全 文 ： 收稿日期：2013-01-07
基金项目：国家科技支撑计划项目(No.2007BAD07B00)
作者简介：钟娴(1989-)，女，福建三明人，硕士研究生，从事花卉生物技术方向研究。E-mail: nhzx1989@163.com
注：潘东明为通讯作者。E-mail: pdm666@126.com

漳州水仙 ZDS 基因 cDNA克隆及其表达分析
钟 娴 1,2，江琳玉 2,3，潘东明 1,2，潘腾飞 1,2，卞阿娜 1,4
（1.福建农林大学 园艺产品贮藏保鲜研究所，福建 福州 350002；2.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002；3.
龙岩市园林管理局，福建 龙岩 364000；4.漳州师范学院 生物科学与技术系，福建 漳州 363000）

摘 要：采用 RACE 技术从漳州水仙‘金盏银台’Narcissus tazetta var. chinensis 花器官总 RNA 中克隆 ZDS 的
cDNA序列，用相关软件进行序列分析，并利用实时荧光定量技术检测 ZDS基因在各水仙品种不同花器官的表
达。序列分析表明，ZDS基因 cDNA全长 2189 bp，其中包含 69 bp 5非编码区，395 bp 3非编码区，1725 bp
编码区（编码 574个氨基酸，分子量约 63.6 kDa），命名为 Ntzds （GenBank登录号: EU573238），其编码的氨
基酸序列（ACB87206.1）与喇叭水仙（CAA12062.1）、葡萄（XP_002277348.21）和温州蜜柑（ABC33728.1）
ZDS基因编码产物的相似性分别为 97%、85%和 83%。实时荧光定量 PCR分析表明，Ntzds基因在漳州水仙‘金
盏银台’、‘Minnow’、‘Fortissimo’中均有表达，且同一品种中副冠的表达量高于花瓣；随着花色的加深，其转
录水平也逐渐趋高。
关键词：漳州水仙‘金盏银台’；ζ-胡萝卜素脱氢酶；基因克隆；基因表达
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2013.02.002
中图分类号：S682.2+1；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2013)02-0097-07

Cloning and Expression of ZDS Gene from Narcissus tazetta var. chinensis
ZHONG Xian1,2, JIANG Lin-yu2,3, PAN Dong-ming1,2, PAN Teng-fei1,2, BIAN A-na1,4
(1.Institute of Postharvest Science and Technology of Horticultural Products, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou
350002, Fujian China; 2.College of Horticulture, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian China;
3.Bureau of Gardening Administration, Longyan 364000, Fujian China; 4.Department of Biological Sciences and
Biotechnology, Zhangzhou Normal University, Zhangzhou 363000, Fujian China)

Abstract: The ZDS gene was cloned from total RNA of flower in Narcissus tazetta var. chinensis
by RACE technology. The expression analysis of ZDS gene was predicted with some related software
tools, and the expression of ZDS gene in different floral organ of different varieties was analysis with
real-time PCR. The sequence analysis indicated that the length of ZDS is 2189 bp, it contains an ORF
encoding 499 amino acid residues(Mw=63.6 kDa), as well as 5 non-coding region with 69 bp and 3
non-coding region with 395 bp, named as Ntzds (GenBank accession number EU573238). Compared
with ZDSs of other plants, Ntzds amino acid sequence has 97%, 85%, 83% identity with that of
Narcissus pseudonarcissus, Vitis vinifera and Citrus unshiu respectively. Expressions of Ntzds in
petals and corona from N. tazetta var. chinensis, ‘Minnow’, ‘Fortissimo’ were investigated by
real-time qPCR. The results showed that Ntzds gene expression was different in three varieties. The
expression level in corona was higher than in petals in same variety; we concluded that the
transcription level of Ntzds was developing with the deepening of flower color.
Key words: Narcissus tazetta var. chinensis; zeta-carotene desaturase; gene cloning; gene expression


2013,42(2):97-103.
Subtropical Plant Science
第 42卷 ﹒98﹒
漳州水仙 Narcissus tazetta var. chinensis花姿秀美，花香馥郁，是我国十大传统名花之一，也是福
建省出口创汇的重要花卉之一。但就观赏植物最重要的质量指标之一花色而言，色系过于单一，主要
为白色、黄色、黄白色，远不如洋水仙丰富，这在一定程度上限制了水仙的观赏价值和经济价值。随
着分子生物学的发展，利用植物基因工程进行资源创新，弥补了因漳州水仙为三倍体无法进行实生选
种和杂交育种的不足，开创了漳州水仙品种改良的新思路[1-3]。研究表明，水仙中色素的主要成分为类
胡萝卜素[4]，其合成途径已被阐明[5-6]。ζ-胡萝卜素脱氢酶（zeta-carotene desaturase，ZDS）是类胡萝
卜素合成途径中重要的限速酶之一，其催化ζ-胡萝卜素脱氢生成整个类胡萝卜素合成途径中第一个有
色（淡黄色）分子——链孢红素[7]。水仙 ZDS 基因的克隆与分析对探讨水仙成色机理及其育种有重要
意义。在类胡萝卜素合成途径中，ZDS催化ζ-胡萝卜素向番茄红素转化[8]，进而合成类胡萝卜素。目
前，已从苹果（GBAN AF429983）、甜橙（GBAN AJ319762）[9]、葡萄柚（GBAN AF372617）[10]、番
木瓜（GBAN FJ812088）[11]、辣椒（GBAN X89897）[12]、甘薯[13]、草莓（GBAN FJ795343）[14]、小
麦[15]、喇叭水仙（GBAN AJ224683）、黄花水仙（GBAN JQ797379.1）、白花水仙（GBAN JQ797378.1）、
‘金盏银台’（GBAN EU138882）[16]、文心兰（GBAN FJ859990.1）、向日葵[17]、龙胆草[18]等植物中分
离出 ZDS基因，其 cDNA长 1.8～2.1 kb，编码 558～574个氨基酸，其编码的氨基酸序列中都有一个
特征序列，即吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶[7]。漳州水仙类胡萝卜素生物合成途径中，ZDS 基因的分
离和鉴定虽有研究，但关于该基因在不同水仙品种中具体转录水平的研究至今未见报道。开展 ZDS基
因在不同品种水仙中的转录表达研究，有利于进一步研究ζ-胡萝卜素脱氢酶在水仙花色合成中的调控
功能。本试验从漳州水仙‘金盏银台’中克隆分离出 ZDS基因，并通过荧光定量 PCR分析该基因在漳
州水仙‘金盏银台’、‘Minnow’和‘Fortissimo’等 3个水仙品种花瓣、副冠的表达。
1 材料与方法
1.1 植物材料及菌株
试材为漳州水仙‘金盏银台’、‘Minnow’和‘Fortissimo’3个品种盛花时的花瓣、副冠，液氮
速冻后-80℃保存备用。
大肠杆菌 Escherichia coli DH5α 菌株由福建农林大学园艺产品贮藏与保鲜研究所保存备用。
pMD18-T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司（Takara）。
1.2 总 RNA提取与 cDNA第一链合成
用北京百泰克公司的多糖多酚植物总 RNA快速提取试剂盒，提取漳州水仙‘金盏银台’盛花（剔除
花药、花丝和柱头）的总 RNA。1%琼脂糖凝胶电泳分析 RNA条带的清晰度、完整性，紫外分光光度
计测定 RNA的产率、纯度和浓度。所得 RNA用于 cDNA克隆和荧光定量 PCR分析。
按照 invitrogen公司的 super script® III first strand synthesis system kit合成 cDNA第一链。
1.3 基因克隆与序列分析
根据 ZDS基因家族的保守区序列设计 PCR引物，根据获得的保守区序列设计 RACE引物（表 1），
引物合成委托博尚（上海）生物技术有限公
司完成。
以漳州水仙‘金盏银台’cDNA 为模
板，进行 PCR。反应条件为：94 ℃预变性 5
min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s，35
个循环；72 ℃延伸 10 min。3-RACE反应条
件为:①94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃
45 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃延伸 10
min。②94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃
45 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃延伸 10
表 1 ZDS的 ORF和 RACE引物
引物 序列（5-3）
ZDS orf-1 ACTGCAGTGGAGCTTTTGGATC
ZDS orf-2 CATAGAACTTCCAGGCCTTGAG
ZDS rac3-1 CTGATCTTGCACTCTCGTCACCT
ZDS rac3-2 CATACATGCCCCTACCTAATGATGC
ZDS rac5-1 GTACAACTGGGCTAAGGGCAAGAG
ZDS rac5-2 CAAGTTCACCAATTTCTCCACCTCG
ZDS rac5-3 CTTGATCCAAAAGCTCCACTGCAGT
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC
注：ZDS orf-1与 ZDS orf-2为 ZDS 基因保守序列引物；ZDS rac3-1为 3-RACE
第一轮 PCR引物；ZDS rac3-2为 3-RACE第二轮 PCR引物；ZDS rac5-1
为合成 5-RACE cDNA第一链的引物；ZDS rac5-2为 5-RACE 第一轮 PCR
引物；ZDS rac5-3为 5-RACE 第二轮 PCR引物。
第 2期 钟娴,等：漳州水仙 ZDS基因 cDNA克隆及其表达分析 ﹒99﹒
min。5-RACE反应条件为:①94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃
延伸 10 min。②94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min。
PCR 产物经电泳分析后按照小量 DNA 片段快速纯化 /回收试剂盒（DNA Fragment Quick
Purification/Recover Kit）操作流程回收目的片段，用 pMD18-T（TaKaRa）试剂盒将 DNA片段直接连
到 T载体上，经冷热法转化大肠杆菌 DH5α，提取阳性克隆质粒，以过夜的菌液为模板进行菌液 PCR
检测，产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将扩增出的目的条带样品的菌液送博尚（上海）生物技术有
限公司进行序列测定。
用 DNAMAN软件进行基因片段拼接、多重序列比对；用 NCBI网站的 blastn和 blastx进行基因同
源性搜索并用 DNAMAN、MEGA软件进行同源性比对。
1.4 不同水仙品种的不同花器官 Ntzds基因的转录水平表达
1.4.1 RNA提取及 cDNA第一链的合成 用北京百泰克公司的多糖多酚植物总 RNA快速提取试剂盒的
方法分别提取‘金盏银台’、‘Minnow’、‘Fortissimo’三个水仙品种的花瓣和副冠，并以此 3 品种不同
花器官的 RNA（500 ng）为模板，按照 TAKARA公司的 SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit （Perfect Real
Time）试剂盒的说明书合成 cDNA 第一链。保存于-20℃。
1.4.2 引物设计 根据上述克隆出的漳州水仙‘金盏银台’ZDS 基因开放阅读框序列，漳州水仙‘金盏
银台’Actin（JN204912.1）为内参，结合 qRT-PCR特异性引物设计原理，在保守区域设计特异性引物（表 2）
1.4.3 荧光定量 PCR 荧光定量在 ABI PRISM® 7900HT实时荧光定量 PCR 仪上进行。以逆转录合成
的 3 个水仙品种花的 2 个部位的 cDNA（500
ng/μL）稀释 10倍作为实验样品做特异性扩增，
反应体系为 10 μL: SYBR Premix Ex TaqTM（2×）
5 μL，10 μmol/L上下游引物各 0.2 μL，cDNA
模板 1 μL，加 ddH2O至 10 μL，每样品 3次重
复。以漳州水仙‘金盏银台’Actin 基因作为内
参。PCR反应程序采用三步法：95 ℃预变性 30
s，1个循环；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环；
95 ℃ 15 s，1个循环；60 ℃ 60 s，1个循环；95 ℃
15 s。
2 结果与分析
2.1 cDNA保守区的克隆与序列分析
以漳州水仙‘金盏银台’总 RNA逆转录产物为模板，用 ZDS保守区引物做 PCR扩增反应。1%琼
脂糖凝胶中电泳结果显示，在 1200 bp左右有一条亮带，其大小与预测的基因片段基本相符，初步确定
为目的基因片段。回收产物与 pMD18-T载体连接，转化后将重组质粒进行测序。测序结果表明，插入
片段为 1199 bp。将此基因序列在 NCBI网站上进行 BLAST搜索，结果表明该序列与已报道的 ZDS基
因具有较高的相似性，最高可达 99%，可确定此片段为‘金盏银台’ZDS基因的保守区部分。
2.2 cDNA全长的获得与序列分析
以‘金盏银台’cDNA为模板，进行 3-RACE、5-RACE PCR。PCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳
检测（图 1）并测序，后利用 DNAMAN分析软件将 5-RACE、保守区 cDNA和 3-RACE核苷酸序列
进行拼接，获得含有一个完整编码区的基因序列，全长为 2189 bp，GenBank登录号为 EU573238。
用生物学软件对 EU573238序列进行分析，结果显示该基因序列开放阅读框为 1725 bp，编码 574
个氨基酸，分子量为 63.6 kDa；5端大小为 328 bp，非编码区为 69 bp；3端大小为 812 bp，非编码区
为 395 bp（图 2）。该基因命名为 Ntzds。经 BLAST对该核苷酸序列进行分析发现，EU573238序列与
陈段芬登陆的‘金盏银台’ZDS核苷酸序列（EU138882.1）、黄花水仙（JQ797379.1）相似性最高，达
表 2 Real Time PCR反应参数
基因(GenBank登录号) 特异性引物(5-3)
ACTIN（JN204912.1）
F：
CTTGACCTTGCTGGGAGAGAT
R：
GATGTCACGGACAATTTCACGC
Ntzds（EU573238）
F：
ATCAGTGCCCGTTGTATGC
R：
TGGTAGCCTTCGACATTG
注：F为上游引物；R为下游引物。
第 42卷 ﹒100﹒
99.0%；与喇叭水仙（AJ224683）相似性
达 96%；与文心兰（FJ859990.1）的相似
性达 80%。结果表明，此核苷酸序列为ζ-
胡萝卜素脱氢酶的核苷酸序列。
2.3 cDNA编码产物的同源性分析
漳州水仙‘金盏银台’Ntzds 基因开
放阅读框有 1725 bp，编码 574个氨基酸。
将此编码区氨基酸序列在 NCBI网站上搜
索，检测到此氨基酸的保守结构区域约在
62～537肽链区间，属于 Pyr-redox超基因
家族，即吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶保
守结构域，且具有该家族的特征区域。
经 BLAST 分析，该氨基酸序列（GenBank 登陆号：ACB87206.1）与陈段芬登陆的‘金盏银台’
（ABX45112.1）、黄花水仙（AFH53818.1）、白花水仙（AFH53817.1）的氨基酸序列相似性高达 99%，
与喇叭水仙（CAA12062.1）、葡萄（XP_002277348.2）和蜜柑（BAB68552.1）氨基酸序列的相似性比
较高，分别为 97%、85%和 83%，该氨基酸与其他植物也具有较高的相似性。


图 1 漳州水仙‘金盏银台’Ntzds基因 cDNA的 3-RACE(A)
和 5-RACE PCR(B)产物
注: M. DL2000 Marker; 1. 3-RACE PCR产物; 2、3. 5-RACE PCR产物

2000bp→
1000bp→
750bp→
500bp→
250bp→
100bp→
B
M 2 3

2000bp→
1000bp→
750bp→
500bp→
250bp→
100bp→
A
M 1
图 2 漳州水仙‘金盏银台’ZDS 基因 cDNA 全长序列及其编码产物
注：ATG 为起始密码子；TAA 为终止密码子。
第 2期 钟娴,等：漳州水仙 ZDS基因 cDNA克隆及其表达分析 ﹒101﹒
注：ATG 为起始密码子；TAA 为终止密码子。
通过 MEGA5.0 软件分析植物的 ZDS
编码氨基酸序列的同源关系（图 3），可以
清晰地看出物种亲缘关系近的 ZDS 编码氨
基酸序列一致性也相对较高，物种亲缘关
系远的序列一致性较低。向日葵、万寿菊
同属于菊科，亲缘关系近，因此其序列一
致性也比较高；几个中国水仙品种和喇叭
水仙同属石蒜科水仙属，遗传距离近，聚
为一支，其序列的一致性也高达 97%。番
木瓜和柑橘的 ZDS 氨基酸也具有较高的一
致性。
2.4 不同水仙品种的不同花器官 Ntzds基因
的转录水平表达
根据荧光定量 PCR目的基因 Ntzds和内参基因 Actin的 Ct值，利用 2-ΔΔ（Livak)方法进行不同水
仙品种的不同花器官 Ntzds基因的相对定量计算。以漳州水仙‘金盏银台’花瓣为对照，其 Ntzds基因
的表达量定义为 1个单位，对其他品种的花器官 Ntzds基因的表达量进行定量分析(图 4)。从图 4可以
看出，Ntzds基因在不同水仙品种的不同花器官中都得到稳定表达。在同一水仙品种中，副冠 Ntzds基
因的表达量均高于花瓣；随着颜色加深，Ntzds 基因的表达呈增长趋势（图 5）；在不同品种之间，
‘Fortissimo’ Ntzds基因在盛花中的表达量高于漳州水仙‘金盏银台’和‘Minnow’。

3 讨论
植物类胡萝卜素是许多植物花和果实中的主要色素[19]，对园艺植物的观赏性有重要影响[20]，其合
成途径是类异戊二烯合成途径中的重要分支[18,21]。现已证实，ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）在植物的花
和果实显色中发挥重要作用，是植物色彩从无到有的关键酶之一[22-23]。本研究成功克隆了漳州水仙‘金
盏银台’ZDS 基因的全长，通过 DNAMAN 对其氨基酸同源性比对和建树分析可知，漳州水仙‘金盏
银台’Ntzds基因与‘黄花水仙’、‘白花水仙’、喇叭水仙有很高的同源性，与文心兰、向日葵也有
较高的同源性，进一步说明 ZDS基因在植物中可能是高度保守的。
尽管漳州水仙‘金盏银台’Ntzds基因与前人在‘黄花水仙’、‘白花水仙’、喇叭水仙中获得的
ZDS 基因有很高的同源性，但在感官上可知，这些水仙品种的花色存在较大差别：‘金盏银台’为白
色花瓣、黄色副冠；‘Minnow’花瓣、副冠均为黄色系，但副冠的黄色较深；‘白花水仙’花瓣、副冠则全
图 3 不同植物 ZDS同源关系
**
**
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1 2 3 4 5 6
花器官
相
对
表
达
量
图 4 三水仙品种不同花器官的 Ntzds 基因转录水平
注：横坐标 1. ‘金盏银台’花瓣；2. ‘金盏银台’副冠；3. ‘Minnow’花瓣；4. ‘Minnow’
副冠；5. ‘Fortissimo’花瓣；6. ‘Fortissimo’副冠；** 表示差异极显著(P<0.01)。
图 5 三个水仙品种的花
第 42卷 ﹒102﹒
为白色；喇叭水仙以及其他洋水仙如‘卡萨塔’、‘粉红魅力’、‘戴纳尔’等品种的色系更加丰富，
有黄色花瓣、橙色或橘红色的副冠等。从水仙花色类胡萝卜素生物合成途径中可知，ZDS 作为限速酶
在花色的形成中起了不可忽视的作用[11,18]，因此，研究 ZDS基因在不同水仙品种中的表达量将有助于
揭示水仙花色形成与花色合成酶 ZDS的表达水平之间的动态关系，进而为水仙花色研究提供新思路。
本试验采用荧光定量 PCR 技术，分别对 ZDS 基因在漳州水仙‘金盞银台’、‘Minnow’、‘Fortissimo’
不同部位的表达进行分析，认为 ZDS基因表达量随颜色的加深有上升的趋势，与陈段芬等[16]的研究结
果相反，其原因可能是陈段芬等采用的是半定量 PCR方法，此方法与高准确性、高特异性的荧光定量
PCR 相比，较容易产生交叉污染、假阳性，从而导致结果的不确定性[24-25]。但从类胡萝卜素的合成途
径可知，ZDS催化ζ-胡萝卜素形成番茄红素，进而在其他酶作用下形成不同的色素[5-8,22-23]，因此可以
推断色素的累积、颜色的加深与番茄红素合成量有关，而番茄红素合成又与 ZDS基因的表达量有着密
切的联系，此结论在番木瓜[11]、番茄[26]果肉颜色研究中已得到验证。
花色的形成是个复杂的过程，合成物质受多种酶的共同协调作用。在获得了 ZDS在三个水仙品种
中均有表达的同时，我们也看出三者间存在表达差异，推断 ZDS在水仙花色形成中主要起协同作用。
如漳州水仙‘金盏银台’，其白色花瓣与黄色副冠 ZDS的表达量不大，但颜色差异较大，可能是 PDS、
CRTISO酶在花瓣、副冠中的作用差异导致的。现有报道指出，番茄红素的合成是 PDS、ZDS、CRTISO
三个酶共同作用的结果[27-28]，因此推测，在白色花瓣中虽然 ZDS基因有表达，但 PDS、CRTISO没有
起作用而无法形成番茄红素，但在副冠中其他酶有作用，最终导致颜色上的差异；而在‘Minnow’中，
PDS、CRTISO与 ZDS共同参与了番茄红素的合成。另外，漳州水仙‘金盏银台’、‘Minnow’与‘Fortissimo’
三个品种间，‘Fortissimo’ZDS基因的表达量明显高于漳州水仙‘金盏银台’与‘Minnow’，引起差异的
原因可能有以下两点：（1）从花型看，‘Fortissimo’与漳州水仙‘金盏银台’、‘Minnow’相比，其花
大而厚，花色的形成需要更多花色化合物的累积，从而促进 ZDS基因的表达；（2）从亲缘关系来看，
漳州水仙‘金盏银台’、‘Minnow’属于法国水仙，而‘Fortissimo’属于喇叭水仙，所属类别不同，由于
长期的遗传和变异导致三者间的差异。为验证上述推测，未来工作中将结合 PDS、CRTISO以及类胡萝
卜素合成途径中其他相关酶基因的研究，进一步探索 ZDS在水仙花色中的作用以及品种间其表达差异
与花色的关系。
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