全 文 ：西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)　　　　　　 第 45卷 2009 年第 1 期　
Journal o f No r thw est No rmal Univer sity(Na tur al Science)　　　　　　 Vo l.45　2009　No.1　
收稿日期:2008-07-23;修改稿收到日期:2008-09-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30570110 , 30270091)
作者简介:严容 (1982— ), 女 , 青海乐都人 , 硕士研究生.主要研究方向为系统与进化植物学.
＊通讯联系人 , 教授 , 硕士研究生导师.E-mail:kunsun@nw nu.edu.cn
棱果沙棘及其亲本 cpDNA trnS-G
片段的序列变异分析
严　容 , 张　辉 , 苏　雪 , 陈　纹 , 温江波 , 唐洁涓 , 孙　坤＊
(西北师范大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730070)
摘　要:对自然杂交种棱果沙棘(Hip pophae goniocar pa)及其亲本中国沙棘(H.rhamnoi des ssp.sinensis)和肋果沙棘
(H.neurocarpa)的共 6 个个体的叶绿体基因组的 trnS-G 片段进行了序列测定.所测样品序列长度为 646 ～ 654 bp , 排
序后为 656 bp.所测序列共有51 个变异位点 , 占整个序列长度的 7.77%, 其中有 14 个变异位点属于碱基的插入或缺
失类型 , 37 个变异位点属于碱基的替换类型 , 各占变异位点总数的 27%、 73%和序列总长度的 2.13%、 5.64%.分
析序列结果表明 , 所测样品在 trnS-G 间隔区序列长度变化不大 , 但提供了较多的变异位点 , 并且碱基变换类型丰富 ,
碱基变异位点来源于中国沙棘和肋果沙棘的种间序列的差异.棱果沙棘的 2 个个体分别与中国沙棘和肋果沙棘的其中
1 个个体的序列完全一致 , 说明在自然杂交种棱果沙棘的起源中 , 中国沙棘和肋果沙棘均可作为母本.
关键词:棱果沙棘;中国沙棘;肋果沙棘;t rnS-G
中图分类号:Q 523+.8　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-988 Ⅹ(2009)01-0094-04
Sequences variation analy sis betw een H ippophae goniocarpa
and its parents on cpDNA trnS-G region sequences
YAN Rong , ZHANG Hui , SU Xue , CHEN Wen , WEN Jiang-bo , TANG Jie-juan , SUN Kun
(Co llege of Life Science, Nor thw est Norma l Unive rsity , Lanzhou 730070 , Gansu , China)
Abstract:T rnS-G reg ion sequences o f chloroplast genome from 6 individuals o f Hippophae goniocar pa
and its parents H.rhamnoides ssp.sinensis and H.neurocarpa are obtained by sequencing .The sequence
leng th is 646-654 bp and 656 bp af ter aligned.51 variable sites , 7.77%o f the to tal sequence , are detected
f rom the aligned sequence.Among these variable si tes , there are 14 dele tion/ insert (27% of the variable
sites and 2.13% of the to tal sequence)and 37 substitutions (73% of the variable si tes and 5.64% of the
to tal sequence).The results show the sequences o f cpDNA trnS-G reg ion of the three species change a
lit tle in length , but they provide mo re variable sites and rich base types.T he base variable sites derive
f rom sequence dif ference s between H.rhamnoides ssp.sinensis and H.neurocarpa.The sequence s of 2
individuals o f H.goniocarpa are consistent w ith that o f one individual f rom H.rhamnoides ssp.sinensis
and H.neurocarpa respectively , which indicates that both H.rhamnoides ssp.sinensis and H.neurocarpa
have acted as mo thers in hybridization origin of H.goniocarpa.
Key words:Hippophae goniocarpa ;H.rhamnoides ssp.sinensis;H.neurocarpa;t rnS-G
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　2009 年第 1 期 　　严　容等:棱果沙棘及其亲本 cpDNA trnS-G 片段的序列变异分析
　2009　No.1 Sequences variation analy sis be tween H.goniocarpa and its parents on trnS-G region sequences　
　　沙棘属(Hippophae L.)植物雌雄异株 , 兼性
营养繁殖 , 由于分布区的气候 、土壤和海拔等生态
因子的影响 , 在种下存在着丰富的种质类型和亚
种[ 1 ] .棱果沙棘(Hippophae goniocarpa)分布于
我国四川省的松潘 、 若尔盖 、 红原和青海祁连等
地 , 只出现在中国沙棘和肋果沙棘混生的灌
丛[ 2 , 3] .棱果沙棘的许多形态 、 解剖及细胞遗传学
性状具有中国沙棘和肋果沙棘的中间性质 , 如果实
形状 、果色 、种子颜色等[ 3 ] .孙坤等对棱果沙棘
及其同域分布的中国沙棘和肋果沙棘的 nrDNA
ITS序列的分析证明了棱果沙棘是中国沙棘和肋果
沙棘的自然杂交后代[ 4 ] , 但由于核基因为双亲遗
传 , 无法确定哪个种为父本 、 哪个为母本.目前 ,
应用母系遗传的叶绿体 DNA 序列探讨沙棘属进化
的报道较少.叶绿体编码丝氨酸转运 RNA的 t rnS
基因和编码甘氨酸转运 RNA 的 t rnG 基因之间的
t rnS-G 间隔区 , 进化速率快 , 不同类群可以使用
通用引物 , 在属下种间以及近缘属间的系统发育关
系研究中已开始得到应用[ 5 ] .本研究以棱果沙棘
及其亲本为材料 , 对其叶绿体 DNA 的 t rnS-G 间
隔区序列进行分析 , 以探讨棱果沙棘与其亲本种之
间在叶绿体基因上的变化特点及规律 , 分析其间的
遗传关系 , 从而确定棱果沙棘自然杂交物种形成的
方向.
1　材料与方法
1.1　实验材料
2006年 9月于棱果沙棘及其亲本同域分布的
青海祁连拱北湾地区采集棱果沙棘(Hip pophae
goniocarpa)、 中 国沙 棘 (H .rhamnoides ssp.
sinensis)和肋果沙棘(H .neurocarpa)的所有成年植
株的幼叶 , 装入封口袋中加变色硅胶使其迅速干
燥 , 从中随机挑选 3种植物各 2个个体进行序列变
异分析.
1.2　实验方法
1.2.1　总 DNA 的提取及浓度测定　采用修改后
的 CTAB法提取基因组总 DNA[ 6 ] , 溶于 1×TE
缓冲液后 -20 ℃储存.总 DNA 样品在 0.08
g·mL-1琼脂糖凝胶中电泳 , 以 0.3 g·L-1的标准
λDNA做对照 , 检测基因组 DNA的浓度.
1.2.2　PCR扩增及测序　采用人工合成的通用引
物 s(5 -GCCGCT TTAGTCCACTCAGC)和 g(5 -
GAACGAA TCACACTT TTACCAC)进行 PCR 扩
增[ 7 ] , 25 μL 的反应体系[ 8 ] :DNA 模板 5 ～ 50
ng , 16.9 μL 灭菌的双蒸水 , 2.5 μL 10×buffe r ,
引物各 1.25 μL , TaqDNA 聚合酶 0.3 unit ,
dNTP 0.3μL , MgCl2 0.5 μL.反应程序如下:
94 ℃4 min;94 ℃50 s , 54 ℃50 s , 72 ℃ 90 s ,
35 个循环;72 ℃ 8 min.PCR 产物在 0.015
g·mL-1琼脂糖凝胶中检测 , 紫外凝胶照相 , 所有
样品均扩增出特异性较好的单一条带 , 对照中无扩
增产物.产物送北京奥科公司进行测序.
1.2.3　序列排序与分析　采用 Chromas软件读取
序列 , 并进行人工校对.应用 ClustalX 软件对所
测样品的 t rnS-G 区序列进行比对[ 9 ] .统计所测样
品的碱基变异位点进行分析.对 t rnS-G 区序列利
用 PAUP4b4a软件中的最大简约法构建系统树(如
图 1示).程序选择及参数为:启发式搜索 , TBR
枝长交换 , M ULTARS ON , ACCT RAN 优化 ,
100次随机序列加入.用自展百分率表示分支支持
率(bootstrap , 重复 1 000次)[ 10] .
图 1　基于 tr nS-G 序列的最大简约树
Fig 1 The MP tree based on trnS-G sequence s
2　结果与分析
所测样品序列长度为 646 ～ 654 bp , 排序后为
656 bp.GenBank登录号为 EU748539-EU748543 ,
EU732537.所测样品的 t rnS-G 间隔区序列共有
51个变异位点 , 占整个序列长度的 7.77%, 其中
有 14 个变异位点属于碱基的插入或缺失类型
(表 1), 占变异位点总数的 27%, 占整个序列长度
的 2.13%.37 个变异位点属于碱基的替换类型
(表 2), 占变异位点总数的 73%, 占整个序列长度
的 5.64%.在这 37个变异位点中 , 转换和颠换各
为 16和 21个位点 , 各占变异位点总数的 43%和
57%.中国沙棘的 GC 含量为 25.61%～ 25.91%,
肋果沙棘的 GC 含量为 25.15%, 棱果沙棘的 GC
含量为 25.15%～ 25.61%.
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西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)　　 第 45 卷　
Journal of Nor thw est Normal Unive rsity (Natural Science)　　 Vo l.45　
表 1　trnS-G区变异位点(插入或缺失)及碱基类型
Tab 1 The va riable loci(inse rtion o r deletion)and base types o f trnS-G region sequences
样品(Sample) 位点编号及碱基类型(Locus number and ba se type)
12 219 226 321 364 365 385 412 413 540 541 542 543 544
中国沙棘 H.rhamnoides ssp.sinensis 1 T A — — A T — A A A A G G A
2 T A — A A T — A A A A G G A
棱果沙棘 H.goniocarpa 1 T A — — A T — A A A A G G A
2 — A T A — — A — — — — — — —
肋果沙棘 H.neurocarpa 1 — A T A — — A — — — — — — —
2 — — T A — — A A — — — — — —
表 2　trnS-G区变异位点(碱基替换)及碱基类型
Tab 2 The va riable loci(base substitution)and base types o f trnS-G region sequences
样品(Sample) 位点编号及碱基类型(Locus num ber and b ase type)
　 　 　 　 　 　 　 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6
　 　 1 3 5 7 8 6 0 0 4 5 0 1 7 9 0 1 1 3 5 6 7 9 3 3 4 5 6 8 8 9 0 1 2 3 3 3 3
　 　 7 5 5 7 7 0 8 9 1 0 8 8 4 0 2 5 8 8 9 2 4 1 3 6 6 7 0 6 9 4 0 1 4 0 1 5 7
中国沙棘 1 C A T A C A A T G T A A T C G T T G T A A A G T C C C C C C A G G C C A T
H.rhamnoides
ssp.sinensi s 2 C A T A C A A T G T A A G C G G T G T A A A G T C C C C C C A G G C C A T
棱果沙棘 1 C A T A C A A T G T A A T C G T T G T A A A G T C C C C C C A G G C C A T
H.goniocarpa 2 T G C T G C T C A C G T T T A T A T A T G T T A T G T G T T T T T T G G G
肋果沙棘 1 T G C T G C T C A C G T T T A T A T A T G T T A T G T G T T T T T T G G G
H.neurocarpa 2 T G C T G C T C A C G T T T A T A T A T G T T A T G T G T T T T T T G G G
　　综合表 1 、表 2的结果 , trnS-G间隔区变异位
点较多 , 51个变异位点均来源于中国沙棘和肋果
沙棘的序列差异 , 其中 , 肋果沙棘有 1个 6 bp 片
段的缺失.中国沙棘的 2个个体有 3个位点(321 ,
374 , 415)发生变异 , 321位点为 1个碱基的缺失或
插入(A※-), 374和 415位点变化一致 , 为碱基
的替换(T ※G);肋果沙棘的 2个个体有 2个位点
(219 ,412)发生变异 , 均是 1 个碱基的插入或缺失
(A※-).棱果沙棘的 2 个个体的序列明显不同 ,
差异较大 , 它们分别与中国沙棘和肋果沙棘的个体
1碱基变换类型完全一致.
以西藏沙棘(H .t ibetana)为外类群建立的系统
发育树(图 1 , CI=1.000 , RI=1.000 , 步长=65)
将中国沙棘和肋果沙棘明显分为 2支 , 棱果沙棘的
2个个体则分别与中国沙棘和肋果沙棘的个体聚在
一支 , 支持棱果沙棘的杂交起源.
3　讨论
通过分析叶绿体基因组可揭示进化史中的杂交
事件 , 同时也可检测种子流和花粉流的方向 , 被广
泛地用来研究系统地理学 、杂交事件 、 渐渗及种群
历史[ 11] .叶绿体 DNA的间隔区序列由于不受功能
的限制 , 其进化速率约为编码区的 10倍左右 , 能
提供丰富的信息位点 , 是系统学研究的有力工具 ,
多用于较低分类阶元的系统学研究中[ 12] .目前用
于系统学研究的叶绿体基因间区主要有 atpB-rbcL ,
t rnC-rpoB , psbA-t rnH , t rnL-F 等[ 5 ] .trnL-F 间隔
区序列由于具有在进化中选择压力小等特点得到广
泛应用 , 如在双参属 、 风毛菊属及蹄盖蕨科等分类
群的系统学研究中[ 13-15] , 被普遍认为适宜确定植物
属间乃至族间的系统发生关系[ 5 ] .TrnS-G 序列由
于其进化速率快 , 能提供丰富的信息位点 , 已开始
应用于种间的系统进化分析 、谱系地理学和杂种的
起源(如对麻花艽和管花秦艽(龙胆科)之间自然杂
交类型的分子验证)等研究中[ 10] .
本研究筛选进化速率较快的 t rnS-G 间隔区对
自然杂交种棱果沙棘及其亲本进行序列变异分析 ,
发现所测样品 trnS-G 间隔区序列长度变化不大 ,
但提供了较多的变异位点 , 碱基变换类型丰富.在
51个变异位点中 , 碱基替换所占比例较大 , 占变
异位点总数的 73%, 在所测样品中存在 5个 1-bp 、
1个 2-bp 、 1个 6-bp的缺失或插入 , 占变异位点总
数的 27%.通过比对发现 , 中国沙棘和肋果沙棘
的 trnS-G区序列变异明显 , 51 个变异位点来源于
这两个种之间的差异.此外 , 虽然本研究每种仅取
了 2个个体 , 但在种内个体之间仍存在明显的序列
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　2009 年第 1 期 　　严　容等:棱果沙棘及其亲本 cpDNA trnS-G 片段的序列变异分析
　2009　No.1 Sequences variation analy sis be tween H.goniocarpa and its parents on trnS-G region sequences　
差异 , 其中 , 中国沙棘的 2个个体有 3个位点的差
异 , 肋果沙棘的 2个个体有 2个位点的差异.叶绿
体 DNA trnS-G 区在沙棘属植物种间和种内均存在
明显的碱基变异的结果表明 , 该序列不但可用于沙
棘属种间关系的研究 , 而且也适合于探讨种内的进
化问题.
孙坤等[ 4 ] 对棱果沙棘及其同域分布的中国沙
棘和肋果沙棘 ITS 序列的分析发现 , 在中国沙棘
和肋果沙棘间的 58 个核苷酸差异位点中 , 棱果沙
棘在 53个位点上是前两者核苷酸的完全叠加.张
辉[ 16]进一步应用叶绿体基因组和核基因组建立系
统树验证了棱果沙棘的杂交起源.叶绿体基因组在
被子植物中通常为母系遗传 , Bartish 等[ 17] 用
cpDNA-RFLP 也证明了沙棘属叶绿体基因组的母
系遗传方式.在确定 1 个杂种的 2 个亲本的基础
上 , 利用叶绿体基因组的母系遗传特点 , 可推测杂
种的母本来源[ 18] .本研究结果发现 , 棱果沙棘的 2
个个体分别与中国沙棘的个体 1和肋果沙棘的个体
1序列完全一致 , 这一结果进一步支持了棱果沙棘
为同域分布的中国沙棘和肋果沙棘自然杂交起源的
观点 , 并证明了中国沙棘和肋果沙棘 2个亲本均可
作为其母本.
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(责任编辑　俞诗源)
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