全 文 ：203
山楂黄酮超声波
辅助提取工艺参数优化研究
孙协军，李秀霞，刘雪飞，励建荣* ，吕艳芳，李 娇，王 珍，田 鑫
( 渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁省高校重大科技平台
“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州 121013)
摘 要:为了研究山楂黄酮的组成和含量，本实验以乙腈和 0.4%磷酸水溶液为流动相，建立了山楂芦丁、金丝桃苷和
槲皮素的 HPLC检测方法，采用外标法定量，以 3 种黄酮总得率为响应值，对山楂黄酮的超声波辅助提取工艺参数进
行了优化研究，并建立了山楂黄酮超声波辅助提取的数学模型。结果表明，各提取因素影响的主次顺序为:液固比 ＞
乙醇体积分数 ＞提取时间 ＞超声波功率;通过对提取工艺的研究，确定了超声波辅助提取山楂黄酮提取的最佳工艺参
数为:乙醇体积分数 90%，液固比 25.5mL /g，超声波功率 600W，提取时间为 24.9min，该工艺条件下的山楂黄酮得率为
0.0363%。芦丁、槲皮素和金丝桃苷是山楂中主要的黄酮类物质，而超声波辅助提取可以有效地从山楂中提取得到这
三种黄酮。
关键词:山楂，芦丁，金丝桃苷，槲皮素，超声波辅助提取
Optimization of extracting technique of flavonoids by
ultrasound assisted extraction method from hawthorn
SUN Xie－jun，LI Xiu－xia，LIU Xue－fei，LI Jian－rong* ，LV Yan－fang，LI Jiao，WANG Zhen，TIAN Xin
( College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Food Safety Key Lab of
Liaoning Province，Engineering and Technology Ｒesearch Center of Food Preservation，Processing
and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China)
Abstract: In order to investigate the composition and content of hawthorn flavonoids，a gradient high performance
liquid chromatography ( HPLC ) was developed for the detection of rutin，hyperoside and quercetin from
hawthorn.Acetonitrile and 0.4% phosphate solvent was used as mobile phase，external standard method was
adopted for quantification of three flavonoid yield，extraction technique of the three flavonoid yield was optimized
and the mathematical model was established.The results showed that the sequence of factors was as follows: liquid
to solid ratio ＞ volume fraction of ethanol ＞ extracting time ＞ ultrasonic power，the optimal condition for ultrasound
assisted extraction condition was that volume fraction of ethanol 90%，liquid to solid ratio 25.5mL/g，ultrasonic
power 600W，extracting time 24.9min，under the optimal extraction conditions，the flavonoid yield was 0.0363% .In
this test，it was found that rutin，hperoside ande quercetin were the main flavonoids in hawthorn，which could be
extract efficiently by ultrasound assisted method.
Key words: Hawthorn; rutin; hyperoside; quercetin; ultrasound assisted extraction
中图分类号:TS219 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2014)09－0203－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2014． 09． 036
收稿日期:2013－09－22 * 通讯联系人
作者简介:孙协军( 1969－ ) ，男，实验师，学士，主要从事食品资源开发
利用方面的研究。
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划( 2012BAD29B06 ) ; 辽宁省食
品安全重点实验室开放课题( LNSAKF2011015) 。
山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)通常是指蔷薇
科(Ｒosaceace)山楂属(Crataegus L.)植物的干燥果
实，分为山里红(Crataegus pinnatifida Bge var.Major
N.E.Br.)和 野 山 楂 (Crataegus cuneata Sieb.＆
Zucc.)［1］，其中，山里红也叫北山楂，在我国北方地区
广泛栽培，是重要的药食同源植物。黄酮类化合物、
原花青素、三帖酸等是山楂中主要的生物活性成分，
目前，从山楂中分离得到 60 余种黄酮类化合物，主
要包括以芹菜素和木犀草素为苷元的苷类以及以芦
丁、金丝桃苷和槲皮素为主的黄酮醇及氧苷类物
质［2－4］。黄酮类化合物具有降血脂［5］、降血糖［6－7］、预
防肝损伤［8－9］、抗氧化［10］及提高机体免疫力［11］等生理
活性，是山楂果实及叶片中主要的生物活性成分。
目前提取黄酮的方法主要有浸提［12－13］、超声波辅助提
取［14］、微波提取法［15］和酶法［16］等，超声波辅助提取法
是一种从植物中提取有效部分的重要方法，超声空
化作用能使细胞壁破裂从而有助于内容物的浸出，
增加了溶剂向细胞内的扩散和有效成分的溶出，超
声还有助于黄酮类物质的凝聚［17］，从而大大缩短了
204
提取时间，提高提取效率，且对被提取物质不产生破
坏作用，因而近年来被广泛用于植物有效成分的提
取研究［18］，据报道，超声波辅助提取可以提高山楂叶
及果实中黄酮的提取效率［14－19］。芦丁、槲皮素和金丝
桃苷为北山楂果实中主要含有的黄酮类化合物［20－21］，
本文以北山楂果实为实验原料，以 3 种黄酮总得率
为衡量指标，对山楂黄酮超声波辅助提取工艺进行
优化，通过本实验的研究，为北山楂果实中黄酮类化
合物的有效开发和利用提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山楂 市售，产地辽西地区;芦丁和槲皮素标准
品(纯度 ＞ 97%) 购于中国药品生物制品检定所;
金丝桃苷标准品(纯度 ＞ 98.5%) 购于宝鸡市辰光
生物科技有限公司;高效液相色谱检测所用试剂均
为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。
P680 型高效液相色谱仪 美国戴安公司;
FA2004 型电子天平 上海恒平科学仪器有限公司;
ＲE－2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ－D
(Ⅲ)型循环水真空泵 上海申光仪器有限公司;
SCIENTZ－ⅡD型超声波细胞破碎仪 宁波新芝超声
设备有限公司;PS02－AD－DI超纯水机 上海讯辉环
保科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 山楂样品预处理方法 选择整齐度良好的新
鲜山楂自来水清洗后去除果核，带皮果肉部分在
50℃热风烘干后粉碎成细果粉，全部过 40 目分样筛
后真空封装，冷藏备用。
1.2.2 超声波辅助提取方法 准确称取 5g山楂果粉
样品于 100mL小烧杯中，按照实验设计分别加入适
量的乙醇溶液，在相应的超声波功率下提取一段时
间后减压抽滤，收集滤液于 60℃减压浓缩至膏状后，
甲醇溶解并定容至 50mL。
1.2.3 液相色谱检测条件 Develosil C30(250mm ×
4.6mm，5μm)色谱柱;流动相:A 相为乙腈，B 相为
0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱，80% B ～ 60.5% B
(0～26min)，80% B平衡 4min后进下一个样品;流速
1mL /min;柱温 40℃;进样 20μL;检测波长:360nm。
1.2.4 标准曲线的绘制 各取芦丁、金丝桃苷和槲
皮素标准品 48、15 和 4.5mg，甲醇溶解并分别定容至
10mL，得到浓度分别为 4.8(芦丁)、1.5(金丝桃苷)和
0.45mg /mL(槲皮素)的 3 种标准品贮备液，分别吸取
同体积各标准贮备液，稀释为 6 个浓度梯度的标准
使用溶液，浓度分别为:芦丁，0.005、0.01、0.02、0.04、
0.08 和 0.16mg /mL;金丝桃苷，0.05、0.025、0.0125、
0.00625、0.003125、0.001563mg /mL;槲皮素，0.015、
0.0075、0.00375、0.001875、0.000938、0.000469mg /mL。
1.2.5 山楂黄酮得率的计算方法 山楂黄酮得率
(%)=(提取液中 3 种黄酮浓度总和 ×定容体积)/
(称样质量 × 100)
1.2.6 提取单因素实验设计
1.2.6.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响 在超声
波功率为 600W条件下，选取液固比为 20mL /g 和体
积分数分别为 50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶
液作为提取剂超声波辅助提取 10min，比较山楂黄酮
得率。
1.2.6.2 液固比的影响 在超声波功率为 600W 条
件下，选取体积分数为 80%和液固比分别为 10、15、
20、25、30mL /g 的乙醇溶液超声波辅助提取 10min，
比较山楂黄酮得率。
1.2.6.3 超声波功率的影响 在超声波功率分别为
450、550、650、750、850W 条件下，选取体积分数为
80%和液固比为 20mL /g 的乙醇溶液为提取剂超声
波辅助提取 10min，比较山楂黄酮得率。
1.2.6.4 提取时间的影响 在超声波功率为 600W
条件下，选取体积分数为 80%和液固比为 20mL /g的
乙醇溶液为提取剂分别超声波辅助提取 10、20、30、
40、50min，比较山楂黄酮得率。
1.2.7 提取响应面分析实验设计 为进一步确定最
佳超声波辅助提取条件和各因素的影响顺序，依据
design－expert 7.0 进行响应面实验设计，以 3 种黄酮
总得率为考察指标，以乙醇体积分数(X1)、液固比
(X2)、超声波功率(X3)和提取时间(X4)为自变量，
共设立 30 个处理组，具体实验设计见表 1。
表 1 山楂黄酮超声波辅助提取响应面实验设计
Table 1 Ｒesponse surface experiment design of
ultrasound assisted extraction of hawthorn flavonoid
水平
因素
X1 乙醇
体积分数
(%)
X2 液固比
(mL/g)
X3 超声波
功率
(W)
X4 提取
时间
(min)
－ 2 60 15 450 10
－ 1 70 20 500 15
0 80 25 550 20
1 90 30 600 25
2 100 35 650 30
2 结果与分析
2.1 HPLC分离结果和标准曲线的建立
所配制的标准溶液经 0.45μm 膜过滤后分别进
样，每个浓度进样 3 次，黄酮混合标准溶液及山楂提
取液的液相色谱图见图 1－A 和图 1－B 所示，图 2 提
取液中 3 种黄酮分别采用保留时间和 DAD光谱扫描
图(图形略)结合定性。从图 1－B 可以看出，山楂提
取液中的槲皮素色谱峰与其它色谱峰效果较好，而
芦丁和金丝桃苷没有达到基线分离，但分离度也达
到了 1.0 以上，可用于这 2 种黄酮定量分析使用。以
峰面积为横坐标，3 种黄酮浓度平均值(mg /mL)为纵
坐标，得到 3 条标准曲线，标准曲线的回归方程为:
芦丁，Y = 538.31X－0.3226(Ｒ2 = 0.9999;线性范围为
0.0005－0.16 mg /mL)，金丝桃苷，Y = 828.86X(Ｒ2 =
0.9996;线性范围为 0.0016 ～0.05 mg /mL)，槲皮素，
Y =550.85X + 0.044(Ｒ2 = 0.9997;线性范围为 0.0005
～0.015 mg /mL)。
2.2 山楂黄酮超声波辅助提取的单因素实验结果
2.2.1 乙醇体积分数对山楂黄酮超声波提取得率的
205
图 1 黄酮混合标准溶液(A)和山楂黄酮提取液(B)色谱图
Fig.1 Chromatogram of flavonoid mixture standard(A)
and hawthorn flavonoid extract(B)
影响 乙醇体积分数对山楂黄酮得率的影响如图 2
所示，乙醇体积分数对山楂黄酮提取效率的影响较
大，体积分数为 80%的乙醇黄酮得率最高，这与李宁
豫等实验结果［14］一致，此时，山楂黄酮类化合物的溶
解性最好，其次是 90%乙醇，无水乙醇和体积分数较
低的乙醇提取效果较差，分析其原因，可能是因为本
实验中山楂黄酮提取物主要以芦丁和金丝桃苷两种
黄酮苷为主，提取液中槲皮素含量相对较低，在 80%
～90%乙醇溶液中溶解性高于无水乙醇和体积分数
较低的乙醇，提取效果较好，因此选择体积分数为
80%的乙醇进行实验。
图 2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid yield
2.2.2 液固比对山楂黄酮超声波提取得率的影响
液固比对山楂黄酮得率的影响见图 3 所示，随着
液固比的增大，黄酮得率也随之增大。这主要是因
为随着液固比的增大，山楂粉末与提取液黄酮的浓
度差增大，黄酮类化合物就越容易渗透出来;当液
固比增大到一定值后，由于山楂中黄酮类化合物的
含量有限，黄酮得率的增加趋于平缓。而且，液固
比越大，溶剂的用量增加，后继处理步骤耗能增加，
导致提取成本增高，因此，确定液固比 25mL /g 为
最佳。
图 3 液固比对黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on flavonoid yield
2.2.3 超声波功率对山楂黄酮超声波提取得率的影
响 超声波功率对山楂黄酮得率的影响如图 4 所
示，功率增大到 550W时，黄酮得率已经达到顶峰，以
后随超声波功率的增加黄酮得率逐渐降低，这主要
是由于高功率的超声波产生的热效应较强，而高温
对黄酮类化合物有一定的破坏作用，又考虑到功率
越高，生产成本越高，选择超声波功率 550W为最佳。
图 4 超声波功率对黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic power on flavonoid yield
2.2.4 提取时间对山楂黄酮超声波提取得率的影
响 提取时间对山楂黄酮提取得率的影响如图 5 所
示，从图 5 看出，超声波在较短的时间内就可以达到
较高的提取效率，在 20min 时，黄酮得率最高，之后
随着时间继续增加，得率有下降的趋势，这可能是由
于提取时间过长，导致的热效应使得一些黄酮类化
合物损失，选择 20min进行以下实验。
图 5 提取时间对黄酮得率的影响
Fig.5 Effect of extracting time on flavonoid yield
2.3 响应面实验设计及结果分析
通过单因素实验，选取乙醇浓度(X1)、料液比
(X2)、提取功率(X3)和提取时间(X4)进行四因素三
206
表 3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance results
来源 平方和(× 10 －5) 自由度 均方(× 10 －5) F值 Prob ＞ F 显著性
模型 37.60 14 2.68 4.85 0.0022 ＊＊
X1 4.70 1 4.70 8.51 0.0106 *
X2 6.21 1 6.21 11.23 0.0044 ＊＊
X3 0.49 1 0.49 0.88 0.3633
X4 3.70 1 3.70 6.69 0.0206 *
X1X2 0.03 1 0.03 0.05 0.8344
X1X3 1.98 1 1.98 3.58 0.0778
X1X4 0.16 1 0.16 0.28 0.6027
X2X3 0.08 1 0.08 0.15 0.7072
X2X4 4.49 1 4.49 8.12 0.0122 *
X3X4 4.56 1 4.56 8.24 0.0117 *
X1X1 3.10 1 3.10 5.60 0.0318 *
X2X2 6.70 1 6.70 12.11 0.0034 ＊＊
X3X3 1.03 1 1.03 1.86 0.1926
X4X4 4.29 1 4.29 7.75 0.0139 *
残差 8.29 15 8.29
失拟项 4.40 10 4.40 0.57 0.7928
纯误差 3.89 5 0.78
总和 45.90 29
注:* .Prob ＞ F小于 0.05，模型或考察因素影响显著;＊＊.Prob ＞ F小于 0.01，模型或考察因素影响极显著。
水平的响应面实验，实验设计的因素、水平和实验结
果见表 2。用 Design－expert 7.0 软件对实验数据进行
多元回归拟合，得到山楂中黄酮类化合物得率的回
归方程如下:
Y = 0.0325 + 0.0014X1 + 0.0016X2 + 0.0005X3 +
0.0012X4 + 0.0001X1X2 + 0.0011X1X3 － 0.0003X1X4 +
0.0002X2X3－0.0017X2X4 + 0.0017X3X4 －0.0011X1X1 －
0.0016X2X2－0.0006X3X3－0.0013X4X4
表 2 响应面实验结果及分析
Table 2 Experimental results and analysis
of the response surface
实验号 X1 X2 X3 X4
总黄酮得率
(%)
1 － 1 － 1 － 1 － 1 0.0243
2 1 － 1 － 1 － 1 0.0253
3 － 1 1 － 1 － 1 0.0280
4 1 1 － 1 － 1 0.0309
5 － 1 － 1 1 － 1 0.0169
6 1 － 1 1 － 1 0.0260
7 － 1 1 1 － 1 0.0262
8 1 1 1 － 1 0.0308
9 － 1 － 1 － 1 1 0.0270
10 1 － 1 － 1 1 0.0269
11 － 1 1 － 1 1 0.0252
12 1 1 － 1 1 0.0276
13 － 1 － 1 1 1 0.0298
14 1 － 1 1 1 0.0339
15 － 1 1 1 1 0.0276
续表
实验号 X1 X2 X3 X4
总黄酮得率
(%)
16 1 1 1 1 0.0338
17 － 2 0 0 0 0.0284
18 2 0 0 0 0.0301
19 0 － 2 0 0 0.0226
20 0 2 0 0 0.0319
21 0 0 － 2 0 0.0308
22 0 0 2 0 0.0313
23 0 0 0 － 2 0.0269
24 0 0 0 2 0.0301
25 0 0 0 0 0.0290
26 0 0 0 0 0.0364
27 0 0 0 0 0.0325
28 0 0 0 0 0.0313
29 0 0 0 0 0.0307
30 0 0 0 0 0.0351
方差分析结果见表 3，由表 3 可以看出，模型的
F值极显著(p ＜ 0.01)，而失拟的 F 值不显著(p ＞
0.05)，模型的相关系数 Ｒ2 为 82%，说明模型拟合程
度较好，实验误差较小，该模型是合适的，因此可以
用该模型方程来分析和预测不同超声波辅助提取条
件下山楂中黄酮类化合物的得率变化。在所选的各
因素水平范围内，四个考查因素对山楂中黄酮类化
合物得率影响的顺序为:液固比 ＞乙醇体积分数 ＞
提取时间 ＞超声波功率，在所选择的超声波功率范
围内，超声功率对山楂黄酮得率没有显著影响(p ＞
0.05)。
207
从表 3 可以看出，液固比和提取时间、超声波功
率和提取时间之间存在交互作用，其响应面图和等
高线图分别见图 6 和图 7 所示。从图 6 的响应面图
可以看出，液固比和提取时间对山楂中黄酮类化合
物得率均有较大影响，且随着液固比和提取时间的
增加，黄酮得率均呈先增加后变缓的趋势，其中液固
比的影响稍大于提取时间，而超声波功率对山楂中
黄酮类化合物提取得率影响较小(见图 7)。
图 6 液固比和提取时间的响应面图
Fig.6 Ｒesponse surface graph of L /S ratio and extracting time
图 7 超声波功率和提取时间的响应面图和等高线图
Fig.7 Ｒesponse surface graph of
ultrasonic power and extracting time
通过 design expert7.0 软件拟合，得出最佳超声波
辅助提取山楂黄酮的工艺参数为:乙醇体积分数
90%，液固比 25.5mL /g，超声波功率 600W，提取时间
为 24.9min，在此优化条件下山楂黄酮得率预测值为
0.0352%，实测值为 0.0363%，与预测值的相对误差
为 3.125%，与预测结果相符。
3 结论
建立了以乙腈和 0.4%磷酸水溶液为流动相的
山楂芦丁、金丝桃苷和槲皮素的分离和定量方法，以
3 种黄酮得率为响应值，建立了超声波辅助提取山楂
黄酮的数学模型，各因素影响的主次顺序为:液固比
＞乙醇体积分数 ＞提取时间 ＞超声波功率。通过对
提取过程工艺的研究，确定了超声波提取山楂黄酮
的最佳工艺参数为:乙醇体积分数 90%，液固比
25.5mL /g，超声波功率 600W，提取时间为 24.9min，
该工艺条件下的山楂黄酮得率为 0.0363%，与预测结
果相符。
参考文献
［1］冯凤莲，张卉朱 .山楂的研究进展［J］.河北医科大学学报，
1997，18( 6) : 383－385.
［2］Melikoglu G，Mericli F，Mericli A H.Flavonoids of Crataegus
orientalis［J］.Bollettino Chinico Farmaceutico，1999，138 ( 7 ) :
209－239.
［3］刘荣华，余伯阳 .山里红叶化学成分研究［J］.中药材，
2006，29( 11) : 1169－1173.
［4］孙敬勇，杨书斌，谢鸿霞，等 .山楂化学成分研究［J］.中草
药，2002，33( 6) : 483－486.
［5］苏曼曼，于晓风，曲绍春，等 .分蘖葱头总黄酮对实验性高
脂血症大鼠血脂代谢的影响［J］.中国药理学通报，2007，23
( 12) : 1594－1597.
［6］叶希韵，张隆，沈菊，等 .山楂叶总黄酮对糖尿病小鼠糖脂
代谢的影响［J］.中草药，2005，36( 11) : 1683－1687.
［7］王勇，赵海燕 .植物黄酮类治疗糖尿病药理机制的研究进
展［J］.医学综述，2010，16( 4) : 612－615.
［8］郭菁菁，杨秀芬 .黄酮类化合物对动物实验性肝损伤保护
作用的研究进展［J］.中国药理学通报，2008，24( 1) : 5－10.
［9］李满妹，江 涛，黄杰昌，等 .知母总黄酮对溴酸钾诱发小鼠
肝损伤的保护作用［J］.中草药，2008，39( 2) : 252－255.
［10］唐瑛，罗祖友，严奉伟，等 .藤茶总黄酮对小鼠的体内外抗氧
化作用研究［J］.中国医院药学杂志，2006，26( 12) :1449－1452.
［11］阎莉，郑作文，卫智权 .广西藤茶总黄酮对正常小鼠免疫
功能的影响［J］.中国药物应用与监测，2008，5( 4) : 5－7.
［12］韩秋菊 .山楂中黄酮类化合物提取工艺条件优化［J］.化
学与生物工程，2012，29( 6) : 85－87.
［13］霍丹群，张文，李奇琳，等 .超声波法与热提取法提取山
楂总黄酮的比较研究［J］.中成药，2004，26( 12) : 1063－1065.
［14］李宁豫，韩秋菊，曹月坤 .超声辅助提取山楂黄酮的研究
［J］.陕西农业科学，2013，3: 91－93.
［15］韩秋菊 .微波辅助法提取山楂黄酮类化合物的工艺条件
研究［J］.药物分析杂志，2011，39( 14) : 8612－8614.
［16］王晓，李林波，马小来，等 .酶法提取山楂叶中总黄酮的
研究［J］.食品工业科技，2002，23( 3) : 37－39.
［17］萨燕平，彭永芳 .超声辐射提取槐花米中的芦丁［J］.云南
化工，1996，4: 25－26.
［18］郭辉，罗宇倩，章华伟，等 .响应面法优化超声波辅助提取
荷叶黄酮工艺研究［J］.中国食品学报，2011，11( 1) : 119－125.
［19］赵永福 .超声波辅助提取山楂叶总黄酮的工艺研究［J］.
安徽农业科学，2012，40( 19) : 10076－10077，10111.
［20］王珍，李秀霞，李娇，等 .高效液相色谱法测定山楂中芦
丁、金丝桃苷和槲皮素的含量［J］.食品工业科技，2013，34
( 9) : 302－305.
［21］暴凤伟，刘玉强，张振秋，等 .HPLC法测定山楂提取物中
芦丁、金丝桃苷、槲皮素的含量［J］.中华中医药学刊，2013，31
( 2) : 24－26.