到 81%的同源性.
为了方便以后的功能鉴定及转基因表达研究 ,还在 ORF 两端设计了一对引物 ,并在引物的两端加上限制
性酶切位点 ,利用 RT-PCR技术 ,获得了盐生杜氏藻 Ugd基因的编码区.
杜氏藻是一种极端耐盐的真核绿藻 ,是较好的研究耐盐机制的模型 ,而 D.salina 的 Ugd 基因的克
隆 ,为研究盐胁迫条件下杜氏藻生长和发育特性提供了条件 ,同时也为耐盐机制的研究打下了坚实
的基础.
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Molecular cloning and sequence analysis of Ugd gene in Dunaliella .Salina
LI Y in , QIAO Dai-rong , Y I Yi , HE Qing-hua , Li Liang , SUN Hui , CAO Y i
(College Of Life Science ,SiChuan Universi ty ,Chengdu 610064 ,China)
Abstract:The degenerate primers w ere designed based on the homologous gene of Ugd in other organisms.A
cDNA fragment of 200bp from D .salina was obtained by RT-PCR technique.After cloning and DNA se-
quencing , the result indicated that 71.7% of the sequence of the f ragment w as homologous to the Ugd in
Colocasia esculenta .Based on this sequence , a pairs of primers w ere designed.By the RACE technique , the
full-length cDNA of Ugd w as successfully constructed in D .salina.
Key words:homologous cloning ;degenerate primer;Ugd(UDP-glucose dehydrogenase);RACE(Rapid Ampli-
f ication of cDNA End)
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