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接种根瘤菌对台湾相思生长和抗旱能力的影响



全 文 :云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University,2013,28 (4) :517 - 522 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 - 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2013 - 02 - 21 修回日期:2013 - 03 - 10 网络出版时间:2013 - 07 - 03 15∶ 05
* 基金项目:国家林业公益行业研究专项 (201104034) ;国家自然科学基金项目 (31260175) ;云南省高校干热河谷植
被恢复创新团队;国家林业科技推广项目 (2011-35) ;云南省重点学科森林保护学 (XKZ200905) ;云南
省高等学校森林病虫害综合治理教学团队。
作者简介:沙桦欣 (1987 -) ,女,云南曲靖人,在读硕士研究生,主要从事资源微生物的研究。
E-mail:shxin520@ foxmail. com
**通信作者Corresponding author:伍建榕 (1963 -) ,女,福建清流人,博士,教授,硕士生导师,主要从事资源微
生物及森林病理学的教学与科研工作。E-mail:wujianrong63@ yahoo. com. cn
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20130703. 1505. 201304. 517_012. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 - 390X (n). 2013. 04. 012
接种根瘤菌对台湾相思生长和抗旱能力的影响*
沙桦欣1,伍建榕1**,马焕成2,周利平2,王 芳2,张东华1
(1. 西南林业大学 林学院,云南省高校森林灾害预警控制重点实验室,云南 昆明 650224;
2. 国家林业局,西南地区生物多样性保育重点实验室,云南 昆明 650224)
摘要:干热河谷地区是西南地区生态环境最脆弱的地区之一,而豆科树种是该地区能天然更新的少数树种之
一,共生的根瘤菌及其与树种耐旱性的关系值得研究。本研究选取能进行共生固氮的台湾相思树种与野外分
离到的相思树种根瘤菌进行共生结瘤试验,并进行干旱模拟实验,通过生物量测定,显微结构观察,揭示该
地区台湾相思树种干旱条件下的生长规律,并对能够与相思树种共生结瘤的根瘤菌进行分子鉴定和多样性分
析,为发掘优良的根瘤菌种质资源提供理论依据。结果发现,在各 PEG 质量浓度梯度下,与根瘤菌共生结瘤
的台湾相思幼苗比未接种过根瘤菌没有结瘤的台湾相思幼苗表现出更强的耐旱能力;通过分子鉴定得出,15
株供试菌株分别属于快生根瘤菌属 (Rhizobium)、中慢根瘤菌属 (Mesorhizobium)和慢生根瘤菌属 (Bradyrhi-
zobium) ,说明干热河谷地区台湾相思树种根瘤菌有着较为丰富的多样性。因此推论台湾相思与根瘤菌形成共
生系统有助于其在干热河谷生存和天然更新。
关键词:干热河谷;台湾相思;耐旱性;根瘤菌;多样性
中图分类号:Q 939. 114 文献标志码:A 文章编号:1004 - 390X (2013)04 - 0517 - 06
Inoculation of Rhizobia Strains Enhance the Growth
and Drought Tolerance of Acacia confusa
SHA Hua-xin1,WU Jian-rong1,MA Huan-cheng2,
ZHOU Li-ping2,WANG Fang2,ZHANG Dong-hua1
(1. The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province,College of Forest,
Southwest Forest University,Kunming 650224,China;2. The Key Laboratory of Biodiversity Conservation
in the Southwest China,State Forestry Administration,Kunming 650224,China)
Abstract:The Dry-hot Valley is the most ecological vulnerable areas in southwest China. Legumes
trees are the few trees that can survival and naturally regenerate in the area. The relevance of rhizobia
symbiosis to drought tolerance of legume needs further study. Rhizobia that were isolated from wild
nodule of Acacia richii were inoculated onto the same host seedlings. When the nodules were ob-
served,the seedlings were subjected into drought experiment with different PEG mass concentration
gradients. The biomass measurement and microscope observation were carried out,in order to under-
stand the growth performance of Acacia confusa and mycrobial symbiont under drought stress. The
16sRNA sequence detect was also carried out to identify the species of strains,which may help for
screening the potential superior strains. The result indicated that seedlings with inoculation had higher
drought tolerance than control with no inoculation. 16sRNA sequence detection proved that the selected
15 strains belong to Rhizobium,Mesorhizobium and Bradyrhizobium respectively,indicating it has a
rich diversity of nodulation strains that can form symbiosis with A. confusa in dry hot valley. Thus it is
inferred that natural regeneration and survival of A. confusa may be relevance to symbiosis with nodula-
tion strains.
Key words:dry-hot valley;Acacia confusa;drought tolerance;rhizobia;diversity
干热河谷地区是生态环境最为脆弱的地区之
一,也是我国生态建设的重点和难点。中国干热
河谷面积约 3. 2 万 km2[1 - 2],主要分布在云南省、
台湾省西北部、海南省西南部、四川省西南部的
金沙江河谷地带,其中西南干热河谷是我国西南
横断山脉地区具有特殊地理环境和自然气候的区
域,分布最广,面积最大。由于受地理位置、地
形深切、大气环流以及焚风效应的影响,具有土
壤瘠薄、植被稀疏、热量充足、干湿季分明、水
土流失严重等特点,是我国典型的生态脆弱带和
特殊环境生态系统类型之一[3]。台湾相思
(Acacia richii)是多年生豆科 (Leguminosae)木本
植物,生长快,耐瘠薄,具根瘤,能固氮,可改
良土壤,木材用途广等特性,是荒山荒地造林的
先锋树种,已逐渐成为云南干热河谷地区的主要
造林树种[4 - 5]。干热河谷地带由于其干旱、高温、
土壤瘠薄等立地条件的限制,决定了在该地区造
林工作的特殊性和艰巨性。该研究对干热河谷地
区台湾相思树种的抗干热及根瘤菌的多样性进行
研究,为发掘优良的根瘤菌种质资源和提高干热
河谷地区造林成活率提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 台湾相思树种幼苗培育
采自云南干热河谷地区元江、元阳、元谋、
东川等地自然生长的相思树种种子,作为本研究
的实验材料。
1. 1. 2 根瘤的采集与保存
选取干热河谷元江、元阳、元谋、东川等地
台湾相思树种的适当生育期,用小铲挖去根部土
壤,用剪刀从植株根部 (侧根)上剪下生长着的
根瘤,放入装有硅胶的试管中,带回实验室置入
4℃冰箱里以备进行根瘤菌的分离培养[6]。
1. 1. 3 根瘤菌的分离、培养及菌种保存
将野外干热河谷地区台湾相思树种饱满、圆
润的根瘤采回,在 4℃冰箱中冷藏 1 周,用流水
冲洗 20 min,在 70% ~ 75% 的酒精中表面消毒
30 ~ 50 s,无菌水漂洗 1 次,又用 2%的次氯酸钠
消毒 20 min,用无菌水冲洗 4 ~ 5 次,再以 0. 1%
的升汞溶液消毒 10 ~ 15 min,最后用无菌水冲洗
5 次。取灭菌的培养皿 3 ~ 4 个,每皿加灭菌水
0. 5 mL,将以上根瘤放入第 1 皿中,用灭菌玻棒
捣碎,静置 30 min使组织内细菌流入水中配成悬
浮液,用接种环从第 1 皿内移植 2 ~ 3 环到第 2 皿
内,充分混合后再移植到第 3 皿,依次稀释到最
后一皿。将熔化的 YMA (根瘤菌培养基)倒入每
个皿中,使培养基与菌悬液混匀,冷却后翻转培
养皿在 30℃培养箱培养,直到分离得到纯菌落。
本试验液体培养基采用不加琼脂的酵母汁甘露醇
液体培养基 (YMB)进行培养,并将分离纯化后
的菌株保存于 YMA斜面培养基上,置 4 ℃冰箱中
保存备用。
1. 1. 4 供试菌株
分离自野外采集台湾相思树种根瘤的根瘤菌
进行接种[7],见表 1。
1. 1. 5 台湾相思营养液配方
共生培养采用无氮营养液,其配方为:甘露
醇 10 g,磷酸二氢钾 0. 2 g,七水合硫酸镁 0. 2 g,
氯化钠 0. 2 g,二水合硫酸钙 0. 2 g,碳酸钙 5 g,
蒸馏水 1 000 mL,pH为 7. 0 ~ 7. 2 。
1. 2 方法
1. 2. 1 台湾相思树种子无菌种苗的培育
种子均采用 5%高锰酸钾溶液浸泡 24 h 消
毒后,用无菌水清洗 3 次,将种子均匀撒于经
121 ℃灭菌 1 ~ 1. 5 h 蛭石和建筑沙各占 1 /2 混
合均匀的基质中萌发培养[8],10 ~ 15 d 后幼苗
萌发。
815 云南农业大学学报 第 28 卷
表 1 干热河谷相思树种结瘤及根瘤菌分离情况
Tab. 1 Dry-hot valley Acacia species nodulation and Rhizobium separation
根瘤编号
nodule No.
数量
number of
nodule
形状
shape of
nodule
大小 /mm
size of
nodule
颜色
color of
nodule
着生点
attachment
region
采集地
collection
locations
菌株号
strain No.
1 + + + 珊瑚椭圆 1 ~ 4 红褐色 侧根 元江 M-01
2 + + + 珊瑚椭圆 2 ~ 3 淡黄色 侧根 元江 M-02
3 + + + 珊瑚椭圆 1 ~ 4 淡红色 侧根 元江 M-03
4 + + + 珊瑚椭圆 1 ~ 3 肉红色 侧根 元阳 M-04
5 + + + 珊瑚椭圆 2 ~ 4 红褐色 侧根 元阳 M-05
6 + + + 珊瑚椭圆 3 ~ 4 红褐色 侧根 元阳 M-06
7 + + + 珊瑚椭圆 1 ~ 2 红褐色 侧根 元阳 M-07
8 + + + 珊瑚椭圆 3 ~ 4 淡黄色 侧根 东川 M-08
9 + + + 珊瑚椭圆 2 ~ 3 红褐色 侧根 东川 M-09
10 + + + 珊瑚椭圆 3 ~ 4 淡褐色 侧根 东川 M-10
11 + + + 珊瑚椭圆 2 ~ 3 淡褐色 侧根 东川 M-11
12 + + + 珊瑚椭圆 2 ~ 3 红褐色 侧根 元谋 M-12
13 + + + 珊瑚椭圆 1 ~ 3 淡黄色 侧根 元谋 M-13
14 + + + 珊瑚椭圆 3 ~ 4 红褐色 侧根 元谋 M-14
15 + + + 珊瑚椭圆 2 ~ 3 淡褐色 侧根 元谋 M-15
1. 2. 2 根瘤菌的接种试验
将台湾相思种子培养成无菌苗,待小苗出现
第 1 片真叶即可接入经摇床振荡培养至混浊的根
瘤菌菌液,每株苗木浇灌菌液 10 mL,同时以未
添加接种剂的材料作为对照试验,观察接瘤情况。
1. 2. 3 接种根瘤菌的台湾相思生物量测定
在接种根瘤菌前先称量幼苗鲜重,然后接种
根瘤菌,共生培养 6 个月后,检查根瘤菌结瘤情
况,并再次称取鲜重,比较其增加量,即:
鲜重增加率 = (处理后鲜重 - 处理前鲜
重) /处理前鲜重 × 100%。
1. 2. 4 台湾相思共生结瘤后干旱模式试验
根瘤菌共生接种结瘤后,用聚乙二醇 6 000
(PEG 6 000)人工模拟干旱条件[9 - 10],采用不同
质量浓度的 PEG,即 0,5%,10%,20%,30%
等 5个水平,每个水平设 4个重复,使各个水平的
渗透势分别为 0, - 0. 342, - 1. 137, -4. 066,
-8. 767 bar,进行模拟抗旱试验,并设不接根瘤
菌为对照 (CK)。培养第 4 天和第 8 天时,观察
幼苗的生长情况,统计苗木枯死的株数。
1. 2. 5 台湾相思共生结瘤形态及显微结构观察
将共生培养后形成的根瘤切成约 0. 5 cm的小
块,用 FAA固定液固定 24 h后,经一系列酒精脱
水,石蜡包埋,旋转切片机连续切片,厚度 10 ~
12 μm。切片干燥好后用番红固绿对染,再用中
性树胶封片,光学显微镜观察并照相。
1. 2. 6 台湾相思根瘤菌菌种分子鉴定
将分离到的根瘤菌进行 DNA 提取,然后用
16S rRNA进行扩增测序,开展分子鉴定,PCR反
应条件:95℃ 预变性 5 min,95℃ 变性 1 min,
54℃退火 1 min,72℃延伸 2 min,共 35 个循环,
最后 72℃延伸 10 min。取 PCR产物 5 μL于 1%琼
脂糖凝胶电泳 (电压 100 V)30 min,放置于凝胶
成像系统中检测照相。
1. 3 数据处理
采用 SPSS 13. 0 软件对试验数据进行方差分
析,采用 Excel 2007 进行数据统计和作图。
2 结果与分析
2. 1 台湾相思接种根瘤菌共生结瘤的形状和大小
台湾相思接种处理的 15 个菌株经 300 d 共生
培养后,全部能够正常形成根瘤 (图 1) ,但根瘤
的形状和大小相差较大。根瘤形状有珊瑚状、三
分枝、二分枝和杆状等 4 类。其大小与分枝数呈
正相关,可能与根瘤形成的时间有关系,时间越
长,分枝越多,重量越大。从野外挖掘的大根瘤
均呈珊瑚状的事实看,只要时间足够长,最后均
能发育成珊瑚状。
2. 2 台湾相思根瘤的显微结构观察
通过显微观察,根瘤尽管外形不同,但解剖
结构基本一致。横切面呈近椭圆形,由皮层、维
管束和含菌细胞区组成。含菌细胞多松散分布在
915第 4 期 沙桦欣,等:接种根瘤菌对台湾相思生长和抗旱能力的影响
维管束内侧,这些细胞着色较深,已被根瘤菌侵
染,内含大量的根瘤菌体。在含菌细胞之间未着
色的细胞为不含菌细胞。维管束分布在皮层内侧,
含菌细胞和不含菌细胞外侧见 (图 2)。
2. 3 台湾相思根瘤菌的分子鉴定
为了进一步了解云南干热河谷与台湾相思共生
的根瘤菌的种类,通过 16S rRNA 序列分析发现
(表 2) ,这 15株菌分别属于快生根瘤菌属 (Rhizo-
bium)、中慢根瘤菌属 (Mesorhizobium)和慢生根
瘤菌属 (Bradyrhizobium)等 3 个属。从相似性来
看,中慢根瘤菌属有 4 个种,它们分别是 M. hua-
kuii,M. gobiense,M. plurifarium,M. silamurunense;
快生根瘤菌属有 2个种,它们分别是 R. endophytic-
um,R. leguminosarum;慢生根瘤菌属3个种,它们
分别是 B. liaoningense,B. pachyrhizi,B. canar-
iense,B. lablabi。这一方面说明干热河谷与台湾相
思形成共生的根瘤菌的种类很多,另一方面也说明
台湾相思与根瘤菌之间的选择性不是很强。
表 2 根瘤菌的 16S rRNA序列分析结果
Tab. 2 The rhizobial analysis of 16S rRNA series
菌株号 strains No. 近源菌 closely related 相似性 /% similarity
M-01 Mesorhizobium huakuii IAM 14158 (T) (D12797) 99. 65
M-02 Mesorhizobium gobiense CCBAU 83330 (T) (EF035064) 99. 05
M-03 Bradyrhizobium liaoningense 2281 (T) (AF208513) 99. 70
M-04 Bradyrhizobium liaoningense 2281 (T) (AF208513) 97. 37
M-05 Bradyrhizobium pachyrhizi PAC48 (T) (AY624135) 99. 56
M-06 Mesorhizobium amorphae ACCC 19665 (T) (AF041442) 98. 48
M-07 Bradyrhizobium liaoningense 2281 (T) (AF208513) 99. 72
M-08 Bradyrhizobium canariense BTA-1 (T) (AJ558025) 99. 35
M-09 Rhizobium endophyticum CCGE2052 (T) (EU867317) 99. 50
M-10 Rhizobium leguminosarum USDA 2370 (T) (U29386) 99. 76
M-11 Rhizobium leguminosarum USDA 2370 (T) (U29386) 97. 38
M-12 Mesorhizobium plurifarium LMG 11892 (T) (Y14158) 98. 02
M-13 Bradyrhizobium lablabi CCBAU 23086 (T) (GU433448) 97. 75
M-14 Mesorhizobium silamurunense CCBAU 01550 (T) (EU399698) 99. 08
M-15 Rhizobium leguminosarum USDA 2370 (T) (U29386) 98. 76
025 云南农业大学学报 第 28 卷
2. 4 接种根瘤菌对台湾相思生长的影响
接种根瘤菌对台湾相思生长有促进作用。经
方差分析发现接种菌株的植株其生物量 (鲜重)
与未接种的对照相比均达到了极显著差异 (P <
0. 01) (图 3)。说明此 15 株根瘤菌均能与台湾相
思树种形成共生系统,对台湾相思树种生物量有
明显的促进作用。
2. 5 台湾相思共生结瘤后对渗透胁迫的响应
用 PEG溶液模拟渗透胁迫,在不同质量浓度
PEG 溶液中,台湾相思幼苗在 2 d 内,其叶片多数
保持新鲜状态,部分出现萎蔫。第 4 天时,PEG处
理浓度为 0 的苗木均生长正常,PEG 处理浓度为
5% ~30%的各浓度梯度下,CK组的相思树幼苗均
有 70%的苗木出现枯死,而与根瘤菌共生接瘤组
的相思树幼苗仅有 40%的苗木开始枯死;到了第 8
天,PEG处理浓度为 0的苗木均生长正常,与根瘤
菌共生接瘤组的台湾相思树种幼苗在 PEG 处理浓
度为 5%,10%,20%,30% 时 分 别 有 40%,
30%,20%,10%的苗木依然生长正常,而 CK 组
的相思树幼苗均全部枯死 (见表 3)。
表 3 台湾相思共生结瘤后 PEG胁迫苗木生长情况
Tab. 3 Acacia symbiotic nodulation PEG stress seedling growth
时间
time
ρ (PEG)/%
0 5 10 20 30
接瘤
nodulation
CK 接瘤
nodulation
CK 接瘤
nodulation
CK 接瘤
nodulation
CK 接瘤
nodulation
CK
第 4天
the 4th
day
正常
normal
正常
normal
40%枯死
40%
withered
70%枯死
70% of
withered
40%枯死
40%
withered
70%枯死
70%
withered
40%枯死
40%
withered
70%枯死
70%
withered
40%枯死
40%
withered
70%枯死
70% of
withered
第 8 天
the 8th
day
正常
normal
正常
normal
60%以上枯死
more than
60% of withered
全部枯死
all withered
70%以上枯死
more than 70%
of withered
全部枯死
all withered
80%以上枯死
more than 80%
of withered
全部枯死
all withered
90%以上枯死
more than 90%
of withered
全部枯死
all withered
3 讨论
现多数研究是采用不同浓度的 PEG溶液作为
渗透 胁 迫 剂,对 种 子 萌 发[12 - 14]、叶 片、苗
木[15 - 16]等材料进行抗旱性研究,但具体表现原理
尚未见到报道,对其中根瘤菌生长的具体情况还
需要进一步的研究。本次试验结果表明:干热河
谷地区台湾相思树种根瘤菌对高温干热的环境条
件表现出极强的耐干热能力,供试的 15 个菌株在
用 PEG 人工模拟干热条件试验中,M-05,M-07,
M-13 菌株所接种的无菌苗生物量也达到极显著差
异,表现出较好的耐高温和高渗透性,从分子鉴
定结果得出干热河谷地区台湾相思树种根瘤菌存
在有丰富的抗逆菌株,这些豆科树种根瘤菌与寄
主都是在干热河谷地区长期适应的结果,而这些
根瘤菌菌株能在干热高温等不利条件下生存、生
125第 4 期 沙桦欣,等:接种根瘤菌对台湾相思生长和抗旱能力的影响
长并繁殖,这种特有的抗逆性的存在,从生态条
件角度来说是干热河谷地区特有的生态环境形成
了该地区豆科树种根瘤菌特有的抗逆能力,这也
是干热河谷各生态环境中逆性因素对根瘤菌长期
自然选择的结果。该研究结果对干热河谷地区林
业生产活动的提高是很有帮助的,可运用于生产
中提高该地区植被恢效率。
4 结论
(1)15 个根瘤菌株与台湾相思树种无菌苗共
生均能形成根瘤,其基本结构由皮层、维管束和
含菌细胞区组成。含菌细胞多松散分布在维管束
内侧,这些细胞着色较深,已被根瘤菌侵染,内
含大量的根瘤菌体,这与韩素芬[11]等的研究结果
一致。
(2)不同菌株处理对台湾相思树种无菌苗生
长的影响有明显促进作用,试验中 15 个菌株接种
苗的鲜重增长率均高于对照并达到极显著差异,
其中 M-05,M-07,M-13 对相思树种幼苗生长促
进作用最为显著。
(3)在不同质量浓度 PEG 胁迫试验中,共
生结瘤后的台湾相思幼苗对干旱胁迫表现出明
显的适应性。培养至第 8 天,与根瘤菌共生接
瘤组的台湾相思树种幼苗在 PEG 处理浓度为
5%,10%,20%和 30%时分别有 40%,30%,
20%和 10%的苗木依然生长正常,而未接种过
根瘤菌没有结瘤的台湾相思幼苗则全部枯死,
由此说明与根瘤菌共生结瘤的台湾相思幼苗比
未接种过根瘤菌没有结瘤的台湾相思幼苗表现
出更强的耐旱能力,根瘤菌与植株形成共生系
统后,不仅能提高植株的固氮能力,也能适当
提高植株的耐旱性。
(4)通过分子鉴定得出,15 株供试菌株分别
属于快生根瘤菌属 (Rhizobium)、中慢根瘤菌属
(Mesorhizobium)和慢生根瘤菌属 (Bradyrhizobi-
um) ,说明干热河谷地区台湾相思树种根瘤菌有
着较为丰富的多样性。
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