全 文 ：２０１５年３月 四川大学学报（自然科学版） Ｍａｒ．２０１５
第５２卷　第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５２　Ｎｏ．２
收稿日期：２０１３－１２－１３
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７１５８６，３１３００９９６，３０９７１８１６）
作者简介：翟先芝，女，河南南阳人，硕士研究生，研究方向为植物遗传与分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：８０９６３５３５８＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：李旭锋．Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｆｌｉ＠ｓｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１５．０２．０３５
拟南芥ＡｔＲＡＣ在盐胁迫应答中的功能研究
翟先芝，杨虹伟，杨皓，刘志斌，王健美，杨毅，李旭锋
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：本实验所研究的拟南芥ＡｔＲＡＣ含有两个ＲＩＮＧ结构域和三个蛋白激酶Ｃ保守区域
１结构域即Ｃ１结构域．通过体外泛素化证明了ＡｔＲＡＣ具有Ｅ３连接酶活性，亚细胞定位实验
结果表明ＡｔＲＡＣ定位在细胞核中．组织特异性分析表明ＡｔＲＡＣ在根中的表达量很高，但是
在茎、叶和花中的表达量较低，而且ＡｔＲＡＣ的表达受到ＮａＣｌ胁迫的诱导．进一步对ａｔｒａｃ突
变体的分析表明，在ＮａＣｌ处理下，突变体ａｔｒａｃ的萌发率降低，侧根数目也降低．初步研究表
明拟南芥ＡｔＲＡＣ可能是一个与盐胁迫应答相关的基因．
关键词：Ｅ３连接酶；亚细胞定位；表达谱分析；组织特异性；盐胁迫
中图分类号：Ｑ９４５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１５）０２－０４１６－０７
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡｔＲＡＣ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ
ＺＨＡＩ　Ｘｉａｎ－Ｚｈｉ，ＹＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－Ｗｅｉ，ＹＡＮＧ　ＨＡＯ，ＬＩＵＺｈｉ－Ｂｉｎ，
ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ－Ｍｅｉ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ，ＬＩ　Ｘｕ－Ｆｅｎｇ＊
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ
Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡｔＲＡＣ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｔｗｏ　ＲＩＮＧ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｄｏｍａｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ　ｃｏｎｓｅｒ－
ｖａｔｉｖｅ　ａｒｅａ　１ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｎａｍｅｌｙ　Ｃ１ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｄｏｍａｉｎ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｅｌｆ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ
ｔｈｉｓ　ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ　ａｎ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｔ　ｗｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＲＡＣ　ｗａｓ　ｌｏｃａｌ－
ｉｚｅｄ　ｔｏ　ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＲＡＣ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｒｏｏｔ，
ｌｅｓｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ，ｆｌｏｗｅｒ　ａｎｄ　ｓｔｅｍｓ．ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌａｔｅｒａｌ　ｒｏｏｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｏｆ　ＡｔＲＡＣ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｌｏｗ　ｇｅｒｍｉ－
ｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｌｅｓｓ　ｌａｔｅｒａｌ　ｒｏｏｔ．Ｔｈｅｓｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＲＡＣ　ｗａｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｕｓ
ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＲＩＮＧ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡｔＲＡＣ　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ
ｐｒｏｃｅｓｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅｓ；Ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ；Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ；Ｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ；
Ｓａｌｔ　Ｓｔｒｅｓｓ
１　引　言
盐胁迫影响植物的生长发育，严重影响经济
作物的产量以及未开发土地的利用［１］．土壤盐渍
化也是当前世界普遍关注的问题之一，联合国环
保署曾预计世界范围内２０％的农业用地和５０％的
第２期 　　 翟先芝，等：拟南芥ＡｔＲＡＣ在盐胁迫应答中的功能研究 　
农田都受到盐胁迫［１］．因此提高植物的盐耐受性
对提高农作物的产量，增加可利用耕地面积意义
重大．
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，
越来越多的盐胁迫应答相关基因被发现，而通过
分子生物学手段将胁迫相关基因转入到植物中，
可以提高植物的非生物胁迫耐受性，因此，这是
提高经济作物非生物胁迫耐受性的一种有效方
法［３］．目前所发现的盐胁迫相关基因有部分属于
Ｒｉｎｇ结构的Ｅ３连接酶．ＲＩＮＧ结构的Ｅ３在植物
应 答 生 物 和 非 生 物 胁 迫 中 起 着 关 键 作 用．
Ｒｍａ１Ｈ１（ｈｕｍａｎ　ＲＩＮＧ　ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｎｃｈｏｒ　１）和
Ｒｍａ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｏｆ　Ｒｍａ１Ｈ１）可以增
加植 物 对 干 旱 的 耐 受 性［４］；ＳＤＩＲ１（ｓａｌｔ－ａｎｄ－
ｄｒｏｕｇｈｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ１）正调控 ＡＢＡ 应
答［５］；ＨＯＳ１通过降解ＩＣＥ１来负调控植物冷胁
迫［６］；ＡｔＡＩＲＰ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＡＢＡ　ｉｎｓｅｎ－
ｓｉｔｉｖｅ　ＲＩＮＧ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）正调控ＡＢＡ介导的干旱应
答［７］；研究发现在一组同源的ＲＩＮＧ结构域蛋白
ＲＧＬＧ１（ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　１）、ＲＧＬＧ２（ＲＩＮＧ
ｄｏｍａｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　２）、ＲＧＬＧ３（ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　ｌｉｇａｓｅ
３）、ＲＧＬＧ４（ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　４）和 ＲＧＬＧ５
（ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　５）中，ＲＧＬＧ１和ＲＧＬＧ２具
有降低植物的干旱耐受性的功能［８］，而 ＲＧＬＧ３
和ＲＧＬＧ４具有正调节茉莉酸途径的作用［９］．
在拟南芥全基因组中预测出有４６９个蛋白质
含有ＲＩＮＧ结构域，但具有Ｅ３活性的只是其中一
小部分［１０］，并且只有极少的蛋白质功能被验证．
本研究从拟南芥中克隆了未知基因Ａｔ２ｇ２１８４０（因
为Ａｔ２ｇ２１８４０含有Ｒｉｎｇ结构域和蛋白激酶Ｃ１结
构域，所以我们将其命名为ＡｔＲＡＣ），体外泛素化
实验表明相对应的蛋白具有Ｅ３连接酶的活性．通
过表达谱分析、亚细胞定位、组织特异性对ＡｔＲＡＣ
做了初步研究，表达谱分析表明其表达受到盐胁
迫的诱导．以突变体ａｔｒａｃ为实验材料，分析了其
在ＮａＣｌ胁迫下的表型，发现突变体在ＮａＣｌ处理
的情况下萌发率低于对照野生型，侧根数目少于
野生型，说明ＡｔＲＡＣ可能是一个与盐胁迫应答相
关基因．
２　材料与方法
２．１　实验材料
野生型拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏ－
ｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ－０），原核表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３），原核表
达载体ｐＧＥＸ６ｐ－１均由本实验室保存．各种限制
性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ，ＩＰＴＧ购自 ＴａＫａＲａ
公司．泛素激活酶（Ｅ１），泛素结合酶（Ｅ２）购自
Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ公司，泛素Ｕｂ购自Ｓｉｇｍａ公司．
一抗泛素抗体购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公
司，二抗购自 Ａｂｃａｍ公司．ＳＹＢＧｒｅｅｎ购自Ｂｉｏ－
ｒａｄ公司．拟南芥突变体ａｔｒａｃ（ＳＡＬＫ＿００３１４９）购
自（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）．
２．２　方法
２．２．１　引物设计　从 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）查询并获得ＡｔＲＡＣ的序列信息，
用ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０设计引物如表１．
２．２．２　载体构建　利用表１所示引物进行扩增，
将ＡｔＲＡＣ 的 Ｒｉｎｇ结构域部分通过ＢａｍＨ１和
Ｘｈｏ１连接到原核表达载体ｐＧＥＸ６ｐ－１；将ＡｔＲＡＣ
通过ＳｐｅⅠ和平端连接到亚细胞定位载体ｐＢＩ２２１－
ＧＦＰ．分别构建重组载体ｐＧＥＸ６ｐ－１－ＡｔＲＡＣ（１－
３４０ａａ）、ＰＢＩ２２１－ＡｔＲＡＣ－ＧＦＰ．
２．２．３　蛋白质诱导表达及纯化　构建好的重组载
体ｐＧＥＸ６ｐ－１－ＡｔＲＡＣ（１－３４０ａａ）热激转化到大肠杆
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中．３７℃摇床摇菌，直到 ＯＤ６００达
０．４－０．６，加入ＩＰＴＧ至终浓度０．２ｍＭ，１６℃诱导
１６小时，超声波破碎细胞，按照Ｎｏｖａｇｅｎ的ＧＳＴ
融合蛋白纯化说明书（ＴＢ２３）纯化蛋白质．
２．２．４　体外泛素化实验　２０μＬ的反应体系：
５０ｍＭ 的 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　７．５，１ｍＭ　ＡＴＰ，１０ｍＭ 的
ＭｇＣｌ２，５０ｎｇ的 Ｅ１，２５０ｎｇ的 Ｅ２，５００ｎｇ的 Ｅ３
（ＧＳＴ－ＡｔＲＡＣ），０．２ｍＭ 的 ＤＴＴ．３０℃反应２．
５ｈ，加入５×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ终止反应．通过ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳和 Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，使用泛素抗体检
测．分别缺Ｅ１、Ｅ２、ＧＳＴ－ＡｔＲＡＣ（１－３４０ａａ）作为负
对照．
２．２．５　亚细胞定位　ＧＦＰ定位载体ＰＢＩ２２１－Ａｔ－
ＲＡＣ－ＧＦＰ构建好之后，经ＰＥＧ介导转染野生型
拟南芥原生质体，避光培养１６－２４ｈ后，用激光扫
描共聚焦显微镜观察．
２．２．６　植物培养　拟南芥种子经１％氯化汞表面
消毒８ｍｉｎ，然后用灭菌的ｄｄＨ２Ｏ清洗５次．均匀
播在在 ＭＳ培养基上，４℃避光春化２天，转移到
２２℃培养箱培养．１６ｈ光照／８ｈ黑暗日照生长，温
度２２℃，湿度７５％．
７１４
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
表１　实验使用引物
Ｔａｂ．１　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ａｓｓａｙ
基因 ＡｔＲＡＣ（Ａｔ２ｇ２１８４０） Ｔｕｂ２（定量内参）
ＲＩＮＧ结构域引物 Ｆ：５′－ＣＣＴＴＡＴＧＣＴＡＡＧＧＣＴＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＡ　ＧＧＡ－３′
Ｒ：５′－ＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＡＧＣＡＴＡ　ＡＧＧ－３′
荧光定量ＰＣＲ引物 Ｆ：５′－ＡＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣ－３′ Ｆ：５′－ＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧ
Ｒ：５′－ＣＣＣＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＡＣＡＴＴＡ－３′ Ｒ：５′－ＧＣＡＴＣＴＴＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＣＴ
亚细胞定位引物 Ｆ：５′－ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧ－３′
Ｒ：５′－ＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＴＣＡ－３′
纯合鉴定引物 Ｆ：５′－ＡＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＡＣＧＧＧＡＴＴＡＧ－３′
Ｒ：５′－ＣＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＴＧＣ－３′
　　注：Ｆ为正向引物；Ｒ为反向引物；下划线所示为酶切位点．
２．２．７　非生物胁迫处理及荧光定量ＰＣＲ　通过
在线基因芯片ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｅＦＰ　Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／
ｂａｒ．ｕｔｏｒｏｎｔｏ．ｃａ／ｅｆｐ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｅｆｐＷｅｂ．ｃｇｉ？ｎｃｂｉ＿
ｇｉ＝４２５６８５９７＆ｍｏｄｅＩｎｐｕｔ＝Ａｂｓｏｌｕｔｅ）预测，Ａｔ－
ＲＡＣ与盐胁迫相关，而且在盐胁迫下根中的表达
量明显升高，因此对ＡｔＲＡＣ进行了表达谱分析，
方法如下：
将在 ＭＳ培养基上生长２周的野生型拟南芥
幼苗，移至含有１５０ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ中分别处理
０ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ．然后用液氮速冻提取ＲＮＡ．
将上述提取的 ＲＮＡ使用 ＴａＫａＲａ的反转录
试剂盒反转录成ｃＤＮＡ，再使用ｑ－ＰＣＲｍｉｘ－ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ），按照使用说明加样后通过Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ 检测基因表达量，ｑ－ＰＣＲ 实验程序：
９５℃５ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，６０℃１０ｓ，７２℃２０ｓ，４５个循
环．定量内参为Ｔｕｂ２，序列见引物如表１．
３　结果分析
３．１　ＡｔＲＡＣ的结构域预测
拟南芥ＡｔＲＡＣ基因全长２６５４ｂｐ，包含五个
外显子，ＣＤＳ区为２３０９ｂｐ，编码７６９个氨基酸．
在Ｓｍａｒｔ　Ｄｏｍａｉｎ上预测 ＡｔＲＡＣ含有两个ＲＩＮＧ
结构域和三个蛋白激酶Ｃ保守区域１结构域即Ｃ１
结构域（图１）．第一个ＲＩＮＧ结构域位于２４－８４ａａ，
第二个ＲＩＮＧ结构域位于２０４－２６７ａａ．三个Ｃ１结
构域均位于ＲＩＮＧ的后面，分别位于３０６－３６８ａａ、
５８０－６２５ａａ、６３０－６７９ａａ．
图１　蛋白结构预测
Ｆｉｇ．１　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
３．２　盐胁迫的表达谱分析
基因芯片ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｅＦＰ　Ｂｒｏｗｓｅｒ预测，Ａｔ－
ＲＡＣ与盐胁迫相关．因此用１５０ｍＭ　ＮａＣｌ处理在
ＭＳ平板上生长了两周的野生型拟南芥幼苗，分别
处理０ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ，通过Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ实
验，结果显示在１５０ｍＭＮａＣｌ处理下，ＡｔＲＡＣ的
表达量明显提高，随着处理时间的增加，其表达
量逐渐升高，在处理４ｈ时，和对照相比，其表达
量提高了近５倍．
８１４
第２期 　　 翟先芝，等：拟南芥ＡｔＲＡＣ在盐胁迫应答中的功能研究 　
图２　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ处理下相对表达量
柱形图上的不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）
Ｆｉｇ．２　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｕｎｄｅｒ　１５０ｍＭ
ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ａｂｏｖｅ　ｅａｃｈ　ｂａｒｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
（Ｐ＜０．０５）
３．３　蛋白质纯化与体外泛素化实验
通过ＧＳＴ亲和纯化的ＡｔＲＡＣ的ＲＩＮＧ结构
域和 ＧＳＴ的融合蛋白 ＧＳＴ－ＡｔＲＡＣ（１－３４０ａａ）在
Ｕｂ、Ｅ１、Ｅ２都存在的情况下，能形成明显的自泛
素化条带，而在分别缺少Ｅ１、Ｅ２、ＧＳＴ－ＡｔＲＡＣ（１－
３４０ａａ）时均没有形成自泛素化条带．这些结果说
明ＡｔＲＡＣ的Ｒｉｎｇ结构域部分具有Ｅ３连接酶的
活性．
图３　体外泛素化分析
Ｆｉｇ．３　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｅｌｆ－ｕｂｉｑｕｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ
３．４　亚细胞定位
本文采用 ＧＦＰ作为报告基因进行研究 Ａｔ－
ＲＡＣ的定位情况，通过共聚焦显微镜观察，Ａｔ－
ＲＡＣ－ＧＦＰ荧光主要集中在细胞核，而对照 ＧＦＰ
在细胞核，细胞质和细胞核中均存在绿色荧光，
说明ＡｔＲＡＣ定位于细胞核（图４）．
图４　亚细胞定位
ＧＦＰ：ＧＦＰ条件下观察；ＢＦ：明场条件下观察ｂａｒｓ＝２０μｍ
Ｆｉｇ．４　Ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ＧＦＰ：Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ＧＦＰ　ｆｉｌｔｅｒ；ＢＦ：Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｂｒｉｇｈｔ　ｆｉｅｌｄ－
ｂａｒｓ＝２０μｍ
３．５　组织特异性表达
分别提取了野生型拟南芥的根、茎、叶、花中的
ＲＮＡ，通过实时荧光定量 ＰＣＲ分析，发现 Ａｔ－
ＲＡＣ在拟南芥的各个组织中基本上都有表达，但
是根中的表达量较高，在茎、花和叶中表达量很低
（图５）．以茎中ＡｔＲＡＣｍＲＮＡ的表达量作为对照
为１，在根中ＡｔＲＡＣｍＲＮＡ的表达量提高了近７０
倍，而花中ＡｔＲＡＣｍＲＮＡ的表达量提高了仅有
２．５倍，叶子中ＡｔＲＡＣｍＲＮＡ的表达量提高了４．
５倍．说明ＡｔＲＡＣ主要在拟南芥的根中表达．
３．６　Ｔ－ＤＮＡ插入突变体纯合株系鉴定
为了分析ＡｔＲＡＣ基因功能，从 ＡＢＲＣ购得
Ｔ－ＤＮＡ插入株系ＳＡＬＫ＿００３１４９．通过基因特异
引物ＬＰ和 ＲＰ以及突变体插入通用引物ＬＢｂ１．３
并以基因组 ＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增，在
ＤＮＡ水平上对突变体进行纯合鉴定．如图６Ｂ中
所示，突变体幼苗中无法扩增得到相应的基因产
物（图６Ｂ下）．而在通过ＬＢｂ１和下游引物 ＲＰ的
ＰＣＲ扩增后，可见有明显的插入片段（图３上）．
野生型则与之相反．
３．７　ＮａＣｌ处理对拟南芥突变体ａｔｒａｃ种子萌发的
影响
ＮａＣｌ处理对拟南芥突变体ａｔｒａｃ种子萌发的
影响如图７中所示．将经过春化的拟南芥野生型
和突变体ａｔｒａｃ的种子分别播在在含有不同浓度
ＮａＣｌ的 ＭＳ培养基上，然后对种子的萌发情况进
行统计、分析，结果如图７Ｂ所示．在生长到第８
天时，拍照所得结果如图７Ａ所示．在正常的 ＭＳ
９１４
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
培养基中，拟南芥野生型和突变ａｔｒａｃ种子的萌发
率差不多，在第四天的时候都达到１００％；在含有
１００ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ培养基中，野生型拟南芥种
子的萌发率明显高于突变体ａｔｒａｃ，在第六天时，
野生型拟南芥种子的萌发率高达９０％，而突变体
ａｔｒａｃ的只有２０％；在含有１２５ｍＭ　ＮａＣｌ的ＭＳ平
板上，野生型拟南芥种子的萌发率同样明显高于
突变体ａｔｒａｃ，在第六天时，野生型拟南芥种子的
萌发率为７５％，而突变体ａｔｒａｃ种子的萌发率只
有１０％；在含有１５０ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上，拟
南芥突变体ａｔｒａｃ的种子基本不萌发，而野生型拟
南芥种子在第六天时萌发率为４６％．说明在萌发
阶段，拟南芥突变体ａｔｒａｃ种子对 ＮａＣｌ比较敏
感．
图５　组织特异性
柱形图上的不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）；★作为参照
Ｆｉｇ．５　Ｔｉｓｓｕｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ａｂｏｖｅ　ｅａｃｈ　ｂａｒｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
（Ｐ＜０．０５）；★ａｓ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
图６　Ｔ－ＤＮＡ插入突变体鉴定
１．Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ａｔｒａｃ（ｓａｌｋ＿００３１４９）结构图；２．Ｔ－
ＤＮＡ突变体基因组ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ．６　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔｓ
Ａ．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｔｒａｃ（ｓａｌｋ＿００３１４９）ｗｉｔｈ
Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ；Ｂ．Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＰＣＲ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｔｒａｃＴ－ＤＮＡ　ｉｎ－
ｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ　ａｌｅｌｅｓ
图７　ＮａＣｌ处理后突变体和野生型种子的萌发情况
Ａ．种子在含有不同浓度的 ＮａＣｌ培养基上生长到第八天时
的图片；Ｂ．萌发率的统计
Ｆｉｇ．７　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ
ｕｎｄｅｒ　ＮａＣｌ
Ａ．Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓｏｆｙｏｕｎｇ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎ－
ｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮａＣｌａｔ　８ｄａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｅｎｄ　ｏｆ　ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｂ．Ｓｅｅｄ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆＮａＣｌｗａｓ　ｒｅｃｏｒｄｅｄ　ａｔ　３ｄ、４ｄ、５ｄ
ａｎｄ　６ｄａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｅｎｄ　ｏｆ　ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
３．８　ＮａＣｌ处理对拟南芥突变体ａｔｒａｃ幼苗根的影响
ＮａＣｌ处理对拟南芥突变体ａｔｒａｃ幼苗侧根的
影响如图８所示．将经过春化的拟南芥突变体ａｔ－
ｒａｃ和野生型的种子播在 ＭＳ平板上，生长到第７
天时分别移到正常的 ＭＳ和含有１５０ｍＭ　ＮａＣｌ的
ＭＳ平板上．结果显示，在正常的 ＭＳ培养基中野
生型拟南芥幼苗和突变体ａｔｒａｃ拟南芥幼苗的根
的生长情况相同；在含有１５０ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ培
养基中野生型拟南芥幼苗的侧根数目要高于突变
体ａｔｒａｃ（如图８），野生型拟南芥幼苗的侧根数目
平均每株含有２．８根侧根，而突变体ａｔｒａｃ幼苗的
侧根数目平均每株只含有１根侧根．
图８　ＮａＣｌ处理对拟南芥突变体ａｔｒａｃ和野生型幼苗
根的影响
１．ＮａＣｌ处理下根的生长情况；２．侧根数目的统计
Ｆｉｇ．８　Ｒｏｏｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ｕｎｄｅｒ
ＮａＣｌ
Ａ．Ｒｏｏｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ｕｎｄｅｒ　ＮａＣｌ；Ｂ．
Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｔｅｒａｌ　ｒｏｏｔ　ｎｕｍｂｅｒ
０２４
第２期 　　 翟先芝，等：拟南芥ＡｔＲＡＣ在盐胁迫应答中的功能研究 　
４　讨　论
土壤盐渍化已经成为危及人类生存的重大资
源问题和生态问题．盐分是影响植物生长发育和
产量的一个重要环境因素，盐胁迫会造成植物减
产或死亡．在盐土中水势较低，导致植物叶片水
势下降，对植物中的多种生理生化过程产生影响．
盐胁迫会降低植物的光合作用速率，减少了能量
供给和同化物的合成，对植物的生长发育会产生
抑制作用［１１］．总之，盐胁迫会影响几乎植物所有
的重要生命过程，如生长、光合作用、蛋白质合成、
能量和脂类代谢［１２］．
目前涉及到和盐胁迫相关的基因有很多，例
如ＳＯＳ１是一个研究的比较深入的为植物耐盐所
必须的一个基因．在本研究中，我们通过实时荧
光定量ＰＣＲ发现 ＡｔＲＡＣ的表达量在 ＮａＣｌ处理
４ｈ后和对照相比提高了近５倍．这说明 ＡｔＲＡＣ
的表达受到 ＮａＣｌ胁迫的诱导，ＮａＣ胁迫正调控
ＡｔＲＡＣ的表达．许多研究结果表明，盐处理的情
况下，和盐胁迫应答相关的基因的表达量通常会
有增加．本文中的研究结果和这是相一致的．例
如ＯｓＭＹＢ３Ｒ－２可以增加植物对盐胁迫的耐受性，
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ分析表明 ＮａＣｌ处理５ｈ后其表达
量和对照相比提高２倍［１３］，ＳＯＳ１和 ＳＯＳ２在
ＮａＣｌ处理的情况下表达量明显升高，ＮａＣｌ胁迫
正调控ＳＯＳ１的表达［１４，１５］．
本研究发现 ＡｔＲＡＣ在拟南芥根中表达量比
花、茎和叶中要高很多，而且在ＮａＣｌ处理下拟南
芥突变体ａｔｒａｃ和野生型幼苗相比有较少的侧根．
目前发现的和根部有关的基因有很多，例如 Ａｔ－
ＮＡＣ２在拟南芥根和花中的表达量比其他组织器
官中高很多，在ＮａＣｌ处理的情况下拟南芥突变体
ａｔｎａｃ２幼苗的侧根数目比野生型少，过表达植株
幼苗的侧根数目比野生型多［１６］．ＳＯＳ１和ＳＯＳ２在
拟南芥根中的表达量也很高［１４，１５］．我们可以推测
ＡｔＲＡＣ和盐胁迫应答有关，而且会影响拟南芥侧
根的形成．目前很多研究发现生长素在拟南芥侧
根的形成过程中发挥着重要的作用［１７］，ＡｔＲＡＣ
是否受生长素的调节，有待于后续的实验进一步
的确定．在本研究中拟南芥突变体ａｔｒａｃ种子在萌
发阶段对Ｎａｃｌ处理表现出高度敏感性，在高浓度
的Ｎａｃｌ处理的情况下，拟南芥突变体ａｔｒａｃ种子
基本上不萌发，这说明在盐胁迫下ＡｔＲＡＣ基因和
拟南芥种子的萌发相关．
体外泛素化实验表明ＡｔＲＡＣ的Ｒｉｎｇ结构域
部分具有Ｅ３连接酶的活性，众所周知泛素Ｅ３连
接酶在蛋白质的翻译后修饰中起着关键性作用，
在植物体内Ｅ３连接酶参与多种生物和非生物胁
迫应答反应［１８，１９］．在众多结构类型的Ｅ３中，以
ＲＩＮＧ结构域的Ｅ３数量最多．可以推测 ＡｔＲＡＣ
可能通过泛素化的途径降解目标蛋白参与到盐胁
迫应答信号通路中，这有待进一步的实验来确定．
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２２４