全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
柿 胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与序列分析
赵大球 周春华 薛银芳 陶俊
(扬州大学园艺与植物保护学院,扬州 225009)
摘 要: 通过对柿 胡萝卜素脱氢酶 (Ca rotene desa turase, ZDS)基因的克隆及序列分析, 旨在为改良柿果实品质奠定
基础。根据 GenBank中其他植物 ZDS基因的保守序列设计了两条 PCR扩增引物, 以柿果实中所提取的 RNA为模板, 采用
RACE技术扩增出一条约为 500 bp的条带。经过序列分析,其长 578 bp,不含内含子, 具有部分开放阅读框 ( 177 bp)、终止密
码子 ( TGA )和 po ly( A )尾巴 ( 11 bp),共编码 58个氨基酸。该序列及其所编码的氨基酸与其他植物 胡萝卜素脱氢酶基因均
具有较高的同源性。该基因已提交 GenBank数据库, 登录号为 GU075728。
关键词: 柿 类胡萝卜素 胡萝卜素脱氢酶基因 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis ofCarotene Desaturase
Gene in Persimmon(D iospyros kaki L)
Zhao Daqiu Zhou Chunhua XueY infang Tao Jun
(College ofH orticulture and P lantProtection, Yangzhou University, Yangzhou 225009)
Abstrac:t To lay the foundation fo r im prov ing the qua lity o f pers imm on fru it, carotene de sa tu ra se ( ZDS) gene w as cloned
from persimm on. Tw o PCR p rim e rs w ere des igned acco rd ing to conserva tive sequence o f ZDS gene in o the r p lants repo rted in G en
Bank. To ta lRNA o f pe rsimm on fruit as tem pla te, a 500 bp fragm entw a s am p lified according to RACE techno logy. Sequence analy
sis show ed tha t the fragm en t w as 578 bp and en coded 58 am ino ac ids. H om o logy ana ly sis show ed that bo th nucleo tide and am ino
ac ids sequence shared h igh sim ila rities w ith ZDS genes cloned from other plants. Th is gene had been subm itted to G enB ank data
base w ith GU075728.
Key words: Persimmon(D iospyros kak i L. ) Caroteno id C aro tene desaturase gene C lon ing Sequence ana ly sis
收稿日期: 20100915
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30771491) ,江苏省博士后科学基金项目 ( 0901055C ),中国博士后科学基金项目 ( 20100471401)
作者简介:赵大球,男,硕士研究生,研究方向:园艺植物分子生物学; Em ai:l daq iuzhao@ 126 com
通讯作者:陶俊,男,博士,教授,博士生导师,研究方向:园艺植物栽培生理与分子生物学; Em ai:l taojun@ yzu edu cn
柿 (D iospyros kak i L)属于柿科柿属,广泛栽培
于东亚地区,如中国、韩国和日本等国 [ 1, 2]。据粮农
组织统计, 2008年全球柿产量达 3627万 ,t其中中
国占 699% ,韩国占 119%, 日本占 67%。柿果实
中富含类胡萝卜素,对于果实的颜色、营养及医疗价
值起着十分重要的作用 [ 3]。关于植物类胡萝卜素
生物合成的主要途径及其相关酶类目前已经研究得
较为清楚 [ 4 - 6 ]。在其生物合成途径中, 胡萝卜素
脱氢酶 ( ZDS)催化 胡萝卜素脱氢生成链孢红素继
而进一步脱氢生成番茄红素,是类胡萝卜素生物合
成过程中的关键酶之一, 在植物果实颜色和花色发
育过程中起着重要作用。
目前,该基因已从甘薯 [ 7]、中国水仙 [ 8]、番茄 [ 9]
和小麦 [ 10]等植物中得到分离,其 cDNA长 18- 21
kb, 编码 558- 574个氨基酸, 而在柿中报道较少。
本研究以柿果实中所提取的 RNA为模板, 克隆了
ZDS基因的 3端 cDNA片段, 为 cDNA全长的获得
以及采用遗传调控手段提高柿果实的品质奠定了
基础。
1 材料与方法
11 材料
111 植物材料 本试验选用 小方柿 为材料,
于 2008年果实发育第 I期 ( 8月 15日 )采自扬州大
学园艺与植物保护学院果园。将离体果实带回实验
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
室后, 迅速分离果皮、果肉, 液氮速冻后置于 - 80
冰箱中保存备用。
112 主要试剂 Ecoli DH5感受态细胞、LA
Taq DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、dNTP、DNase
、pMD18T载体、DNA凝胶回收试剂盒、DL2000、
DN ase I、3FullRACE Core Set K it、BamH和 H in d
均购自 TaKaRa公司; 其它生化试剂和常规试剂
均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。
引物和 cDNA序列由上海生工生物工程技术服
务有限公司合成及测定。
12 方法
121 总 RNA的提取与纯化 柿果实总 RNA的
提取参照徐昌杰等 [ 11]所报道的 CTAB法,并稍加改
良。总 RNA的纯化采用 DN ase试剂盒,具体操作
参照其说明书进行。
122 引物设计与 PCR扩增 根据 GenBank中其
他植物 ZDS基因的保守序列设计 1对引物用于
PCR扩增。外引: 5TTTGGCTCTGTTTCCATCTT3;
内引: 5TTCTTCCTCGCTGGCTCA3。其扩增反应
参照 3FullRACE Core Set K it说明书进行,退火温
度为 52 ,延伸时间均为 60 s。
123 PCR扩增产物的克隆和鉴定 目的片段的
回收参照 TaK aRa公司的 DNA凝胶回收试剂盒说
明书进行, 再将其连接到 pMD18T的克隆载体上,
转化大肠杆菌 DH5感受态细胞,提取质粒 DNA后
采用 BamH 和 H in d 进行双酶切鉴定, 最后选取
阳性克隆用于测序。
124 序列分析 利用生物学软件 DNAMAN 50
对核苷酸及其所编码的氨基酸序列进行分析, 同时
根据氨基酸序列来做分子系统进化树; 核苷酸及氨
基酸序列的同源性比对在互联网上的线工具 NCBI
B last
[ 12]上完成。
2 结果与分析
21 RNA检测与基因片段的扩增
由图 1可以看出,柿果实中所提取的总 RNA效
果较好, 其电泳条带锐利,将所提取的总 RNA样品
于紫外分光光度计上测定,紫外吸收值 A260 /A280 =
192, A 260 /A 230 = 210,说明提取的 RNA纯度较高,
表明在提取过程中无 RNA降解现象, 可用于后续
试验。
图 1 柿果实的总 RNA的凝胶电泳图
以柿果肉中所提取的 RNA为模板, 采用 3
RACE方法进行 3端 cDNA片段的扩增, 并用 1%的
琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析。由图 2可以
看出扩增得到一条约为 550 bp的条带。
MDL 2000; 13RACE产物
图 2 通过 RACE方法获得的 cDNA片段
22 克隆与重组质粒的鉴定
将回收的电泳片段与克隆载体 pMD18T连接,
经转化到 DH5感受态细胞后摇菌, 再提取质粒进
行双酶切鉴定。图 3表明, 载体插入目的片段大小
约为 550 bp,与扩增结果一致,说明目的片段克隆成
功, 再选取成功质粒送生工测序。
M. DL 2000; 1. 3 RACE产物
图 3 cDNA片段的酶切鉴定
23 序列分析
测序结果显示,该基因 cDNA片段长 578 bp, 具
有部分开放阅读框 ( 177 bp)、终止密码子 ( TGA )、3
非编码区 ( 401 bp)和 po ly( A )尾巴 ( 11 bp) ,共编码
58个氨基酸。该基因已提交 GenBank数据库,登录
号为 GU075728(图 4)。
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2011年第 2期 赵大球等 :柿 胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与序列分析
推导氨基酸序列标示于相应核苷酸之下,其余为非编码区; * 表示终止密码子
图 4 ZDS基因核酸序列及推断的氨基酸序列
24 同源性比对
应用 NCBI B last对该序列及其所编码的氨基酸
序列进行分析, 结果显示, 得到的片段与其他物种
ZDS基因具有较高的同源性,如核苷酸序列与胡萝
卜 ( DQ222430)核苷酸序列的同源性达 83%, 与柑
橘 ( EU983282)、苹果 ( AF429984)的同源性达 80% ,
与温州蜜柑 ( DQ309869)的同源性均达 78%; 而其
所编码的氨基酸序列与苹果 (AAQ04224)氨基酸序
列的同源性达 77%、与麻疯树 ( ACT87979 )的同源
性达 76% ,与辣椒 ( CAA61985)、柑橘 ( ACH 67607)、
脐橙 ( CAC85667)、温州蜜柑 ( ABC33728)的同源性
均达 73%以上。由此可推测该片段是 ZDS基因,并
将其命名为 DkZDS。
25 分子系统进化分析
应用 DNAMAN 50等生物软件对柿 ( ACZ024
40)、苹果 ( AAQ04224)、麻疯树 ( ACT87979 )、辣椒
( CA A61985)、柑橘 ( ACH67607)、脐橙 ( CAC85667)、
温州蜜柑 (ABC33728)等植物 ZDS基因的氨基酸序列
进行分子系统进化分析。结果 (图 5)显示,温州蜜柑
和脐橙先聚为一类,两者相聚后再与柑橘聚为一类,
然后与麻风树、苹果核辣椒相聚,最后才与柿相聚。
图 5 柿果实 ZDS基因氨基酸序列与其他植物的进化树
3 讨论
类胡萝卜素是自然界中广泛分布的一类色
素,是许多花和果实中的主要色素, 用以吸引昆
虫、鸟类或其他动物来帮助授粉和传播种子,其组
成成分多样且具有许多生理活性,在植物体中, 类
胡萝卜素对园艺植物的观赏性和经济价值均起着
重要的作用 [ 13 - 16]。袁冰等 [ 17 ]发现柿果皮和果肉
中的类胡萝卜素组成成分大体相同, 均主要由玉
米黄质、隐黄质、胡萝卜素组成, 果皮中的类
胡萝卜素总含量约是果肉中的 6- 11倍。究竟是
什么造成了两者之间的差异, 还需要从分子水平
上作进一步的解释。因此, 克隆与类胡萝卜素合
成相关的基因为探索柿果实类胡萝卜素合成的调
控机理打下了基础。
RACE技术是根据已知序列扩增获得未知序列
的 PCR技术,是获得完整 cDNA 5和 3端的有效手
段之一,但要成功应用该项技术有一定的难度 [ 7]。
本研究从柿果实中成功地分离了 ZDS基因的 3端
序列,而 5端部分的扩增一直未成功, 可能与所设
计引物的特异性以及基因自身结构存在一定的关
系, 因此要获得柿 ZDS基因的 cDNA全长序列还需
要进一步的研究。本研究所获得的部分序列对于继
续克隆 cDNA全长序列和改良柿果实的品质具有重
要的意义。
参 考 文 献
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