全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2017, 43(1): 3141 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31360359), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-20-1-1), 云南省中青年学术技术带头人后
备人才(2014HB038), 云南省应用基础研究计划项目(2016FB071), 重大科技专项-生物(2015ZA001)和科技创新人才计划(2014HC015)
资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31360359), the National Modern Agricultural Industry
Technology System Construction Project (CARS-20-1-1), the Young and Middle-aged Academic Technology Leaders Reserve Talented Per-
son in Yunnan Province (2014HB038), the Applied Basic Research Projects in Yunnan Province (2016FB071), the Major Science and Tech-
nology Projects – Biology (2015ZA001), and the Science and Technology Innovation Talents Project (2014HC015).
* 通讯作者(Corresponding author): 吴才文, E-mail: gksky_wcw@163.com 同等贡献(Contributed equally to the work)
第一作者联系方式: 吴转娣, E-mail: judith1123@126.com; 刘新龙, E-mail: lxlgood868@163.com
Received(收稿日期): 2016-01-11; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(网络出版日期): 2016-09-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160928.0948.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2017.00031
甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因 ScD27 的克隆与表达分析
吴转娣 刘新龙 刘家勇 昝逢刚 李旭娟 刘洪博 林秀琴
陈学宽 苏火生 赵培方 吴才文*
云南省农业科学院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 云南开远 661699
摘 要: 独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一类新型植物激素, D27基因是独脚金内酯生物合成途径中最上游的调控
基因, 且该基因调控 SLs 的合成是一个可逆的过程。本研究根据水稻、玉米、高粱、二穗短柄草 4 种禾本科作物的
D27 基因核苷酸序列保守区域设计引物, 以甘蔗品种 ROC22 的 cDNA 为模板, 利用 RT-PCR 和 RACE 技术, 从甘蔗
中克隆出 D27基因的 cDNA全长序列, 命名为 ScD27, GenBank登录号为 KP987221.1。该基因序列全长 1379 bp, 包
含一个 867 bp的完整开放阅读框(ORF), 编码 288个氨基酸残基。ScD27编码的蛋白质分子量为 71.58 kD, 理论等电
点为 5.04, 是一种非分泌性蛋白, 主要分布于叶绿体上, 该蛋白的保守区可能具有 2 个锌指蛋白结构域(ZnF_TAZ 和
ZnF_A20), 且不存在信号肽; 该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性, 与高粱、谷子、大麦、短穗二柄草等禾本
科植物的D27氨基酸序列相似性在 70%以上; ScD27基因在甘蔗各组织部位均有表达, 其中茎尖和腋芽中表达量较高,
叶、茎和根中的表达较低。此外, ScD27基因在甘蔗茎尖中的表达受 PEG、盐胁迫、磷缺乏和营养缺乏的诱导, 推测
ScD27基因是甘蔗独脚金内酯生物合成途径中响应非生物胁迫的关键基因。
关键词: 甘蔗; ScD27; 同源克隆; 生物信息学; q-PCR
Cloning and Expression Analysis of Key Gene ScD27 in Strigolactones
Biosynthesis Pathway
WU Zhuan-Di, LIU Xin-Long, LIU Jia-Yong, ZAN Feng-Gang, LI Xu-Juan, LIU Hong-Bo, LIN Xiu-Qin,
CHEN Xue-Kuan, SU Huo-Sheng, ZHAO Pei-Fang, and WU Cai-Wen*
Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan
661699, China
Abstract: Strigolactones (SLs) is a novel class of plant hormones. D27 regulating reversible metabolic process is located in
up-stream of strigolactones biosynthesis pathway. In this study, primers were designed based on the conserved domains from four
species inluding Oryza sativa, Zea mays, Sorghum bicolor, and Brachypodium distachyon. Using cDNA from sugarcane cultivar
ROC22 as the template, the full-length cDNA sequence of D27 gene from sugarcane was cloned by RT-PCR and RACE method.
This gene is named as ScD27, with the GenBank accession number of KP987221.1. Its length is 1379 bp, and it contains an 867
bp open reading frame (ORF), encoding 288 amino acid residues. ScD27 is not a secretory protein and has a molecular weight of
71.58 kD, with a theoretical isoelectric point of 5.04. ScD27 is mainly located in chloroplast and the conserved domains of this
protein involve two zinc finger protein structures (ZnF_TAZ and ZnF_A20). Amino acid sequences encoded by ScD27 shared
more than 70% similarity with the reported amino acid sequences encoded by D27 of Sorghum bicolor, Setaria italica Beauv.,
32 作 物 学 报 第 43卷


Hordeum vulgare subsp. vulgare and Brachypodium distachyon. ScD27 gene was differentially expressed in different parts of
sugarcane plant, with higher level of transcript in stem tip and axillary bud but much lower level in leaf, stem and root. Further-
more, the expression of ScD27 could be induced by the stresses of PEG, salt and the deficiencies of phosphorus and nutrition.
These results demonstrated that ScD27 might be a key gene participating in the response to abiotic stresses during sugarcane SLs
biosynthesis pathway.
Keywords: Sugarcane; ScD27; Homology cloning; Bioinformatics; q-PCR
农作物的生长发育主要受植物激素的调控, 如
作物的株型、水分和营养的利用以及对生物和非生
物胁迫的适应性等, 因此植物激素对作物产量的形
成与品质的保持发挥至关重要的作用 [1]。甘蔗
(Saccharum spp.)是世界上最重要的糖料作物, 在其
生长发育和逆境胁迫适应过程中受到多种激素信号
的调控作用[2-3]。因此, 研究植物激素调控甘蔗重要
农艺性状、抗逆性状表现的生理分子机制对于甘蔗
品种产量性状的改良具有重要的理论和实践意义。
独脚金内酯(strigolactones, SLs)属于类萜内酯
类植物激素, 该激素能够促进寄生植物种子的萌发
和植物与共生真菌之间的相互作用, 对于植物的分
枝和逆境胁迫调控也具有重要作用[4-6], 前人研究表
明, 独脚金内酯是作为第二信使在抑制植物分枝上
发挥作用, 当植物营养受到限制时, SLs会在植物的
根部生成并促进侧根和根毛的生长, 同时 SLs 被运
输至植物的出芽位置, 抑制侧芽生长, 从而增加植
物根部对无机营养物质的捕获, 减少分蘖对营养的
需求[7]。
此外, SLs还具有促进节伸长、加快叶片衰老、
促进根毛伸长和次生根生长、增加茎粗度诱导二次
生长、响应逆境胁迫等作用[8-10]。迄今, 通过对多种
模式植物如拟南芥[11-12]、矮牵牛[13-15]、豌豆[16]、水
稻[17-20]等的研究, 初步明确 SLs 的合成及信号传导
途径在调控植物分枝形成和响应逆境胁迫的功能作
用。一系列相关基因也被陆续克隆出来 , 如
CCD7/D17/HTD1[21]、CCD8/D10[22-23]、D27[20,24-25]、
MAX1[26]等基因主要参与独脚金内酯的合成 [27]。
D14[26,28]、D3[29-30]、D53[31]主要参与独脚金内酯的信
号传导途径[32-35], 当具有活性的独脚金内酯与 D14
蛋白结合, 诱导D14的构象变化, 使D3和D53结合,
以促进 D53 蛋白的泛素化, 最终使 D53 蛋白降解,
独脚金内酯得以正常应答。
在独脚金内酯合成途径中, D27 (DWARF27)是
一个叶绿体定位的铁结合蛋白, 为独角金内酯生物
合成的一个重要成员, 当 D27 基因突变后生长素的
极性运输增强, 根部分泌液中检测不到独角金内酯,
导致分蘖芽向外生长的抑制作用被解除而呈多分蘖
表型[18,20]。对水稻 D27 基因的研究表明, 它被定位
于水稻的第 11染色体, 主要在幼叶、腋芽、花序原
基、侧根和冠状根中表达, 尤其是在主茎地上部顶
端和幼叶以及节和节间的维管束细胞中表达[20]。氨
基酸序列的比对分析发现, 从低等的藻类到高等植
物广泛存在 D27的同源蛋白。
SLs 的生物合成受其自身和外部环境条件的共
同调节, 植物可能通过调节 SLs 合成基因的转录水
平来调控 SLs的合成和分泌[36-37], SLs还可能通过调
控植物的分枝来响应外部环境的胁迫, 如磷胁迫[38]
等。研究发现, 在磷缺乏条件下, 三叶草[39]和番茄[40]
中 SLs的生物合成量大幅提高, 进而导致分枝减少。另
有研究发现, 磷缺乏还可能影响 SLs 的生物活性[6,37]。
从拟南芥 max2 突变体对干旱胁迫敏感性的研究发
现, SLs类似物 GR24能够提高 SLs缺失突变体对干旱
的抵抗能力, 同时也能提高野生型植株的耐旱性[41-42]。
SLs不仅可以调控芽的生长, 还能调控初生根、侧根
的发育以及根毛的延长, 在逆境条件下(如磷缺乏、
干旱和盐胁迫), 植物会通过抑制芽的生长, 增强根
系生长, 从而提高植物应对逆境的能力, 最终影响
整个植物的形态建成[43-44]。
甘蔗 D27基因是否也参与甘蔗品种分蘖形成、
形态构建和逆境胁迫响应, 依然是不清楚的。本研
究利用基因克隆技术, 从甘蔗中克隆出 D27 基因的
同系物, 并通过生物信息学和实时荧光定量 PCR 技
术分析其序列结构特点和表达模式, 以期为 SLs 对
甘蔗品种发育和重要性状的分子调控功能的研究奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
选用我国蔗区种植面积最大的主栽品种 ROC22,
剪取处于分蘖期的甘蔗茎尖, 提取其总 RNA。甘蔗
品种 ROC22 由云南省甘蔗遗传改良重点实验室提
供。大田中选取生长健壮并长势一致的 ROC22蔗茎,
砍成单芽茎段, 洗净并 52℃温水脱毒处理 30 min。
温室中取 45 d 的甘蔗幼苗, 参考李晓君的方法[45],
设置 6种处理: 即以 10% (w/v) PEG-6000的 MS培
第 1期 吴转娣等: 甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因 ScD27的克隆与表达分析 33


养基; 20% (w/v) PEG-6000的 MS培养基; 200 mmol
L–1 NaCl的MS培养基; 300 mmol L–1 NaCl的MS培
养基; 1/8 mmol L–1的磷缺乏; 纯水培养(营养缺乏)。
于不同处理的不同时间 0 (对照)、6、12、24、48、
72和 96 h取茎尖, 立即投入液氮速冻, 并保存于–80
℃, 用于提取总 RNA。
1.2 甘蔗茎尖总 RNA 的提取和 cDNA 第 1 链的
合成
提取总 RNA参照全式金公司 RNA Plant Kit说
明书, 以 RNAase-Free H2O溶解 RNA, NanoDrop测
定 RNA浓度, 根据 OD260/OD280和 OD260/OD230评估
RNA 质量 , 通过 1%琼脂糖凝胶电泳的结果判断
RNA的完整性, 存于–70℃备用。取 1 μg茎尖总RNA
按照 TaKaRa公司的 RNA PCR Kit试剂盒说明书合
成 cDNA。
1.3 甘蔗 ScD27基因同源片段的克隆
以 NCBI 检索的二穗短柄草(Brachypodium dis-
tachyon)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、
水稻 (Oryza sativa)的 D27 基因序列为模板 , 以
DNAman 软件分析 D27 保守区。用 Primer5.0 软件
设计 RT-PCR 引物(表 1)。以 cDNA 为模板, 使用全
式金 Trans Taq HiFi DNA Polymerase进行 RT-PCR,
PCR运行程序为 94℃, 3 min预变性, 94℃ 30 s, 56
℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30个循环, 72℃延伸 10 min。
PCR产物经 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 以全式金
公司的凝胶回收试剂盒回收、纯化扩增条带, 并连
接到 pEASYTM-T5 Zero-Vector载体中, 转入 DH5α
大肠杆菌, 阳性克隆经 PCR鉴定后, 送上海生工测序,
测序结果经 Blast和 DNAman 6.0验证比对分析。
1.4 5和 3端的 RACE克隆
根据 1.3 中的甘蔗 ScD27 基因同源片段序列设
计内外巢基因特异性引物(表 1)。按照Clontech Smart
Race cDNA Amplification Kit 说明书扩增目的基因
的 3和 5末端。以拼接获得的全长序列为模板, 设
计引物扩增 ScD27 基因的编码区序列, 扩增条件为
94℃, 3 min预变性, 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 45 s,
30个循环, 72℃延伸 10 min。参见 1.3的检测、回收、
测序、验证比对分析。

表 1 RT-PCR、RACE、荧光定量 PCR 扩增引物
Table 1 Primers used for RT-PCR, RACE, and Q-PCR experiments
引物名称
Primer name
引物序列
Primers sequence (5–3)
目的
Purpose
ScD27EST-F CTGGGATGAAGAACGGAAA
ScD27EST-R GCTGCTTCAGTGCTGGATCA
基因片段扩增
Amplification of gene segment
外侧特异引物 ScD27-5R2 CGAGCCAAGGGAAGAATATCGTGGTGAA
内侧特异引物 ScD27-5R1 CGTAGCCGTCCTTTCCGTTCTTCATCCCAG
5 RACE扩增
5 RACE amplification
外侧特异引物 ScD27-3F1 GCCGCCTTCACCACGATATTCTTCCCTT
内侧特异引物 ScD27-3F2 GGAATCCGAAGTTGATGGAAGGAAAGAG
3’RACE扩增
3 RACE amplification
ScD27F CGACGCACGCACGGAGT
ScD27R ACTAGAATTGCCTTCTGCTATGTT
编码区扩增
Amplification of coding region
D27-Q547F ATGTGAGGTCAGGGAATCCGAAG
D27-Q694R TGAATCTTGGATGAACTTCTGGCA
实时荧光定量 PCR扩增
Amplification of q-PCR
GAPDHF CACGGCCACTGGAAGCA
GAPDHR TCCTCAGGGTTCCTGATGCC
GAPDH内参基因
GAPDH reference genes

1.5 甘蔗 ScD27基因的生物信息学分析
使用ORF Finer在线工具寻找编码框; ProtParam
(http://web.expasy.ory/ProtParam/)和Smart (http://smart.
embl-heidelberg.de/)在线软件分析蛋白的基本理论
性质和保守结构域; ProtScale 分析蛋白质疏水性;
SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、
TMHMM Sever2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM/)和 PSORT (http://psort.hgc.jp/)分析蛋白的
信号肽和亚细胞定位预测; SOPMA软件预测蛋白的
二级结构 ; NCBI 平台进行 Blast 同源比对分析 ,
ClustalW 软件进行多序列对齐和排序, MEGA5.0构
建 NJ系统进化树。
1.6 甘蔗 ScD27 基因表达的实时荧光定量 PCR
分析
取甘蔗的分蘖芽、腋芽、茎尖、根尖、老根、
嫩叶、老叶(第四叶中段)、节(第三节)和叶鞘, 提取
RNA (方法参考 1.2)。根据 ScD27基因序列设计荧光
定量 PCR 引物, 使用 GAPDH 作为内参基因[46](表
1)。选用 TaKaRa公司的 PrimeScript RT reagent Kit
with gDNA Eraser和 SYBR Premix Ex Taq II试剂盒,
34 作 物 学 报 第 43卷


按其说明书, 定量 PCR体系 20 μL, 用 ABI Vii7Real
time PCR System (Applied Biosystems, USA)检测
ScD27基因的表达。设置 3个重复样品, 利用 2–ΔΔCT
法计算基因的相对表达量[47]。
2 结果与分析
2.1 甘蔗 ScD27基因全长 cDNA序列
图 1所示, RT-PCR扩增得到长度为 477 bp的甘
蔗 D27基因片段; RACE扩增获得 479 bp的 3端序
列和 670 bp的 5端序列。通过将中间片段、3端序
列和 5端序列拼接, 得到全长为 1379 bp的甘蔗 D27
基因全长 cDNA 序列 , 使用编码区引物扩增获得
867 bp的编码区序列。该基因包含 127 bp的 5非编
码区、385 bp的 3非编码区和 867 bp的编码区, 可
编码 288个氨基酸, 被命名为 ScD27, 并将基因序列
提交 GenBank数据库, 登录号为 KP987221.1。
2.2 甘蔗 ScD27的生物信息学分析
2.2.1 ScD27 蛋白基本理化性质和保守结构域分析
通过 ORF Finer在线工具找到 ScD27的 ORF框,
并翻译成氨基酸序列(图 2)。使用 ProtParam在线软

图 1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

图 2 ScD27 基因的编码区序列及推导出的氨基酸序列
Fig. 2 Leotide and predicted amino acid sequences of ScD27 gene
第 1期 吴转娣等: 甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因 ScD27的克隆与表达分析 35


件分析该蛋白序列的理化性质表明, ScD27 蛋白的
分子式为 C2539H4205N867O1033S255, 分子量为 71.58 kD,
等电点为 5.04, Ala、Pro、Ser 在氨基酸序列组成中
出现频率较高, 分别占 10.1%、9.4%、7.3%和 8.1%,
而一些氨基酸如 Pyl、Sec在氨基酸序列中则没有出
现。稳定性系数为 50.16, 表明为不稳定蛋白(不稳定
系数<40是稳定蛋白, >40是不稳定蛋白); 总平均亲
水性(GRAVY)为–0.308, 脂肪系数(AI)为 68.79, 说
明该蛋白质亲水区域多于疏水区域, 为亲水蛋白。
通过 Smart 分析表明甘蔗 ScD27 蛋白在氨基酸
序列第 190~234之间可能含有一个 ZnF_TAZ锌指结
构域 , 在氨基酸序列第 199~224 之间有一个类
ZnF_A20 锌指结构域, 由于具有相同结构的蛋白往
往行使相似的功能[48], 因此推测 ScD27 蛋白可能参
与了其他生物学通路, 与植物调节分蘖来响应非生
物胁迫有关。
2.2.2 ScD27蛋白磷酸化和糖基化位点 蛋白质
的修饰方式包括蛋白质的磷酸化和糖基化, 它可以
调节蛋白质的活力和功能。分别运用 DictyOGlyc 1.1
Server 和 NetPhos 2.0 Serve在线软件预测 ScD27基
因翻译后磷酸化、O-糖基化修饰情况。结果显示 ,
ScD27蛋白有可能发生磷酸化修饰的位点有16个 ,
其中色氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)可能发
生磷酸化修饰的位点分别有8、5、3个(图3); 有可能
发生 O-糖基化修饰的位点有0个(图4)。磷酸化位点
均集中分布在中间亲水区。

图 3 ScD27 蛋白氨基酸序列翻译后磷酸化修饰位点预测
Fig. 3 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein

图 4 ScD27 蛋白氨基酸序列翻译后 O-糖基化修饰位点预测
Fig. 4 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein

2.2.3 ScD27 蛋白信号肽预测、亚细胞定位和蛋白
的二级结构预测 根据 SignalP4.1 server 软件预
测可知, 该蛋白的信号肽平均值较小, 为 0.217 (远
远小于 0.500), 因此推测 ScD27 蛋白无信号肽及切
割位点, 属于非分泌蛋白, 说明该蛋白在细胞质中
合成后不能被转运。根据 PSORT II在线软件预测表
明 ScD27 蛋白主要定位于叶绿体上。使用 SOPMA
软件预测 ScD27 蛋白的二级结构(图 5), 该蛋白 α-
螺旋(h)占 33.6%、β-折叠(e)占 14.24%、β-转角(t)占
4.86%和无规则卷曲(c) 47.22%。可见 α-螺旋和无规
则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分, 进一步
分析发现 α-螺旋在 N 端与中部所占分量较大, 延伸
36 作 物 学 报 第 43卷


链主要集中在中部及 C 端, β-转角则主要在中部和
前部, 无规则卷曲的分布则比较平均(图 5)。Motif
Scan 软件在线软件分析该基因含有一个异戊烯化作
用位点和一个 CAAX BOX结构, 这可能是蛋白质翻
译后修饰并正确定位的重要作用元件。
作为蛋白质折叠的主要驱动力 , 蛋白质的亲
水、疏水氨基酸的组成能够影响蛋白质的结构和特
性 , 经在线软件 ProtScale 采用 Hyhob/Kyte &
Doolittle 的方法分析显示(图 6), 第 130 位具有最高
分值, 为 2.367, 疏水性最强; 第 36 和第 37 位最低
分值, 为–3.067, 亲水性最强。整条多肽链表现为亲
水性, 没有明显的疏水区, 故推测甘蔗 ScD27 蛋白
是一种亲水蛋白。

图 5 ScD27 蛋白质二级结构分析
Fig. 5 Secondary structure analysis of ScD27 protein
2.2.4 ScD27 蛋白氨基酸序列的同源比对及进化树
分析 在 NCBI 上筛选出与甘蔗 ScD27 基因氨基
酸序列相似性较高的 5 个不同物种的 D27 蛋白, 并
将其与甘蔗 ScD27 基因预测的氨基酸序列进行多序
列比对。结果显示, ScD27 蛋白氨基酸序列与其他
D27氨基酸序列有较高的保守性(图 7)。
氨基酸同源比对分析表明 ScD27 蛋白与玉米
D27蛋白氨基酸序列相似性达到 82% (图 8), 与单子
叶植物高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica

图 6 ScD27 蛋白的亲水性/疏水性预测
Fig. 6 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of ScD27

图 7 ScD27 与其他五种作物同源蛋白的氨基酸序列比对结果
Fig. 7 Structure and sequence alignment analysis among ScD27 and D27 homologs of five crops
gi326492644: 大麦; gi357156309: 二穗短柄草; >gi242068981: 高粱; gi514809530: 谷子; gi226501302: 玉米。
gi326492644: Hordeum vulgare subsp. vulgare; gi357156309: Brachypodium distachyon; gi242068981: Sorghum bicolor; gi514809530:
Setaria italica; gi226501302: Zea mays.
第 1期 吴转娣等: 甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因 ScD27的克隆与表达分析 37



图 8 不同物种 D27 氨基酸序列的聚类分析
Fig. 8 Phylogenetic analysis of D27 gene homologs in different plant species

Beauv.)、大麦(Hordeum vulgare subsp. vulgare)、二
穗 短 柄 草 (Brachypodium distachyon) 和 山 羊 草
(Aegilops umbellulata)的相似性分别高达 78%、76%、
73%、 71%和 64%, 与双子叶植物海枣 (Phoenix
dactylifera)和甜橙(Citrus aurantium)的相似性分别
为 57%和 58%。使用 MEGA5.0构建的 NJ进化树(图
8)显示单子叶植物和双子叶植物 D27 蛋白同系物分
别聚在 2 个不同的分支, 表明 D27 蛋白在单双子叶
植物间存在一定的分化, 在同类型植物间表现出较
高的保守型。在单子叶植物分支群中, ScD27蛋白与
谷子、高粱聚为一个小分支, 表现出较高的同源性。
2.3 ScD27基因组织特异性表达分析
qRT-PCR分析表明(图 9), 甘蔗 ScD27基因在各
器官中差异表达, 在分蘖芽、腋芽、茎尖中的表达
量相对较高, 根尖、老根、嫩叶、老叶、节和叶鞘中
的表达量相对较少。因此, ScD27基因在甘蔗中具有组
织特异性, 主要是在甘蔗的幼嫩组织中强表达。
2.4 ScD27基因不同胁迫下的表达分析
q-PCR (quantitative PCR, q-PCR)分析结果表明,
在不同胁迫条件下, ScD27基因均被诱导表达, 而响
应的方式有一定的差异(图10)。ScD27基因的表达受
到 PEG强烈诱导, 10% (w/v) PEG-6000的MS培养基
处理, 在6个时间点(6、12、24、48、72和96 h)中甘
蔗 ScD27基因表达以 24 h 达最高 ; 20% (w/v)
PEG-6000的 MS 培养基胁迫下12 h 达最高的4倍的
表达量, 并在整个处理周期, 96 h内均维持较高的表
达水平(3倍以上)。
总体上看, ScD27 基因在受到模拟干旱胁迫和

图 9 ScD27 基因在甘蔗不同组织中的表达
Fig. 9 Expression of ScD27 gene in different sugarcane tissues analyzed with q-PCR technique
38 作 物 学 报 第 43卷



图 10 ScD27 基因在不同胁迫条件下的表达量
Fig. 10 Expression level of ScD27 gene under different stress conditions using q-PCR technique

中度盐胁迫(以 200 mmol L–1 NaCl的 MS培养基处
理)的诱导表达增强, 处理 24 h后表达量均出现明显
增强, 但在重度盐胁迫(以 300 mmol L–1 NaCl的 MS
培养基处理)处理后, ScD27 基因的表达量相对增加
较少, 可能与蔗苗受极端胁迫有关, 而后期蔗苗出
现死亡现象。在磷缺乏和营养缺乏时, ScD27基因同
样表现出表达增强, 但与响应模拟干旱和盐胁迫相
比, 其表达量增长较少。
3 讨论
植物激素作为调节植物的分枝数量和模式的重
要因素, 其受体鉴定、代谢调控、信号转导和调控
发育一直是重要的研究前沿课题。虽然 SLs 调控植
物分蘖的特性研究已经取得了较大的进展, 但更多
的调控因子、未知来源的 SLs, 和 SLs类似物的出现
及其重要信号功能, 可能的新的 SLs 合成途径的存
在, 以及相关基因的调控分子机制还有待进一步阐
明[49]。
本研究从甘蔗主栽品种 ROC22 中克隆获得了
与甘蔗分蘖相关的基因 ScD27 基因, 该基因序列全
长 1379 bp, 其开放阅读框为 867 bp, 编码 288个氨
基酸的蛋白质。研究表明水稻 D27基因是一个定位
于叶绿体中的含铁蛋白质, 在甘蔗中的 ScD27 通过
在线分析表明其同样定位于叶绿体[17, 54], 该推断还
需要进一步的验证。通过同源性分析和进化树分析
表明, 甘蔗 ScD27 基因的氨基酸序列与谷子、高粱
和水稻中 D27 蛋白的氨基酸序列同源性较高 , 达
80%左右 , 但与甜橙等双子叶植物的同源性只有
58%, 这也从另一方面证明本研究分离获得的
ScD27 基因序列是正确的, 但氨基酸序列的保守性
一般, 推测来源于不同作物的 D27 基因在功能上可
能存在差异。
植物锌指蛋白是一类庞大的转录调控因子家族,
可以通过与核酸或蛋白质结合来行使功能, 参与多
个生理过程, 其中植物 A20/AN1型锌指蛋白与植物
的非生物逆境应答密切相关[50]。甘蔗 ScD27基因保
第 1期 吴转娣等: 甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因 ScD27的克隆与表达分析 39


守区中含有一个 ZnF_TAZ 锌指结构域和一个类
ZnF_A20 锌指结构域, 推测该结构域的存在与甘蔗
ScD27 基因参与其他生物学通路相关, 也可能与甘
蔗调节分蘖来响应非生物胁迫有关。D27 基因是位
于独脚金内酯生物合成最上游位置的一个调控基因,
其调控作用是一个可逆的过程, 预计基因的研究对
于了解独脚金内酯生物合成与植物响应非生物逆境
胁迫之间的关系十分重要 [44,51], 同时该基因还可能
对 SLs合成的新途径的研究有重要的作用。
ScD27基因是甘蔗合成独脚金内酯所必需的[25],
通过对 ScD27 基因在甘蔗组织中的表达, 发现在甘
蔗的不同组织部分均能检测到 ScD27 基因的表达,
但其表达具有较强的组织特异性。在甘蔗茎尖中的
表达量最高, 在腋芽、分蘖芽中的表达量次之, 根
尖、老根、节和叶鞘中的表达量相对较少。总之, 主
要是在幼嫩分生组织处表达。与水稻 D27基因的表
达较相似[20]。在受到非生物胁迫(PEG、盐、磷、营
养)的情况下, 该基因均受到诱导而高表达, 独脚金
内酯的生物合成量增多, 地上分蘖减少, 这与前人
的研究结果一致[52]。尤其是在受到 PEG模拟的干旱
胁迫作用下, 其表达量被诱导高达 4 倍, 说明该基
因可能与干旱或渗透胁迫响应有关, 推测 ScD27 基
因是甘蔗独脚金内酯响应非生物胁迫的关键基因。
在水稻中 D27的表达量可影响 SLs对水稻分蘖
的调控[18]。d27 突变体中 D27 基因的第 4 外显子发
生 4 bp缺失, 提前形成终止密码子, d27突变体株高
矮化, 分蘖数增多, 多达野生型的 3 倍, d27 突变体
的表型与生长素极性运输增强有关。D27 突变之后
生长素极性运输增强, 根部分泌液中检测不到独角
金内酯 2’-epi-5-deoxystrigol, 导致分蘖芽向外生长
的抑制作用被解除 , 因此表现出多分蘖表型。
d27d10双突变体的表型与水稻突变体 d10的表型类
似, d27的表型可以被人工合成的独脚金内酯类似物
GR24所恢复[20]。ScD27基因在甘蔗中的功能鉴定、
亚细胞定位将是本研究的后续的工作, 本课题组已
经构建了相应的过表达和 RNAi 干扰植物表达载体,
并开展了农杆菌介导的甘蔗遗传转化的相关工作。
通过对转基因甘蔗的非生物胁迫处理可进一步鉴定
ScD27在甘蔗 SLs生物合成途径中的作用。
4 结论
克隆获得一个全长 ORF为 867 bp, 编码 288个
氨基酸的 ScD27 基因的全长序列, 该基因编码的蛋
白属于亲水性蛋白, 且不存在信号肽。ScD27基因含
有一个 ZnF_TAZ 锌指结构域和一个类 ZnF_A20 锌
指结构域。该基因在甘蔗不同部位的表达具有组织
特异性, 在受到多种非生物胁迫的作用下均被诱导
表达, 表明它与甘蔗 SLs响应非生物胁迫密切相关。
References
[1] 许智宏, 李家洋. 中国植物激素研究: 过去、现在和未来. 植
物学通报, 2006, 23: 433–442
Xu Z H, Li J Y. Plant hormones research in china: past, present
and future. Chin Bull Bot, 2006, 23: 433–442 (in Chinese with
English abstract)
[2] 王威豪, 王一丁, 莫云川, 叶燕萍, 李杨瑞. 水分胁迫下喷施
乙烯利对甘蔗分蘖及农艺性状的影响. 广西农业科学, 2007,
(2): 148–151
Wang W H, Wang Y D, Mo Y C, Ye Y P, Li Y Y. Studies on
effects of etheph on physiological, biochemical and agronomical
characters in sugarcane during tillering stage under water stress.
Guangxi Agric Sci, 2007, (2): 148–151 (in Chinese with English
abstract)
[3] Vasantha S, Shekinah D E, Gupta C, Rakkiyappan P. Tiller pro-
duction, regulation and senescence in sugarcane (Saccharum spe-
cies hybrid) genotypes. Sugar Tech, 2012, 14: 156–160
[4] Gomez-Roldan V, Fermas S, Brewer P B, Puech-Pages V, Dun E
A, Pillot J P, Letisse F, Matusova R, Danoun S, Portais J C,
Bouwmeester H, Becard G, Beveridge C A, Rameau C, Rochange
S F. Strigolactone inhibition of shoot branching. Nature, 2008,
455: 189–194
[5] Klee H. Plant biology: hormones branch out. Nature, 2008, 455:
176–177
[6] Umehara M, Hanada A, Yoshida S, Akiyama K, Arite T, Ta-
keda-Kamiya N, Magome H, Kamiya Y, Shirasu K, Yoneyama K,
Kyozuka J, Yamaguchi S. Inhibition of shoot branching by new
terpenoid plant hormones. Nature, 2008, 455: 195–200
[7] Koltai H. Strigolactones are regulators of root development. New
Phytol, 2011, 190: 545–549
[8] Al-Babili S, Bouwmeester H J. Strigolactones, a novel carote-
noid-derived plant hormone. Annu Rev Plant Biol, 2015, 66:
161–186
[9] Rasmussen A, Hosseini S A, Hajirezaei M R, Druege U, Geelen
D. Adventitious rooting declines with the vegetative to reproduc-
tive switch and involves a changed auxin homeostasis. J Exp Bot,
2015, 66: 1437–1452
[10] Andreo-Jimenez B, Ruyter-Spira C, Bouwmeester H J, Lopez-
Raez J A. Ecological relevance of strigolactones in nutrient up-
take and other abiotic stresses, and in plant-microbe interactions
below-ground. Plant Soil, 2015, 394: 1–19
[11] Alder A, Jamil M, Marzorati M, Bruno M, Vermathen M, Bigler P,
Ghisla S, Bouwmeester H, Beyer P, Al-Babili S. The path from
beta-carotene to carlactone, a strigolactone-like plant hormone.
Science, 2012, 335: 1348–1351
[12] Booker J, Sieberer T, Wright W, Williamson L, Willett B, Stirn-
berg P, Turnbull C, Srinivasan M, Goddard P, Leyser O. MAX1
encodes a cytochrome P450 family member that acts downstream
of MAX3/4 to produce a carotenoid-derived branch-inhibiting
hormone. Dev Cell, 2005, 8: 443–449
40 作 物 学 报 第 43卷


[13] Simons J L, Napoli C A, Janssen B J, Plummer K M, Snowden K
C. Analysis of the DECREASED APICAL DOMINANCE genes
of petunia in the control of axillary branching. Plant Physiol,
2007, 143: 697–706
[14] Drummond R S, Martinez-Sanchez N M, Janssen B J, Templeton
K R, Simons J L, Quinn B D, Karunairetnam S, Snowden K C.
Petunia hybrida CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 7
is involved in the production of negative and positive branching
signals in petunia. Plant Physiol, 2009, 151: 1867–1877
[15] Drummond R S, Sheehan H, Simons J L, Martinez-Sanchez N M,
Turner R M, Putterill J, Snowden K C. The expression of petunia
strigolactone pathway genes is altered as part of the endogenous
developmental program. Front Plant Sci, 2011, 2: 115
[16] Sorefan K, Booker J, Haurogne K, Goussot M, Bainbridge K,
Foo E, Chatfield S, Ward S, Beveridge C, Rameau C, Leyser O.
MAX4 and RMS1 are orthologous dioxygenase-like genes that
regulate shoot branching in Arabidopsis and pea. Genes Dev,
2003, 17: 1469–1474
[17] 王涛. 水稻独脚金内酯相关基因的图位克隆与功能分析. 中
国农业科学院博士学位论文, 北京, 2012
Wang T. Map-Based Cloning and Functional Analysis of the
Strigolactones-Related Genes in Rice (Orzya sativa L.). PhD
Dissertation of Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing,
China, 2012 (in Chinese with English abstract)
[18] Waters M T, Brewer P B, Bussell J D, Smith S M, Beveridge C A.
The Arabidopsis ortholog of rice DWARF27 acts upstream of
MAX1 in the control of plant development by strigolactones.
Plant Physiol, 2012, 159: 1073–1085
[19] Zhang Y, van Dijk A D, Scaffidi A, Flematti G R, Hofmann M,
Charnikhova T, Verstappen F, Hepworth J, van der Krol S, Leyser
O, Smith S M, Zwanenburg B, Al-Babili S, Ruyter-Spira C,
Bouwmeester H J. Rice cytochrome P450 MAX1 homologs
catalyze distinct steps in strigolactone biosynthesis. Nat Chem
Biol, 2014, 10: 1028–1033
[20] Lin H, Wang R, Qian Q, Yan M, Meng X, Fu Z, Yan C, Jiang B,
Su Z, Li J, Wang Y. DWARF27, an iron-containing protein re-
quired for the biosynthesis of strigolactones, regulates rice tiller
bud outgrowth. Plant Cell, 2009, 21: 1512–1525
[21] Rubio-Moraga A, Ahrazem O, Perez-Clemente R M, Go-
mez-Cadenas A, Yoneyama K, Lopez-Raez J A, Molina R V,
Gomez-Gomez L. Apical dominance in saffron and the involve-
ment of the branching enzymes CCD7 and CCD8 in the control
of bud sprouting. BMC Plant Biol, 2014, 14: 171
[22] 陈芳育, 江良荣, 郑景生, 黄荣裕, 王侯聪. 用蛋白质组遗传
方法分析水稻多蘖矮秆突变体的共分离蛋白. 中国遗传学会
大会, 厦门大学, 福建厦门, 2011
Chen F Y, Jiang L R, Zheng J S, Huang R Y, Wang H C. Fine
mapping and proteomics analysis of a high-tillering dwarf mutant
in rice. Congress of Chinese Genetic Society, Xiamen University,
Xiamen, China, 2010
[23] Arite T, Iwata H, Ohshima K, Maekawa M, Nakajima M, Kojima
M, Sakakibara H, Kyozuka J. DWARF10, an RMS1/MAX4/
DAD1 ortholog, controls lateral bud outgrowth in rice. Plant J,
2007, 51: 1019–1029
[24] Harrison P J, Newgas S A, Descombes F, Shepherd S A, Thomp-
son A J, Bugg T D. Biochemical characterization and selective
inhibition of beta-carotene cis-trans isomerase D27 and carote-
noid cleavage dioxygenase CCD8 on the strigolactone biosyn-
thetic pathway. FEBS J, 2015, 282: 3986–4000
[25] Wen C, Zhao Q, Nie J, Liu G, Shen L, Cheng C, Xi L, Ma N,
Zhao L. Physiological controls of chrysanthemum DgD27 gene
expression in regulation of shoot branching. Plant Cell Rep, 2016
[26] Abe S, Sado A, Tanaka K, Kisugi T, Asami K, Ota S, Kim H I,
Yoneyama K, Xie X, Ohnishi T, Seto Y, Yamaguchi S, Akiyama
K, Yoneyama K, Nomura T. Carlactone is converted to carlac-
tonoic acid by MAX1 in Arabidopsis and its methyl ester can di-
rectly interact with AtD14 in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 2014,
111: 18084–18089
[27] Zou J, Zhang S, Zhang W, Li G, Chen Z, Zhai W, Zhao X, Pan X,
Xie Q, Zhu L. The rice HIGH-TILLERING DWARF1 encoding an
ortholog of Arabidopsis MAX3 is required for negative regula-
tion of the outgrowth of axillary buds. Plant J, 2006, 48: 687–698
[28] 王闵霞, 白玉路, 王平, 向跃武, 蔡平钟, 张志雄. 水稻 Dwarf
14(D14)基因的生物信息学分析 . 西南农业学报 . 2014, 27:
1347–1352
Wang M X, Bai Y L, Wang P, Xiang Y W, Cai P Z, Zhang Z X.
Bioinformatics analysis of D14 (dwarf 14) in rice. Southwest
China J Agric Sci, 2014, 27: 1347–1352 (in Chinese with English
abstract)
[29] Zhao J, Wang T, Wang M, Liu Y, Yuan S, Gao Y, Yin L, Sun W,
Peng L, Zhang W, Wan J, Li X. DWARF3 participates in an SCF
complex and associates with DWARF14 to suppress rice shoot
branching. Plant Cell Physiol, 2014, 55: 1096–1109
[30] Zhao L H, Zhou X E, Yi W, Wu Z, Liu Y, Kang Y, Hou L, de
Waal P W, Li S, Jiang Y, Scaffidi A, Flematti G R, Smith S M,
Lam V Q, Griffin P R, Wang Y, Li J, Melcher K, Xu H E. Desta-
bilization of strigolactone receptor DWARF14 by binding of
ligand and E3-ligase signaling effector DWARF3. Cell Res, 2015,
25: 1219–1236
[31] Soundappan I, Bennett T, Morffy N, Liang Y, Stanga J P, Abbas A,
Leyser O, Nelson D C. SMAX1-LIKE/D53 family members en-
able distinct MAX2-dependent responses to strigolactones and
karrikins in Arabidopsis. Plant Cell, 2015, 27: 3143–3159
[32] Arite T, Umehara M, Ishikawa S, Hanada A, Maekawa M, Ya-
maguchi S, Kyozuka J. d14, a strigolactone-insensitive mutant of
rice, shows an accelerated outgrowth of tillers. Plant Cell Physiol,
2009, 50: 1416–1424
[33] Ishikawa S, Maekawa M, Arite T, Onishi K, Takamure I, Kyo-
zuka J. Suppression of tiller bud activity in tillering dwarf mu-
tants of rice. Plant Cell Physiol, 2005, 46: 79–86
[34] Zhou F, Lin Q, Zhu L, Ren Y, Zhou K, Shabek N, Wu F, Mao H,
Dong W, Gan L, Ma W, Gao H, Chen J, Yang C, Wang D, Tan J,
Zhang X, Guo X, Wang J, Jiang L, Liu X, Chen W, Chu J, Yan C,
Ueno K, Ito S, Asami T, Cheng Z, Wang J, Lei C, Zhai H, Wu C,
Wang H, Zheng N, Wan J. D14-SCFD3-dependent degradation of
D53 regulates strigolactone signalling. Nature, 2013, 504:
406–410
[35] Jiang L, Liu X, Xiong G, Liu H, Chen F, Wang L, Meng X, Liu G,
Yu H, Yuan Y, Yi W, Zhao L, Ma H, He Y, Wu Z, Melcher K,
Qian Q, Xu H E, Wang Y, Li J. DWARF 53 acts as a repressor of
strigolactone signalling in rice. Nature, 2013, 504: 401–405
[36] Brewer P B, Dun E A, Ferguson B J, Rameau C, Beveridge C A.
第 1期 吴转娣等: 甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因 ScD27的克隆与表达分析 41


Strigolactone acts downstream of auxin to regulate bud outgrowth
in pea and Arabidopsis. Plant Physiol, 2009, 150: 482–493
[37] 贾昆鹏. 植物激素独脚金内酯和茉莉酸信号与光信号互作的
分子机制研究. 上海交通大学博士学位论文, 上海, 2014
Jia K P. The Molecular Mechanism of Cross Talking between
Light and Phytohormones Strigolactone and Jasmonate Signaling.
PhD Dissertation of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai,
China, 2014 (in Chinese with English abstract)
[38] Kumar M, Pandya-Kumar N, Dam A, Haor H, Mayzlish-Gati E,
Belausov E, Wininger S, Abu-Abied M, McErlean C S, Brom-
head L J, Prandi C, Kapulnik Y, Koltai H. Arabidopsis response
to low-phosphate conditions includes active changes in actin
filaments and PIN2 polarization and is dependent on strigolac-
tone signalling. J Exp Bot, 2015, 66: 1499–1510
[39] Yoneyama K, Xie X, Kusumoto D, Sekimoto H, Sugimoto Y, Ta-
keuchi Y, Yoneyama K. Nitrogen deficiency as well as phospho-
rus deficiency in sorghum promotes the production and exudation
of 5-deoxystrigol, the host recognition signal for arbuscular my-
corrhizal fungi and root parasites. Planta, 2007, 227: 125–132
[40] Lopez-Raez J A, Charnikhova T, Gomez-Roldan V, Matusova R,
Kohlen W, De Vos R, Verstappen F, Puech-Pages V, Becard G,
Mulder P, Bouwmeester H. Tomato strigolactones are derived
from carotenoids and their biosynthesis is promoted by phosphate
starvation. New Phytol, 2008, 178: 863–874
[41] Bu Q, Lv T, Shen H, Luong P, Wang J, Wang Z, Huang Z, Xiao L,
Engineer C, Kim T H, Schroeder J I, Huq E. Regulation of
drought tolerance by the F-box protein MAX2 in Arabidopsis.
Plant Physiol, 2014, 164: 424–439
[42] Ha C V, Leyva-Gonzalez M A, Osakabe Y, Tran U T, Nishiyama
R, Watanabe Y, Tanaka M, Seki M, Yamaguchi S, Dong N V,
Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, Herrera-Estrella L, Tran L
S. Positive regulatory role of strigolactone in plant responses to
drought and salt stress. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:
851–856
[43] Yamaguchi S, Kyozuka J. Branching hormone is busy both un-
derground and overground. Plant Cell Physiol, 2010, 51:
1091–1094
[44] Sun H, Tao J, Liu S, Huang S, Chen S, Xie X, Yoneyama K,
Zhang Y, Xu G. Strigolactones are involved in phosphate- and ni-
trate-deficiency-induced root development and auxin transport in
rice. J Exp Bot, 2014, 65: 6735–6746
[45] 李晓君. 甘蔗逆境相关锌指蛋白基因 ShSAP1 的功能研究. 海
南大学博士学位论文, 海南海口, 2012
Li X J. Functional Analysis of Stress Associated Zinc Finger Pro-
tein Gene ShSAP1 from Sugarcane. PhD Dissertation of Hainan
University, Haikou, China, 2012 (in Chinese with English
abstract)
[46] 阙友雄, 许莉萍, 徐景升, 张积森, 张木清, 陈如凯. 甘蔗基
因表达定量PCR分析中内参基因的选择. 热带作物学报, 2009,
30(3): 274–278
Que Y X, Xu L P, Xu J S, Zhang J S, Zhang M Q, Chen R K. Se-
lection of control genes in Real-time qPCR analysis of gene ex-
pression in sugarcane. Chin J Trop Crops, 2009, 30(3): 274–278
(in Chinese with English abstract)
[47] 谢晓娜, 杨丽涛, 王盛, 张小秋, 李杨瑞. 甘蔗 NADP 异柠檬
酸脱氢酶基因(SoNADP-IDH)的克隆与表达分析. 中国农业科
学, 2015, 48: 185–196
Xie X N, Yang L T, Wang S, Zhang X Q, Li Y Y. Cloning and ex-
pression analysis of sugarcane NADP+-dependent isocitrate de-
hydrogenase (SoNADP-IDH) gene. Sci Agric Sin, 2015, 48:
185–196 (in Chinese with English abstract)
[48] Vij S, Tyagi A K. Genome-wide analysis of the stress associated
protein (SAP) gene family containing A20/AN1 zinc-finger(s) in
rice and their phylogenetic relationship with Arabidopsis. Mol
Genet Genom, 2006, 276: 565–575
[49] Waldie T, Mcculloch H, Leyser O. Strigolactones and the control
of plant development: lessons from shoot branching. Plant J,
2014, 79: 607–622
[50] 李晓君, 武媛丽, 孔冉, 杨本鹏, 张树珍. 植物 A20/AN1 型锌
指蛋白基因功能研究进展. 生物技术通报, 2013, 29(12): 6–14
Li X J, Wu Y L, Kong R, Yang B P, Zhang S Z. Functional Research
of A20/AN1 type zinc finger protein gene in plants. Biotechnol Bull,
2013, 29(12): 6–14 (in Chinese with English abstract)
[51] Mayzlish-Gati E, De-Cuyper C, Goormachtig S, Beeckman T,
Vuylsteke M, Brewer P B, Beveridge C A, Yermiyahu U, Kaplan
Y, Enzer Y, Wininger S, Resnick N, Cohen M, Kapulnik Y, Koltai
H. Strigolactones are involved in root response to low phosphate
conditions in Arabidopsis. Plant Physiol, 2012, 160: 1329–1341
[52] Yoneyama K, Yoneyama K, Takeuchi Y, Sekimoto H. Phosphorus
deficiency in red clover promotes exudation of orobanchol, the
signal for mycorrhizal symbionts and germination stimulant for
root parasites. Planta, 2007, 225: 1031–1038