全 文 ：市售当归药材的高效液相色谱指纹图谱研究
王　巍 , 沙　明 , 何　凡
(辽宁中医学院 ,辽宁 沈阳　 110032)
摘要:目的: 建立当归药材的 HPLC指纹图谱 ,为当归药材的规范化种植及质量标准的建立提供试验依据。方法:采用高
效液相色谱法 ,以阿魏酸为参照 ,建立 17个不同地区市售当归药材指纹图谱。结果: 在选定的色谱条件下 ,得到当归药材
指纹图谱 ,标定出 6个共有峰 ,并与不同色谱条件下得到的指纹图谱进行比较。 同时对含当归药材的中成药建立指纹图
谱 ,检出当归药材的共有峰。 结论:用该方法建立当归药材指纹图谱 ,对当归药材进行质量控制是可行的。
关键词: 当归 ;　指纹图谱 ;　高效液相色谱法
中图分类号: R284. 1　　文献标识码: A　　文章编号: 1008-0805( 2004) 11-0741-02
Studies on HPLC Fingerprints of Angelica s inens is on Sale
WAN G W ei, SHA M ing , HE Fan
(Liaoning College of TCM Shenyang 110032, China )
Abstract: Objective: To establish th e HPLC fingerprint of Angelica sinensis and provide the method to establish the
quality standa rd and to regula te the ag riculture fo r Angelica sinensis. Methods: The ferulic acid w as used as inte rnal
standa rd compound, the HPLC method was used to establish the fing erprint o f 17 ba tches of Angelica sinensis in differ ent
r eg ions on sale. Results: We goe t the fing erprints o f Angelica sinensis under the selec ted spectrum condition, which
sh ow ed six public peaks. and then com pared with the fing erprints under different spectrum condition. As same time , the
fing erprints of Chinese Pa tent Medicines which included Angelica sinensis show ed th e public peaks. Conclusion: This
method established the fing erprints o f Angelica sinensis, prov ided the r easonable and reliable method for qua lity cong tro l
of Angelica sinensis.
Key words: Angelica sinensis;　 Fingerprint;　 HPLC
　　当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis ( Oliv ) Diels的干
燥根 [1] ,味甘、辛、温 ,归肝、心、脾经 ,具有补血、活血、调经止痛、
润肠通便的作用 ,在临床上应用十分广泛。 由于药材来源不同、产
地不同、采收加工不同 ,造成了不同地区销售的当归药材质量之间存
在较大的差异 ,严重影响了临床疗效。 因此 ,建立一种切实可行
收稿日期: 2004-03-22;　修订日期: 2004-08-21
作者简介:王　巍 ( 1979-) ,女 (汉族 ) ,辽宁昌图人 ,现为在读硕士研究生 ,
主要从事中药质量分析工作 .
的方法以控制当归药材的内在质量势在必行。
本研究收集了 17个不同地区市售当归药材 ,对其进行
HPLC法分析 ,建立指纹图谱 ,以期为当归药材的质量控制提供
切实可行的方法 ,为当归的规范化种植及其质量标准的建立提供
实验依据。
1　仪器与材料
超声波清洗机 ( 33KHz /250W) (上海必能信有限公司 ) ; LC-
6A高效液相色谱仪 (日本岛津公司 );中北色谱工作站 (大连化物
所 ) ; SPD-6AV可见—— 紫外检测器 (日本岛津 (下转第 742页 )
(上接第 740页 )化学物理研究所 );流动相为甲醇 -水 ( 65∶ 35) ;
流速为 1 ml /min;检测波长为 273 nm [1]。
2. 2　对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品适量 ,精密称定 ,加甲
醇使溶解 ,并稀释定容 ,制成每 1 ml含丹皮酚 0. 5 mg的溶液 ,作
为对照品溶液。
2. 3　供试品及阴性对照溶液的制备 精密吸取新伤逐瘀定痛合
剂 10 ml,置 100 ml容量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,静置。取上清
液 ,经 0. 45μm微孔滤膜过滤 ,即得供试品溶液。同法制成牡丹皮
阴性对照溶液。
2. 4　标准曲线制备 精密称取丹皮酚对照品 19. 8 mg ,置 25 m l
容量瓶中 ,加甲醇溶解并定容 ,即得对照品溶液。精密吸取该对照
品溶液 0. 02, 0. 04, 0. 06, 0. 08, 0. 10, 0. 12 ml分别置 10 ml容量
瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀。 分别精密吸取 10μl溶液进样 ,
测定峰面积。以丹皮酚对照品浓度 X (μg /ml)为横坐标 ,峰面积 Y
为 纵坐标 ,建 立线 性回 归方 程: Y = 4 973 304. 473X +
527. 000 000 9( r= 0. 999 9) ,结果表明丹皮酚含量在 1. 584～
9. 504μg /ml范围内具有良好的线性关系。
2. 5　精密度实验 取同一对照品溶液重复进样 5次 ,进样体积
10μl,测定峰面积 ( 16 097, 15 936, 16 123, 16 144, 16 081) ,峰面
积的 RSD为 0. 5%。
2. 6　加样回收率的测定 取已知含量的样品 5份 ,分别加入不同
体积的丹皮酚对照品溶液 ,按上述方法测定 ,平均加样回收率为
101. 9% (RSD= 1. 2% ,n= 5)。
2. 7　重复性实验 在上述色谱条件下取同一样品 5份 ,分别进行
测定 ( 37. 51, 37. 97, 38. 09, 37. 38, 37. 75μg /ml) ,丹皮酚平均含
量为 37. 74μg /ml, R SD= 0. 8%。
2. 8　样品中丹皮酚含量测定 精密取样 ,按样品处理项下方法处
理样品 ,在相同色谱条件下测定样品中丹皮酚的含量。 测定结果
见表 1。
表 1　样品中丹皮酚的含量测定结果
批号 丹皮酚含量 C /μg· ml- 1 R SD (% )
20020318 37. 74 1. 1
20020320 38. 69 0. 9
3　讨论
新伤逐瘀定痛合剂为医院制剂 ,由于原质量标准 (泰州医院
制剂规范 1999: 275)相对简单 ,为了进一步有效控制该制剂质
量 ,笔者以牡丹皮中的主要成分丹皮酚为测定对象 ,采用 HPLC
法进行含量测定。 本实验方法简便快捷 ,无干扰 ,灵敏度高 ,准确
性好 ,实用可靠 ,可作为该医院制剂质量标准重新制订的参考。
参考文献:
[1 ]　尹　萌 ,梁宪扬 . HPLC法测定牡丹皮及脑震宁冲剂中丹皮酚的含
量 [ J ].西北药学杂志 , 2001, 16(2) : 55-55.
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LISHIZHEN MEDICIN E AND M ATERIA M EDICA RESEARCH 2004 V OL. 15 NO. 11 时珍国医国药 2004年第 15卷第 11
(上接第 741页 )公司 )。
乙腈、甲醇为色谱纯 (天津四友生物医学技术有限公司 );磷
酸、三乙胺为分析纯 (沈阳化学试剂厂 )。
阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。
样品为海拉尔、沈阳、哈尔滨、丹东、天津、山东、云南、新疆、
陕西、广西、湖南、甘肃、广州、黑龙江、辽阳、北京、上海 17个不同
地区的市售当归药材。
2　实验方法
2. 1　色谱条件 色谱柱为 Shim-pack CLC-DOS柱 ( 6. 0 mm×
150 mm , 5μm) ;流动相为甲醇 -乙腈 -磷酸三乙胺水溶液 ( 3∶ 12
∶ 85) ;检测波长 313 nm;柱温 40℃ ;流速 1. 0 ml /min。
2. 2　对照品溶液的制备 精密称取干燥恒重的阿魏酸对照品适
量 ,加甲醇配成每 1 ml含 0. 008 58 mg阿魏酸的溶液。
2. 3　供试品溶液的制备 取各不同地区的当归药材 ,粉碎 ,过 40
目筛 ,分别精密称取药材粉末 3 g ,置具塞锥形瓶中 ,加甲醇 20
ml,超声处理 15 min,放冷 ,滤过 ,滤液定容在 25 ml量瓶中 ,溶液
经微孔滤膜 ( 0. 45μm )滤过 ,滤液作为供试品溶液。
2. 4　测定方法 分别精密吸取对照品溶液与 17个地区的供试品
溶液各 5μl,注入高效液相色谱仪 ,测定 ,得到不同地区当归药材
的 HPLC色谱图。
2. 5　方法学考察 为确定该方法的可靠性 ,本试验取甘肃地区
的当归药材 ,以阿魏酸为对照品 ,对条件稳定性、仪器精密度和
实验方法的重现性作了考察。
2. 5. 1　稳定性实验 取同一份供试品溶液 ,分别在 0, 2, 4, 6, 8,
16 h进行分析 ,考察各色谱峰相对保留时间 , R SD为 0. 04% ～
0. 78% ,结果表明实验条件在 16 h内稳定。
2. 5. 2　精密度实验 取同一份供试品溶液 ,在同一色谱条件下 ,
连续进样 5次 ,考察各主要色谱峰的相对保留时间 , RSD 为
0. 04% ～ 0. 19% ,结果表明仪器精密度良好。
2. 5. 3　重复性实验 取甘肃地区当归药材 5 g ,共 5份 ,按上述供
试品溶液制备及测定方法进行操作 ,考察各主要色谱峰的相对
保留时间 ,结果 RSD为 0. 06% ～ 0. 35% ,表明方法重复性良好。
3　结果与结论
3. 1　当归药材指纹图谱的建立 由于保留时间受到各种实验因
素的影响 ,每次实验的数据会出现不一致的现象 ,故对各个色谱
峰的峰位 ,采用相对保留时间来确定 ,以消除系统误差。
本实验以阿魏酸色谱峰为参照 ,确定其相对保留时间为 1,
计算其它主要色谱峰的相对保留时间 ,标定出 6个共有峰 ,分别
为: 0. 283 1 (± 0. 48% ) , 0. 414 4 (± 1. 95% ) , 0. 494 6 (±
1. 44% ) , 0. 688 4(± 2. 22% ) , 1. 000, 1. 164 0(± 3. 92% )。计算结
果见表 1。 指纹图谱见图 1。
结果提示各组共有峰 R SD < 5% ,表明利用该方法对当归药
材进行质量控制具有可行性。
3. 2　 目前指纹图谱技术在中药质量控制中处于起步阶段 ,包
括色谱条件尚需进行规范化 [2]。 考虑方法的普适性 ,本试验随机
选取 17个地区中 10个地区的当归药材 ,在其它条件不变的情况
下 ,采用色谱柱为 Diamonsil C18 ( 200 mm× 4. 6 mm, 5μm )柱对
其进行指纹图谱分析 ,以阿魏酸色谱峰为参照 ,标定出 6个共有
峰 ,分别为 0. 266 1(± 4. 78% ) , 0. 324 1(± 0. 08% ) , 0. 421 3(±
0. 86% ) , 0. 636 0(± 0. 10% ) , 1. 000, 1. 078 0(± 0. 05% )。指纹图
谱见图 2。
实验结果提示 ,不同色谱条件下得到的色谱峰有一定的差
别 ,考虑在建立指纹图谱体系时 ,是否要固定色谱条件。
3. 3　 建立药材指纹图谱最终是为保证疗效服务的 ,为此 ,本实
验对含当归药材的中成药进行了指纹图谱分析。 取市售中成药
消风止痒颗粒 (含有当归、荆芥、防风等 13味中药 ) ,利用该方法
建立其 HPLC指纹图谱 ,结果检出当归药材的 6个指纹峰 ,表明
可用该方法对含当归的中成药进行全面的质量控制。 指纹图谱
见图 3。
表 1　共有峰相对保留时间表
产地 不同峰号相对保留时间
1 2 3 4 5 6
海拉尔 0. 283 5 0. 406 8 0. 499 6 0. 708 6 1. 000 1. 136 2
沈阳　 0. 283 8 0. 406 8 0. 500 6 0. 684 2 1. 000 1. 132 9
哈尔滨 0. 283 1 0. 411 1 0. 500 3 0. 684 1 1. 000 1. 134 9
丹东　 0. 284 1 0. 427 3 0. 487 0 0. 708 7 1. 000 1. 233 4
天津　 0. 284 2 0. 427 9 0. 487 3 0. 708 6 1. 000 1. 234 2
山东　 0. 282 4 0. 410 1 0. 487 8 0. 666 4 1. 000 1. 136 8
甘肃　 0. 283 9 0. 408 4 0. 500 8 0. 685 3 1. 000 1. 133 1
新疆　 0. 284 3 0. 427 2 0. 486 1 0. 707 8 1. 000 1. 235 6
陕西　 0. 283 7 0. 426 9 0. 486 9 0. 708 9 1. 000 1. 223 6
广西　 0. 279 2 0. 420 5 0. 479 3 0. 695 4 1. 000 1. 235 1
湖南　 0. 282 1 0. 411 2 0. 496 1 0. 670 4 1. 000 1. 138 8
云南　 0. 282 9 0. 414 8 0. 499 8 0. 682 7 1. 000 1. 135 2
广州　 0. 284 1 0. 406 1 0. 499 1 0. 682 4 1. 000 1. 133 7
黑龙江 0. 281 6 0. 410 5 0. 495 5 0. 670 2 1. 000 1. 141 6
辽阳　 0. 283 8 0. 408 8 0. 500 9 0. 683 2 1. 000 1. 131 6
北京　 0. 282 0 0. 410 9 0. 496 0 0. 668 9 1. 000 1. 135 6
上海　 0. 284 5 0. 409 7 0. 500 7 0. 687 3 1. 000 1. 136 1
平均值 0. 283 1 0. 414 4 0. 494 6 0. 688 4 1. 000 1. 164 0
RSD(% ) 0. 48　 1. 95　 1. 44　 2. 22　 3. 92　
图 1　当归药材指纹图谱①　　　　　　图 2　当归药材指纹图谱②
图 3　消风止痒颗粒指纹图谱
虽然我国有丰富的中草药资源、大量有效方剂和中医药传
统理论的优势特色 ,但由于缺少让世人相信并能保证优质、安
全、有效、稳定、可控的中药系列质量标准规范体系 ,致使我国中
药至今未能作为药品进入国际医药市场。
目前 ,指纹图谱是国际上公认的控制中药或天然药物质量
的最有效手段 [3]。 据悉 ,国家药监局将于 2004年起 ,对所有的中
药注射剂执行指纹图谱的质控办法 [4]。因此 ,建立可操作的、规范
化的中药指纹图谱体系是中药质量控制的大势所趋。
参考文献:
[1 ]　中华人民共和国卫生部药典委员会 .中国药典 ,Ⅰ 部 [S ] .北京:化学
工业出版社 , 2000: 101-102.
[2 ]　屠鹏飞 .高效液相色谱法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的
探讨 [ J ].中成药 , 2000, 22( 7): 516-516.
[3 ]　聂　晶 ,田颂九 ,王国荣 ,等 .中药指纹图谱的研究现状 [ J] .中草药 ,
2000, 31( 12): 881-884.
[4 ]　肖树雄 ,林伟忠 .中药现代检验新技术 [M ].广州:羊城晚报出版社 ,
2003.
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时珍国医国药 2004年第 15卷第 11期 LISHIZHEN M EDICIN E AND M ATERIA MEDICA RESEARCH 2004 V OL. 15 NO. 11