全 文 ：中国农业大学学报　2003 , 8(3):1～ 6
Journal of China Agricultural University
三叶草 、猪屎豆和含羞草植物根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP
分析和数值分类研究
①
刘晓云1, 2　陈文新1
(1.中国农业大学 生物学院 ,北京 100094;2.西南林学院 ,昆明 650024)
摘　要　采用 16S rDNA PCR-RFLP分析和表型数值分类 , 对分离自三叶草(Trifolium)、猪屎豆(Crotalaria)和含羞草
(Mimosa)3属植物的根瘤菌进行了分类研究。16S rDNA PCR-RFLP 分析表明 , 在 80%的相似性水平上 , 67 株待测
菌株和18株参比菌株归属到慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、土壤杆菌属(Agrobac-
terium)和根瘤菌属(Rhizobium)与中华根瘤菌属(Sinorhizobium)4 个系统发育分支。进一步对其中 56 株待测菌株和
14 株参比菌株进行表型性状数值分类研究 , 在 84%的相似性水平上 , 得到 6个独立的类群:群Ⅰ 、Ⅳ和Ⅵ 为新群 , 没
有与参比菌株聚在一起;群Ⅱ包含慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum);群Ⅲ含根瘤菌属(Rhizobium)2 个已知
的代表菌株;群Ⅴ含土壤杆菌属(Agrobacterium)2 个已知种的代表菌株。以上结果表明 , 分离自这 3 属植物的根瘤
菌菌株具有表型和遗传型多样性 ,同时新发现分离自三叶草的根瘤菌的慢生和中慢生菌株;分离自含羞草的根瘤
菌的慢生菌株和分离自猪屎豆的根瘤菌的快生菌株 , 此项研究也进一步证实这两种研究方法在菌株归群上的一
致性。
关键词　根瘤菌;16S rDNA PCR-RFLP分析;数值分类
中图分类号　Q 939.3　　　　文章编号　1007-4333(2003)03-0001-06　　　　文献标识码　A
16S rDNA PCR-RFLP analysis and numerical taxonomy for rhizobia
Isolated from Trifolium , Crotalaria and Mimosa
Liu Xiaoyun1 , 2 , Chen Wenxin1
(1.College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094 , China;
2.College of Southwest Forestry, Kunming 650024 , China)
Abstract　Sixty-seven strains isolated from the root nodules of Trifolium, Crotalaria and Mimosa in comparison with
18 reference strains were analysed by 16S rDNA PCR-RFLP.At the similarity level of 80%, the examined strains
were shown to belong to Bradyrhizobium, Agrobacterium , Mesorhizobium, Rhizobium and Sinorhizobium.The tested
56 strains and 14 reference strains were also studied by numerical taxonomy.Six clusterswere formed at the similarity
level of 84%, among which there are three new clusters , cluster Ⅰ , cluster Ⅳand cluster Ⅵ , in which there are no
recognized type strains.ClusterⅡ includs strain of Bradyrhizobium japonicum , cluster Ⅲ includs two type strains of
species of Rhizobium, cluster Ⅴ might be Agrobacterium.The results showed that these examined strains distributed in
many rhizobial genera , showing a great diversity of rhizobia symbioses with above mentioned legumes.We also dis-
covered that slow growers and moderate slow growers of rhizobia form symbiosis with Trifolium , slow growers with
Mimosa and fast growers with Crotalaria .
Key words　rhizobia;16S rDNA PCR-RFLP;numerical taxonomy
　　根瘤菌的现代分类采用多相分类方法 ,即采用
多种分类技术对分类结果进行比较 ,获得各个分类
结果的一致性 , 最终确定研究对象的分类地位 。
16S rDNA PCR-RFLP 分析和表型特征数值分类用
于对大数量的根瘤菌菌株进行初步分群 ,种属关系
及种的地位确定还需要做 16S rDNA全序列分析和
① 　收稿日期:2002-10-15
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39730010)
作者简介:刘晓云 , 博士研究生;陈文新 , 中科院院士 ,教授 , 博士生导师 , 主要从事生物固氮与细菌分类研究 , E-mail:wenxin-
chen@263.net
DNA-DNA杂交及G+C%mol测定等研究。根瘤菌
资源的不断挖掘和新技术的使用促进了根瘤菌分类
的研究 ,已由 1984年的 2属 4种增加到 2002年的 7
属34种[ 1] 。
三叶草属(Trifolium)的白三叶(T .repens)是重
要的豆科牧草 ,可作饲料 、绿肥 、堤岸防护草种 、草坪
以及蜜源和药材等用[ 2] 。猪屎豆属(Crotalaria)植物
是重要的经济作物[ 3] , 含有吡咯烷类生物碱
(pyrrolizidine alkaloids),不少种类可供药用 ,生物活
性较强 ,又是较好的水土保持植物 。含羞草属(Mi-
mosa)植物可做覆盖植物[ 4] ,有的种类全草可供药
用。
本研究通过对车轴草属(Trifolium)、猪屎豆属
(Crotalaria)和含羞草属(Mimosa)3属植物的根瘤菌
16S rDNA PCR-RFLP 分析和表型特征数值分类研
究 ,初步划分了这 3属植物根瘤菌的种群关系并确
定其系统发育地位。
1　材料和方法
1.1　菌株
共选择待测菌株 67株 ,参比菌株 18株 。待测
菌株宿主为红三叶草(Trifolium pratense)、白三叶草
(T.repens)、草莓三叶草(T .fragiferum)、猪屎豆
(Crotalaria pallida)、含羞草(Mimosa pudica)和无刺
含羞草(M.invisa),分别采自江西 、湖北 、云南 、安
徽 、四川和浙江等省 。
1.2　16S rDNA PCR-RFLP分析
DNA的提取和 16S rDNA的 PCR扩增均参考文
献[ 5] ,选用 4 种限制性内切酶 Alu Ⅰ 、Hae Ⅲ、Msp Ⅰ
和HifⅠ ,取适量PCR扩增产物分别用4种内切酶进
行消化 ,消化产物在含 EB的3%的琼脂糖凝胶板上
水平电泳 ,电压为 150 V ,时间为 3 h 。4种酶切电泳
图谱在 UV 下检查 、拍照。最后根据胶上的条带的
有无 ,转换成“1”和“0”进行数值聚类 ,用简单匹配系
数法(Ssm)计算各菌株间的相似性 , 平均连锁法
(UPGMA)生成聚类树状图 。
1.3　表型特征数值分类
进行表型特征聚类分析菌株共 70株 ,其中待测
菌株 56株 ,参比菌株 15株 。共测定性状 128个:
(1)惟一碳源的利用 , 共测定了 45 种碳源:己二酸 、D-
苦杏仁苷 、D-阿拉伯糖 、D(+)-阿糖醇 、葡萄糖酸钙 、丙二酸
钙 、糊精 、半乳糖醇 、内消旋赤藓醇 、果糖 、D-(+)-半乳糖 、葡
萄糖 、肌醇 、菊糖 、乳糖 、苹果酸钠 、麦芽糖 、D-甘露糖 、松三
糖 、密二糖 、丙酮酸盐 、棉子糖 、鼠李糖 、D-核糖 、水杨苷 、乙
酸钠 、柠檬酸钠 、甲酸钠 、马尿酸钠 、琥珀酸钠 、D-山梨糖醇 、
山梨糖 、淀粉 、蔗糖 、丁香酸 、酒石酸钠 、海藻糖 、香草酸 、木
糖 、D-精氨酸 、DL-天冬酰氨 、甘氨酸 、L-甲硫氨酸 、DL-脯氨
酸 、L-苏氨酸。
(2)惟一氮源的利用 , 共测定了 14 种含氮化合物:L-苏
氨酸 、DL-丙氨酸 、L-精氨酸 、L-(+)天冬氨酸 、L-胱氨酸 、D-
谷氨酸 、L-(+)谷氨酸 、L-亮氨酸 、L-异亮氨酸 、L-赖氨酸 、L-
甲硫氨酸 、L-苯丙氨酸 、L-苏氨酸 、D-缬氨酸。
(3)对抗生素的抗性测定 , 对氨苄青霉素 、氯霉素 、卡那
霉素 、新霉素 、多粘霉素 、红霉素和链霉素等 7 种抗生素 , 采
用 5、50、100 和 300 μg·mL-1 4 种浓度测定。
(4)对染料及化学药物的抗性测定:采用盐酸吖啶 、俾
士麦棕 、溴百里酚蓝 、刚果红 、藻红 、龙胆紫 、亚甲蓝 、甲基绿
和中性红等 9 种染料和脱氧胆酸钠和亚硝酸钠 2 种化学药
品。根据不同染料的溶解特性 , 将其溶解并加入 YMA 培养
基中使终浓度为 0.1%。
其他为:(5)耐盐性测定;(6)耐酸碱性试验;(7)生长
温度范围测定;(8)过氧化氢酶试验;(9)脲酶测定;(10)
L-苯丙氨酸脱氨酶测定;(11)氧化酶测定;(12)BTB 产酸
产碱反应;(13)3-酮基乳糖的产生;(14)石蕊牛奶反应;
(15)亚甲蓝还原反应;(16)耐尔蓝还原反应;(17)硝酸盐
还原反应;(18)肉汤生长反应试验。
测定方法均参考文献[ 6] ;性状编码 、聚类方法
均按文献[ 6] 。平均连锁法聚类得出聚类分析树
状图。 　
2　结　果
2.1　16S rDNA PCR-RFLP分析
85株菌的菌号 、宿主植物名称及 16S rDNA PCR
-RFLP 分析聚类结果见图 1。
供试菌在 80%的相似性水平上归属到 4大群
(即系统发育分支)中 ,除了 91X13 和 USDA194 以
外 ,已知种的参比菌株均按各个属归群 ,群还可再分 ,
亚群可作为初步划分的种群 。
群Ⅰ的 25 株菌中有 22株未知菌与参比菌株
USDA110 、B15和 USDA6聚在一起 ,说明该群归属于
慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)系统发育分支 ,测试
菌株宿主来源于白三叶草 、草莓三叶草 、猪屎豆和含
羞草 4种植物 。群内在 90%的相似性水平上构成 4
个独立的亚群 ,亚群 1和亚群 2中有参比菌株 ,而亚
群 3和亚群 4中没有参比菌株 。
群Ⅱ的 28株菌中 22 株未知菌与参比菌株 US-
DA2370 、162K68 、127K17 、CFN42 、2048和USDA205聚
2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 农 业 大 学 学 报 2003 年
图 1　85株根瘤菌的 16S rDNA PCR-RFLP分析结果聚类树状图
Fig.1　Dendrogram constructed based on 16S rRNA PCR-RFLP analysis
3第 3 期 刘晓云等:三叶草 、猪屎豆和含羞草植物根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP分析和数值分类研究
在一起 ,说明该群归属于根瘤菌属(Rhizobium)和中
华根瘤菌属(Sinorhizobium)系统发育分支 ,测试菌株
宿主也为白三叶草 、草莓三叶草 、猪屎豆和含羞草 4
种植物 ,群内在 90%的相似性水平分为 2个独立的
亚群 ,亚群 1为根瘤菌属 系统发育分支 ,亚群 2 为
中华根瘤菌属系统发育分支。其他 2株菌未成群。
群Ⅲ有 22 株菌 ,未知菌与参比菌株 IAM13129
和 IAM12048聚在一起 ,说明该群归属于土壤杆菌属
(Agrobacterium)系统发育分支 ,测试菌株宿主为草莓
三叶草 、猪屎豆 、含羞草和无刺含羞草。
群Ⅳ有 7 株菌 , 2株未知菌与参比菌株 A-IBS 、
6 、ZP2213 、NZP2227和 NZP2234 聚在一起 ,说明该群
归属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)系统发育分
支 ,测试菌株宿主仅为草莓三叶草 。
其余有2株菌 CCBAU65209和 CCBAU65186a 在
此相似性水平上未成群。以上属群划分的结果十分
清楚 ,说明 16S rDNA PCR-RFLP分析法是一种比较
好的划分属群的方法 。
2.2　数值分类
70株菌的菌号 、宿主植物名称及表型性状聚类
结果见图 2。供试菌在 80%相似性水平上分为 6个
主要类群 。
群Ⅰ有6株菌 ,宿主为猪屎豆和草莓三叶草 ,其
中没有参比菌株 ,与 16S rDNA PCR-RFLP分析聚类
结果群 Ⅰ慢生根瘤菌的亚群 3较一致 ,可能为一个
新的分类单元。
群 Ⅱ有 7 株菌 , 6 株未知菌与参比菌株 US-
DA110聚在一起 ,说明该群可能为慢生大豆根瘤菌
种群 ,测试菌株宿主为白三叶草 、猪屎豆和含羞草 ,
该群也位于 16S rDNA PCR-RFLP分析聚类结果群
Ⅰ慢生根瘤菌属 。
群Ⅲ有 6株菌 ,4株未知菌与参比菌株 162K68
和 CFN42聚在一起 ,测试菌株宿主仍为白三叶草 、
猪屎豆和含羞草 ,该群的菌株分散位于 16S rDNA
PCR-RFLP 分析聚类结果的群 Ⅱ根瘤菌属 和中华
根瘤菌属的亚群 1。
群Ⅳ有4株菌株 ,宿主为白三叶草 、草莓三叶草
和含羞草 , 没有参比菌株 , 该群也位于 16S rDNA
PCR-RFLP 分析聚类结果的群 Ⅱ中的亚群 1 ,可能
为一个新的分类单元 。
群Ⅴ有 15 株菌 , 12 株未知菌与参比菌株
IAM13129和 IAM12048聚在一起 ,宿主为白三叶草 、
猪屎豆 、含羞草和无刺含羞草 ,该群位于 16S rDNA
PCR-RFLP 分析聚类结果的群 Ⅲ土壤杆菌属 。
群 Ⅵ有 3株菌 ,宿主为白三叶草 、草莓三叶草和
猪屎豆 ,其中没有参比菌株 ,该群也位于 16S rDNA
PCR-RFLP 分析聚类结果的群 Ⅲ土壤杆菌属 ,可能
为一个新的分类单元 。其他 29 株菌在此相似水平
上未成群。
3　讨　论
本研究分离自三叶草的根瘤菌全部归群 ,分别
归属于根瘤菌的 3个系统发育分支 ,分别为快生根
瘤菌属 、中华根瘤菌属 、中慢生根瘤菌属和慢生根瘤
菌属系统发育分支;而分离自猪屎豆的根瘤菌分散
于根瘤菌属和慢生根瘤菌属 2个系统发育分支;分
离自含羞草的根瘤菌也分散于根瘤菌属(Rhizobium)
和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)。以上结果表明 ,
三叶草 、猪屎豆和含羞草这 3属植物的根瘤菌存在
很大的遗传多样性和表型多样性 。
本研究新发现分离自三叶草的根瘤菌的慢生和
中慢生菌株;分离自猪屎豆的根瘤菌的快生菌株和
分离自含羞草的根瘤菌的慢生菌株。分离自三叶草
的根瘤菌的研究资料不多 ,1974年 ,在《伯杰氏细菌
鉴定手册》第 8版中 ,确定为三叶草根瘤菌(Rhizobi-
um trifolii),主要是以宿主范围为依据来对根瘤菌进
行分类[ 8] 。1984 年 , Jordan 在《伯杰系统细菌学手
册》[ 9]中 ,根据 Graham 的数值分类结果将三叶草根
瘤菌定为豌豆根瘤菌的 1个生物型(Rhizobium legu-
minosarum bv.trifolii),近年对其分类研究未见新的
报道 。根据前人的研究 ,分离自猪屎豆的根瘤菌具
有慢生和快生根瘤菌菌株[ 10 , 11] ,至今分离自猪屎豆
的根瘤菌只确定了 1个种 ,为结瘤甲基杆菌(Methy-
lobacterium nodulans)[ 4] ,该种能利用甲醇生长 ,是目
前报道惟一能与豆科植物结瘤的甲基杆菌属的种。
目前对于分离自含羞草根瘤菌的分类研究不多 ,只
确定了 1个生物型 R.etli bv.mimosae[ 12] 。在今后的
研究中 ,这3种植物根瘤菌的种属关系还有待进一
步研究 ,对归于土壤杆菌(Agrobacterium)系统发育分
支的菌株尚需要经过固氮基因(nif)或结瘤基因
(nod)杂交和结瘤实验作进一步确认是否为根瘤
菌 。
16S rDNA PCR-RFLP 分析一般用于根瘤菌属
群的划分 ,而表型特征聚类分析一般用于种群的划
分 ,从 2种方法对这 3 种植物根瘤菌的属群和种群
划分的结果 ,可以看出大多数的菌株归群是相互一
4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 农 业 大 学 学 报 2003 年
图 2　70 株根瘤菌的数值分类树状图
Fig.2　Dendrogram showing the phenotypic similarities among the isolates and strains
5第 3 期 刘晓云等:三叶草 、猪屎豆和含羞草植物根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP分析和数值分类研究
致的 。有些菌株 ,在 16S rDNA PCR-RFLP 分析中聚
群而在数值分类中未聚群 ,这与 2种方法存在的差
异有关。表型特征的测定受菌株的生长和培养等条
件影响 ,在不同的生长时期有不同的特征表现 ,因此
要求在对数生长时期取菌 ,以取得测定标准的一致
性 ,但在实际操作中 ,不能达到完全一致;再者测定
用的药品质量也直接影响结果的判断 ,在判断菌株
是否生长也存在一些主观因素 。而在 16S rDNA
PCR-RFLP 分析中 ,由于供试菌株数量较大 ,酶切
的电泳图谱受电压 、电流的影响 ,条带会产生一些歪
斜 ,在不同的凝胶板上 ,电泳迁移率不能达到完全一
致 ,在比对各个菌株的相同分子量的条带时 ,会产生
一些不可避免的误差 ,这些都影响结果的读取 ,因此
需要采用其它方法对这些菌株做进一研究。
对根瘤菌种群的划分与其宿主的关系 ,研究工
作者非常重视。因为传统的分类是以宿主范围作为
划分种群的依据 。本研究以这 3种植物根瘤菌的归
群为依据 ,考察了根瘤菌种群的划分与宿主和根瘤
菌采集地域的相互关系 ,发现它们三者之间并无直
接关系 ,但是也存在一些问题值得思考 。由 16S rD-
NA PCR-RFLP 分析结果来看 ,来自同一宿主植物
的根瘤菌有的可归在同一类群 ,有的可归在不同的
类群 ,三叶草根瘤菌分别归在 3个类群中 ,含羞草根
瘤菌归在 2个类群中 ,猪屎豆根瘤菌也归在 2个类
群中;而来自不同宿主植物的根瘤菌可归在同一类
群 ,如部分三叶草 、猪屎豆和含羞草 3种植物根瘤菌
都归在慢生根瘤菌属 。说明三叶草 、猪屎豆和含羞
草根瘤菌具有遗传多样性 ,同时说明根瘤菌种的划
分与宿主没有专一关系 。来自于江西 、湖北 、安徽 、
四川和浙江等 5省的菌株 ,因生态条件差异不是很
大 ,从分类结果分析看不出有什么大的影响 ,云南的
根瘤菌菌株在归群上表现出一些特殊性 ,发现分离
自云南的根瘤菌都有快生菌株 ,几乎没有慢生菌株 ,
是否与云南特殊的自然环境有关系 ,有待今后研究。
参　考　文　献
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