全 文 ：第 21卷 第 2期
Vol.21 No.2
2015年 1月
January.2015Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
*基金项目：国际科技合作项目（2010DFB33260）；北京中医药大
学创新团队项目(No.2011-CXTD-19)；北京市教委共建项目“治疗
糖尿病中药提取物活性成分筛选研究”（No.BJSJW2008001）
通讯作者：徐暾海，E-mail：thxu@yahoo.com
尖叶假龙胆Gentianella acuta (Michx.) Hulten，
别名“苦龙胆”，为龙胆科（Gentiananceae）假龙胆属
（Gentianella Moench.）植物，主要分布于我国东北及
华北地区。以全草入药，多用于蒙、藏医学中，蒙药中
称为“阿古特-其其格”，藏药中称为“桑地格”，在《中
国民族药志要》、《内蒙古植物药志》、《蒙药验方》中
均有记载。其味苦，性凉，具有清热利湿，利胆退黄，
健胃，愈伤等功效。尖叶假龙胆中主要含有[口山]酮
类、环烯醚萜类、黄酮类及少量三萜、甾体类成分[1-5]，
其中[口山]酮类成分是其主要有效成分。现代药理研
究表明，雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮具有
抗心律失常[6-7]、改善胰岛素抵抗[8]、保护缺血性脑损
伤[9-10]、抗氧化 [11]等功效，是尖叶假龙胆中的主要活
性成分。高速逆流色谱 (High-speed Countercurrent
Chromatography，HSCCC)法作为一种液-液分配色谱
技术，无需固体支撑载体，依据化合物在两相中分配
系数的不同而实现分离，避免了因不可逆吸附而造
成的样品损失、失活、变性等，具有制备量大、回收率
高速逆流色谱法分离尖叶假龙胆中
[口山]酮类活性成分*
刘洋洋1，2，3，李朋收1，2，3，李春娜1，2，3，时晓娟1，2，3，徐暾海1，2，3，刘铜华1，2，3
（1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.北京市中医养生学重点实验室，北京 100029；
3.教育部中医养生学重点实验室，北京 100029）
[摘要] 目的：建立利用高速逆流色谱法分离尖叶假龙胆中两个主要的[口山]酮类活性成分雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶
龙胆酮的方法。方法：先后采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（9：10：9：10，v/v/v/v）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6：5：6：5，v/v/v/v）
两个溶剂系统，进行梯度洗脱，对尖叶假龙胆乙酸乙酯提取物进行分离，对所得馏分用Sephadex LH-20进行纯化，所得单体利用
UV、MS和NMR数据确定其结构。结果：分离得到两个具有显著生理活性的[口山]酮类成分雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆
酮。结论：高速逆流色谱法是一种有效的分离制备尖叶假龙胆中[口山]酮类活性成分雏菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮的方法。
[关键词] 高速逆流色谱法；尖叶假龙胆；[口山]酮；雏菊叶龙胆酮；去甲雏菊叶龙胆酮
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-951X（2015）02-0026-03
Preparative Isolation of Xanthones from Gentianella Acuta by High-speed Counter-
current Chromatography
LIU Yang-yang1,2,3，LI Peng-shou1,2,3，LI Chun-na1,2,3，SHI Xiao-juan1,2,3，XU Tun-hai1,2,3，LIU Tong-hua1,2,3
（1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China; 2.Beijing Key Laboratory of Health-cultivation, Beijing 100029,
China; 3.Health-cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing 100029, China）
[Abstract] Objective: To develop a method for separation of the active ingredients bellidifolin and norswertianolin from
Gentianella acuta by high-speed counter-current chromatography. Methods: The ethyl acetate extract of Gentianella acuta was
separated by HSCCC with two-phase solvent systems composed of hexane-ethyl acetate-methanol-water (9：10：9：10 and 6：5：6：
5，v/v/v/v)，sequentially. The resulting fractions were purified by Sephadex LH-20. The structural identification of the target
compounds was performed in comparison with UV, MS and NMR data. Results: Two active ingredients bellidifolin and norswer－
tianolin were obtained. Conclusion: HSCCC is an efficient method for separation of bellidifolin and norswertianolin from Gen－
tianella acuta.
[Key words] High-speed Counter-current Chromatography (HSCCC); Gentianella Acuta; Xanthones; Bellidifolin; Norswer－
tianolin
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中药制剂与药理分析
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DOI:10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2015.02.009
Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
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高等优点。本研究利用HSCCC法，采用梯度洗脱的方
法对尖叶假龙胆中两个主要的[口山]酮类活性成分
进行了分离，为其有效成分的开发利用奠定基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 TBE-300B型高速逆流色谱仪（中国上
海同田生物技术股份有限公司）；DC-0506低温恒温
槽（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TBP-50A恒
温恒流泵（上海同田生物技术股份有限公司）；TBD-
2000紫外检测器（上海同田生物技术股份有限公
司）；LC-15C高效液相色谱仪配备柱温箱、DAD检测
器、二元泵、LC Solution工作站（日本岛津公司）；R-
215型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；核磁共振仪
（Bruker AV 500）；Agilent 1100 LC/MSD XCT plus
系统：包括在线脱气机、高压二元梯度泵、恒温自动
进样器、恒温箱、二极管阵列检测器、电喷雾接口、
1100色谱工作站（美国Agilent公司）；安捷伦6300系
列离子肼工作站（Version 6.1）；KQ-500DE型数控超
声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Millipore-
Q超纯水制备仪（法国密理博公司）。
1.2 试剂 正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、石
油醚均为分析纯（北京化工厂），高效液相所用的乙
腈均为色谱纯（美国Fisher公司），超纯水（美国Milli－
pore-Q超纯水系统）。
1.3 材料 尖叶假龙胆采自内蒙古呼伦贝尔市海
拉尔区，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴
定为尖叶假龙胆。
2 实验方法
2.1 尖叶假龙胆乙酸乙酯粗提物的制备 尖叶假
龙胆药材3.5 kg切段，依次用95%、70%乙醇浸渍提
取，提取液合并，减压浓缩至无醇味。浓缩液用水悬
浮，先用石油醚萃取，除去色素等脂溶性成分，再用
乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，置水浴锅上40℃
蒸干，得到尖叶假龙胆乙酸乙酯粗提物161.8 g，密
封，置于干燥器中备用。
2.2 HSCCC溶剂系统的选择 由于HSCCC是无需
任何固体载体支撑的液-液分配色谱技术，溶剂系统
的选择是影响HSCCC分离效果的重要因素，也是逆
流分离工作的关键。一个好的溶剂系统应该以下几
个条件：（1）样品易溶；（2）目标组分的分配系数在0.
5-2之间；（3）固定相保留率大于50%；（4）两相溶剂体
系的分层时间小于20 s[12]。由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-
水组成的溶剂体系在不同比例下具有很宽的极性范
围，适合于乙酸乙酯粗提取的分离。在多次试验的基
础上，最终筛选出正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（9：10：
9：10，v/v/v/v）作为初始分离条件，实现b部分组分的
有效分离，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6：5：6：5，v/v/
v/v）作为后续分离条件，进行梯度洗脱，在保证分离
效果的前提下，最大程度的缩短分离时间。
2.3 溶剂体系及样品溶液的配制 在分液漏斗中
分别配制两相溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水
（9∶10∶9∶10，v/v/v/v）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6 ∶
5∶6∶5，v/v/v/v），充分振摇后在室温下静置20 min，
分别取上相和下相进行超声脱气，冷却至室温，备用。
称取尖叶假龙胆乙酸乙酯粗提物150 mg，用正己烷-
乙酸乙酯-甲醇-水（9∶10∶9∶10，v/v/v/v）溶剂体系中的
上相和下相各7 mL超声溶解，备用。
2.4 HSCCC分离制备 开启恒温循环泵，设定温度
为250C，将正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（9∶10∶9∶10，v/
v/v/v）溶剂体系中的上相作为固定相，以10ml/min的
流速泵入主机管路中，待有固定相流出时，将该溶剂
体系的下相作为流动相，改用3 mL/min的流速进行
平衡，同时开启千谱工作站、检测器和主机，设置检
测波长为254 nm，正转，调节转速为800 rpm。待有流
动相流出且基线平稳时，将样品溶液注入进样圈，重
新记录色谱图，根据色谱图收集目标组分。在90 min
时，改用4 mL/min的流速泵入正己烷-乙酸乙酯-甲
醇-水（6∶5∶6∶5，v/v/v/v）溶剂体系的下相，在相同的温
度、转速和检测波长条件下，继续进行分离。
3 实验结果
3.1 HSCCC分离结果 采用正己烷-乙酸乙酯-甲
醇-水（9∶10∶9∶10，v/v/v/v）溶剂体系进行洗脱后，得到
了2个组分（Fr.1和Fr.2）。洗脱至90min时，改用正己
烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6：5：6：5，v/v/v/v）溶剂体系
进行梯度洗脱，得到4个组分（Fr.3-7）。（见图1）
3.2 雏菊叶龙胆酮的分离纯化及结构鉴定 Fr.7采
用Sephadex LH-20进行分离纯化，洗脱剂为氯仿-
甲醇（1：1），得到化合物1。利用UV、MS和NMR数据
对其进行结构鉴定，结果如下。
化合物1:为黄色针状晶体，ESI-MS m/z：275
[M+H]+，分子式为C14H10O6。紫外光谱在190-400 nm波
长范围内进行扫描，分别在234 nm、254 nm、278 nm、
334 nm波长处有最大吸收，具有口山酮的特征吸收。
1H NMR(DMSO-d6，500MHz) δ 11.92（1H，s，H-1），
6.42（1H，s，H-2），6.63（1H，s，H-4），9.73（1H，s，H-
5），7.27（1H，d，J=8.5Hz，H-6），6.66（1H，d，J=8.5Hz，
H-7），11.09（1H，s，H-8），4.05（3H，s，OCH3）。13C NMR
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（DMSO-d6，500MHz）δ 162.4（C-1），98.0（C-2），
167.6（C -3），93.5（C -4），157.9（C -4a），143.9（C -
4b），137.8（C-5），124.3（C-6），110.0（C-7），152.3
（C-8），108.0（C-8a），184.6（C-9），56.7（C-OCH3）。
以上光谱数据与文献[13，14]报道的基本一致，故鉴定为
雏菊叶龙胆酮。
图 1：尖叶假龙胆乙酸乙酯粗提物的 HSCCC分离效果图
3.3 去甲基雏菊叶龙胆酮的分离纯化及结构鉴定 分
Fr.4采用Sephadex LH-20进行分离纯化，洗脱剂为
氯仿-甲醇（1：1），得到化合物2。利用UV、MS和NMR
数据对其进行结构鉴定，结果如下。
化合物2：为黄色粉末，紫外光谱在190-400 nm
波长范围内进行扫描，分别在231nm、253nm、277nm、
333 nm波长处有最大吸收，具有口山酮的特征吸收。
ESI-MSm/z：261[M+H]+，分子式为C13H8O6。1H NMR
(DMSO-d6，500MHz) δ 12.21（1H，s，OH），11.89（1H，
s，OH），11.13（1H，s，OH），9.67（1H，s，OH），6.20（1H，
d，J=1.5Hz，H-2），6.39（1H，d，J=1.5Hz，H-4），7.22（1H，
d，J =9.0Hz，H-6），6.61 （1H，d，J =9.0Hz，H-7）。13C
NMR（DMSO -d6，500MHz）δ 162.7（C -1），98.9（C -
2），167.0（C-3），94.8（C-4），157.9（C-4a），143.4（C-
4b），137.7（C-5），124.1（C-6），109.8（C-7），152.3（C -
8），107.8（C-8a），184.2（C-9），101.6（C-8b）。以上光
谱数据与文献[15，16]报道的基本一致，故鉴定为去甲基
雏菊叶龙胆酮。
4 小 结
尖叶假龙胆中口山酮类成分雏菊叶龙胆酮和去
甲基雏菊叶龙胆酮是目前药理研究最多的成分，是
尖叶假龙胆中最主要的活性成分。本研究采用HSC－
CC对尖叶假龙胆中两个主要活性成分雏菊叶龙胆
酮和去甲基雏菊叶龙胆酮进行了快速有效的分离纯
化，建立了一套行之有效分离纯化尖叶假龙胆中雏
菊叶龙胆酮和去甲基雏菊叶龙胆酮的方法，为尖叶
假龙胆中有效成分的开发利用奠定了基础。
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(收稿日期：2014-08-18 编辑：李海洋)
*基金项目：国家自然科学基金（81274008），项目名称：中药血浆
药理方法的建立及评价研究；国家自然科学基金（30572370），
项目名称：血清与血浆药理方法对脑泰方药物化学与药效学
的对比研究
通讯作者：葛金文，E-mail：cmgjw@ton.com
血栓形成与血栓栓塞是心脑血管疾病主要病因 之一，许多严重危害人类健康的疾病，如脑血栓、心
肌梗死、弥漫性血管内凝血、肺栓塞、深部静脉血栓
等的发生发展与血栓形成密切相关。脑泰方由黄芪、
川芎、地龙等中药组合而成，具有益气活血，化痰通
络之功效，临床上常用于治疗气虚血瘀型脑梗死，疗
效显著。本研究观察脑泰方的抗血栓药理作用，探讨
脑泰方抗血栓作用的实验研究*
刘 林1，刘 羽1，王国佐2，易亚乔2，罗银河2，葛金文2
（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）
[摘要] 目的：观察脑泰方对大鼠血栓形成及凝血功能的影响，评价其抗血栓作用。方法：采用电刺激大颈静总动脉法，观察
其抗血栓作用；测定其对正常大鼠PT、APTT、TT及Fib的影响，观察凝血功能；采用酶联免疫法测定其对大鼠血浆中6-K-PGF1α、
TXB2含量的影响，观察血小板的释放功能。结果：脑泰方能明显延长血栓形成时间；升高大鼠血浆中6-K-PGF1α含量，降低血浆
TXB2含量、维持TXB2/6-K-PGF1α比值平衡；对正常大鼠PT、APTT、TT、FIB的有一定改善，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：
脑泰方具有一定的抗血栓作用。
[关键词] 血栓；凝血系统；脑梗死；脑泰方
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1672-951X（2015）02-0029-03
Experimental Research on Anti-thrombotic Activation Effects of Naotaifang
LIU Lin1，LIU Yu1，WANG Guo-zuo2，YI Ya-qiao2，LUO Yin-he2，GE Jin-wen2
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha Hunan 410007,China;
2.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha Hunan 410007, China）
[Abstract] Objective: To observe the coagulation and thrombosis effects of Naotaifang(脑泰方). Methods: Experimental rats
thrombosis was induced by electro-stimrlating. The prothrom-bin time(PT), activated partial thromboplastin time(APTT), thrombin
time(TT), fibrinogen(Fib)of normal rats were determined; ELISA was used to evaluate the TXB2 and 6-Keto-PGF1αlevel in rate
plasma. Results: Naotaifang could obviously prolong the time of thrombus formation, increase the level of 6-Keto-PGF1α, decrease
TXB2, and keep TXB2/6-K-PGF1αat balance. Naotaifang improved APTT, TT, FIB to a certain degree, but there has no signifi－
cance(P＞0.05). Conclusion: Naotaifang has the function anti thrombosis in some degree.
[Keywords] Thrombus; Coagulation System; Cerebral Infarction; Naotaifang（脑泰方）
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DOI:10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2015.02.010