全 文 ：核 农 学 报 2016，30(9):1699 ～ 1705
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2015-05-08 接受日期:2015-10-06
基金项目:国家自然基金(31270715，31000295)，国家留学基金，国家级大学生创新创业训练计划项目(201410341021)
作者简介:马晶晶，女，主要从事生物技术研究。E-mail:326521092@ qq． com
通讯作者:林新春，男，教授，主要从事植物生物技术研究。E-mail:lxc@ zafu． edu． cn
文章编号:1000-8551(2016)09-1699-07
雷竹 VＲN1 同源基因克隆及功能分析
马晶晶 刘世男 朱龙飞 戚田田 林新春
(浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300)
摘 要:拟南芥 VEＲNALIZATION 1(VＲN1)基因是一个介导春化途径，调控开花时间的基因。为了研究
竹类植物中 VＲN1 同源基因的功能，采用同源克隆技术从雷竹中分离到一个 VＲN1 同源基因，将其命名
为 PvVＲN1。序列分析表明，该基因编码 245 个氨基酸，与小麦、水稻中 VＲN1 同源基因相似性分别为
86. 56%和 88. 98%。实时荧光定量 PCＲ结果表明，PvVＲN1 在开花雷竹中的表达量高于未开花雷竹;在
开花雷竹中，PvVＲN1 在秆、花、叶芽中表达量相对较高。亚细胞定位分析表明，PvVＲN1 蛋白质主要存
在细胞核中。PvVＲN1 在拟南芥中的过表达使转基因植株矮小，花瓣和萼片比野生型短，但是在开花时
间上与野生型无差异，表明 PvVＲN1 基因可能参与雷竹花形态建成以及其它发育过程。本研究结果可
为阐明竹子开花机制提供科学依据。
关键词:雷竹;PvVＲN1;亚细胞定位;功能分析
DOI:10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2016. 09． 1699
由营养生长转向生殖生长是植物发育的一个重要
过程。对 双 子 叶 模 式 植 物 拟 南 芥 (Arabidopsis
thaliana)的研究发现，有 4 条途径调控植物这一转变
过程:光周期途径［1］、春化途径［2］、赤霉素(GA)途
径［3］、自主途径［4］。VＲN1 基因是介导春化途径的一
个重要基因，主要通过与 VＲN2 基因共同维持开花抑
制基因 FLC的低水平表达来调控拟南芥开花时间［5］。
此外，对拟南芥 VＲN1 基因的研究表明，该基因不仅与
春化有关，其过表达还会引起花器官的变化［6］。
目前，对于单子叶植物 VＲN1 同源基因的研究主
要集中在小麦(Triticum aestivum)中。二倍体小麦春
化应答基因 VＲN1 编码一个诱导植物开花的 MADS-
box转录因子，该基因控制了二倍体小麦对春化需求
的大多数变异，决定了小麦的耐低温特性［7 － 10］。在六
倍体小麦中，VＲN1 基因被鉴定为小麦的 AP1 基因
(WAP1)，序列分析表明 WAP1 是二倍体小麦 VＲN1 的
直系同源基因［11 － 12］。在其他单子叶植物中，VＲN1 同
源基因在多年生黑麦草(Lolium perenne)和高羊茅
(Festuca arundinacea)中也有报道，然而未对其进行功
能研究［13 － 14］。
竹类植物作为禾本科的一个重要亚科，是具有
可观经济效益的可再生资源［15］。竹子开花具有不确
定性和不规律性，并且开花时间长，开花后会造成竹
林大面积死亡从而导致重大经济损失，因此对竹子
开花机理的研究具有十分重要的意义。VＲN1 基因
在单子叶植物小麦和双子叶植物拟南芥中均与春化
有关，起到调节开花时间的作用［5，9］。为了探究竹类
植物 VＲN1 基因的功能，本研究从雷竹(Phyllostachys
violascens)中克隆了 1 个 VＲN1 同源基因，对其进行
表达分析，并通过亚细胞定位检测其瞬时表达情况，
同时转入拟南芥进行功能分析，旨在为竹子开花机
理研究提供科学参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
于浙江农林大学智能温室大棚采集开花雷竹的
花、叶芽、幼叶、老叶、秆，同时在同一竹鞭的未开花雷
竹上采集叶芽、幼叶、老叶、秆作为对照。分装标记放
入盛有液氮的液氮罐中带回实验室，－ 70℃保存。
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1. 2 目的片段的扩增
利用 Trizol 法［16］提取雷竹的总 ＲNA。以提取的
ＲNA为模板，用大连 Takara 公司反转录试剂盒获得
cDNA。在毛竹(Phyllostachys pubescens)转录组数据库
中以小麦的 VＲN1 基因作为参照，找到 1 个候选基因
(PH01000222G1190)。然后根据该侯选基因的 UTＲ
序列设计一对特异引物(F:5-CTGGATAGGCTGGTAG
GTAGGG-3;Ｒ:5-CGGCGCAGCTTGCTACTTATAC-
3)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
以雷竹 cDNA为模板扩增目的片段。PCＲ产物经胶回
收后连接到 PMD20 － T 载体，之后转化大肠杆菌
(Escherichia coli)Trans5α 感受态细胞，PCＲ 鉴定后的
阳性克隆由深圳华大基因公司测序验证。采用 Vector
NTI软件对测序得到的目的序列进行 OＲF 区预测，据
此设计引物(F:5-ATGGGGCGCGGGAAGGTGCA-3;
Ｒ:5-TCACCCGTTAATGTGGCTCACCATC-3)，扩增
OＲF区并进行测序验证。
1. 3 目的基因序列分析
应用 ProtScale工具对测序获得 cDNA序列及其编
码蛋白质的结构特点等进行分析。此外，应用
DNAMAN软件对 PvVＲN1 与 NCBI 上查找已经克隆出
来的 9 个物种的序列相似基因做多序列比对分析，采
用临近法构建系统进化树(MEGA4 软件)分析，通过
Bootstrap作次数为 1 000 次的置信度检验。
1. 4 组织特异性表达检测
提取开花与未开花雷竹不同组织的总 ＲNA，并反
转录合成第 1 链 cDNA，方法同 1. 2。将得到的 cDNA
于 － 20℃ 保存，用于实时荧光定量 ＲT-PCＲ(qＲT-
PCＲ)分析。
根据 PvVＲN1 的 OＲF区序列，利用 Premier 5 软件
设计实时定量 PCＲ引物(F:AACTGAAGGCGAAGGTT
GAGAC;Ｒ:GGCTCTTTCGGGATCTGATATGT)。以毛竹
PheUBC18 基因(F:CTCCTCGTCTCCTTCCCGAA;Ｒ:GT
CCGTTGCTGTAAATGTGTGG)为内参基因［17］。ＲT-PCＲ
反应体系为 cDNA 1μL，引物(10μmol·L －1)各 0. 4μL，
2 × ComSYBＲ qPCＲ Mix (Sigma) 10μL，ddH2O
8. 2μL。反应条件为 95℃ 预变性 3min;95℃ 变性
10s，62. 2℃ 退火 50s，72℃ 延伸 20s，40 个循环;熔解
曲线测定从 60℃到 95℃。设 3 次重复。PCＲ 扩增反
应在 CFX96 TM Ｒeal-Time PCＲ Detection System (美国
Bio-Ｒad)仪器上进行，数据分析采用 2 － ΔΔCt法。
1. 5 亚细胞定位
根据测序结果，利用 Premier 5 软件设计 OＲF 区
引物。上游引物为:ATGGGGCGCGGGAAGGTGCA，下
游引物为:TCACCCGTTAATGTGGCTCACCATC，引物由
生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以 PMD20
－ PvVＲN1 载体为模板，利用 Pfu 酶进行 PCＲ 扩增，
PCＲ产物胶回收加 A 后连接到 pMD19 － T(大连
Takara公司)载体上，转化大肠杆菌 Trans5α 感受态细
胞，筛选出阳性克隆，进行测序检测。在 PvVＲN1 的
OＲF区 引入 EcoＲⅠ和 BamHⅠ酶切位点，提取正确克
隆的质粒，同 Cam35S-gfp 质粒用 EcoＲⅠ和 BamHⅠ双
酶切，分别回收小片段和大片段，用 T4DNA 连接酶连
接。由此得到 PvVＲN1 － GFP 融合表达载体，转入大
肠杆菌 Trans5α 感受态细胞，PCＲ 菌液鉴定出的阳性
克隆由深圳华大基因公司测序检测。
利用基因枪法转化洋葱表皮。通过 LSM510 共聚
焦激光扫描显微镜(ZEISS，德国)观察绿色荧光蛋白
的信号，激发光为 488nm。微粒子弹的制备和轰击受
体材料的方法参照文献［18］。
1. 6 植物表达载体构建
利用限制性内切酶 KpnⅠ和 XbaⅠ双酶切 PMD20
－ PvVＲN1 重组质粒和 pC1301 质粒(含有 35S 启动
子)，经胶回收后，通过 T4 连接酶连接，连接产物 16℃
过夜。然后转化大肠杆菌 Trans5α 感受态细胞后，
PCＲ菌液鉴定出阳性克隆由华大基因公司测序检测，
由此获得重组表达载体。
1. 7 拟南芥转化、转基因植株检测
将含有目的基因重组表达载体的质粒通过冻融法
转入 GV3101 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感受
态细胞中，采用 Floral-dip法［19］侵染花序转化拟南芥，
种子均匀撒在含有潮霉素 (5 × 104mg·L －1)的 MS 培
养基上进行筛选，筛选出的抗性植株为 T1，利用改良
的 CTAB 法［20］提取其基因组 DNA，进行 PCＲ 验证。
并对 T1 植株分别收种筛选出 T2 单株，继续收种筛选
至表型不分离。
2 结果与分析
2. 1 基因的克隆和序列分析
以雷竹 cDNA为模板，参考毛竹转录组数据库设
计引物，PCＲ扩增出 1 条 850bp 左右的条带。测序后
通过序列比对，初步认为是 VEＲNALIZATION1 同源基
因，命名为 PvVＲN1。以序列比对结果作为依据，预测
PvVＲN1 基因的 OＲF区为 738bp，编码由 245 个氨基酸
残基组成的蛋白(图 1)。采用 ProtScale进行蛋白质预
测，发现该蛋白具有典型的 MADS-box 结构域，表明该
蛋白属于 MADS-box 家族。应用 DNAMAN 软件对
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9 期 雷竹 VＲN1 同源基因克隆及功能分析
PvVＲN1 与已经克隆出来的 9 个物种的同源性较高的
氨基酸序列做比对分析。由图 2 可知，PvVＲN1 与小
麦、水稻中 VＲN1 同源基因的氨基酸序列相似性最高，
分别为 86. 56% 和 88. 98%;PvVＲN1 与其它蛋白在
MADS结构域相似程度最高，K 区相似度较高而在 I
区差异较大，在 C区变异最大。
采用临近法构建系统进化树(MEGA4 软件)，结果
显示 PvVＲN1基因与水稻(Oryza sativa)、高羊茅、黑麦
草、小麦等 VＲN1同源基因聚为一类，其中与 OsMADS14
(水稻 VＲN1基因［21］)关系最近(图 3)。
图 1 PvVＲN1 OＲF及氨基酸序列
Fig． 1 The OＲF and amino acid sequence of PvVＲN1
图 2 PvVＲN1 与其同源基因的氨基酸序列比对
Fig． 2 Alignment of the PvVＲN1 amino acid sequences from different plant species
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注:各节点处数值表示 Bootstrap 值(重复 1 000 次)。涉及的基因序列有:拟南芥 AP1，VＲN1(145337310，AF289052. 1);旱竹 PpMADS1
(U352648. 1);水稻 OsMADS14，OsMADS15，OsMADS28(AF058697. 1，AF058698. 1，6006606);小麦 TmVＲN1(83702517);黑麦草 LpVＲN1
(359301483);高羊茅 FaVＲN1(FJ793194. 1);雷竹 PpMADS1，PpMADS2(ACB05814. 1，ACO53802. 1)。
Note:The numbers next to the nodes give bootstrap values of 1 000 replicates． The B group MADS- box genes listed in the tree are as follows:
Arabidopsis thaliana (AP1，145337310． VＲN1，AF289052. 1)． Phyllostachys praecox (PpMADS1，EU352648. 1)． Oryza sativa (OsMADS14，
AF058697. 1． OsMADS15，AF058698. 1． OsMADS28，6006606)． Triticum monococcum (TmVＲN1，83702517)． Lolium perenne (LpVＲN1，
359301483)． Festuca arundinacea (FaVＲN1，FJ793194. 1)． Phyllostachys praecox(PpMADS1，ACB05814. 1． PpMADS2，ACO53802. 1)．
图 3 PvVＲN1 与其同源基因的系统进化树
Fig． 3 Phylogenetic tree of PvVＲN1 and the homologous gene of VＲN1
2. 2 基因在雷竹中的组织特异性表达分析
利用实时荧光定量 PCＲ 技术，对 PvVＲN1 基因在
开花和不开花雷竹的不同组织中的表达水平进行分
析。结果表明，PvVＲN1 基因在开花雷竹和未开花雷竹
的各个组织中均有表达，但在开花雷竹中的表达水平
明显高于未开花雷竹。其中，开花雷竹秆、花和叶芽的
表达量较高，无明显差异;幼叶和老叶的表达量较低。
在未开花雷竹各个组织的表达量均比较低，其中在老
叶的表达量最低(图 4)。
2. 3 亚细胞定位结果分析
构建了瞬时表达载体 PvVＲN1 － GFP，采用基因枪
轰击洋葱表皮细胞，通过共聚焦激光扫描显微镜观察
绿色荧光蛋白的信号。结果显示，绿色荧光主要在细
胞核上分布，在细胞膜上也有少量分布(图 5)。
2. 4 基因在拟南芥中的过量表达
为了研究 PvVＲN1 基因的功能，构建过表达载体
并转化拟南芥。通过对 T0种子进行潮霉素抗性筛选
获得 35 个抗性单株(T1)，对获得的 T1、T2 单株分别收
种继续筛选，获得了不发生分离的 6 个 T3 株系。观察
转基因植株发现，与野生型拟南芥相比，PvVＲN1 基因
的过量表达没有引起拟南芥开花时间的变化，而是使
花器官形态发生了改变，主要表现为花萼、花瓣短小，
注:F1，F2，F3，F4，F5 分别为开花雷竹的秆、叶芽、幼叶、老叶和花;
V1，V2，V3，V4 分别为未开花雷竹的秆、叶芽、幼叶和老叶。
Note:F1，F2，F3，F4，F5 representing stem，buds，leaves，old leaves and
flowers of flowering Phyllostachys violascens． V1，V2，V3，V4 representing
stem，buds，leaves and old leaves of non-flowering Phyllostachys
violascens．
图 4 PvVＲN1 在雷竹不同组织中表达
Fig． 4 Expression of PvVＲN1 in different tissues
of Phyllostachys violascens
花瓣比雄蕊短且花萼张开角度更大(图 6 － B)，在花蕾
期萼片无法包裹住内部的花器官(图 6 － C);此外，
PvVＲN1 转基因拟南芥植株比野生型拟南芥植株矮小
(图 6 － A)。
2071
9 期 雷竹 VＲN1 同源基因克隆及功能分析
图 5 PvVＲN1 蛋白在洋葱表皮细胞中的定位分析
Fig． 5 Subcellular localization analysis of PvVＲN1
fusion protein in onion epidermal cells
注:A的标尺为 4. 5cm;B和 D的标尺为 0. 06cm;C和 E的标尺为 0. 02cm。
Note:Bar = 4. 5cm for A． Bar = 0. 06cm for B and D． Bar = 0. 02cm for C and E．
图 6 转基因拟南芥植株表型
Fig． 6 Phenotype of transgenic Arabidopsis thaliana plants
3 讨论
AP1 /FUL基因在禾本科植物的基因组有 3 个旁
系同源基因，分别为 FUL1、FUL2 和 FUL3 基因［22］。
Kyozuka等［23］研究表明，小麦的 VＲN1 基因属于 FUL1
分支。本研究的系统进化树分析表明，目标基因与小
麦和水稻 VＲN1 基因聚为一类并且落在 FUL1 分支上，
故将其命名为 PvVＲN1。
蛋白质是生物功能的直接体现，蛋白质的功能与
其在细胞中的定位密切相关，因此对蛋白质进行亚细
胞定位是研究其功能必不可少的环节［24］。亚细胞定
位结果表明，PvVＲN1 主要定位在细胞核上，在细胞膜
上也有少量分布，而高羊茅 VＲN1 仅定位于细胞核，推
测 PvVＲN1 主要行使转录因子的功能，但与高羊茅
VＲN1 的功能可能存在差异［25］。
荧光定量 PCＲ 结果显示，PvVＲN1 基因在开花雷
竹的表达量明显高于未开花雷竹，且在花中的表达量
高，表明 PvVＲN1 基因可能参与雷竹花形态的建成。
VＲN1 基因在拟南芥中的过表达造成花器官形态的改
变，且 转 基 因 植 株 比 野 生 型 植 株 个 体 矮 小;
35S::PvVＲN1转基因拟南芥植株的花瓣与萼片比野生
型拟南芥的要短，并且株高矮小［26 － 27］。这些结果表明
PvVＲN1 在调控花器官发育和秆发育方面是功能保守
的。此外，PvVＲN1 基因在开花雷竹的叶芽、幼叶和老
叶的表达水平逐渐降低，推测 PvVＲN1 基因还可能参
与雷竹叶的发育过程。
禾本科植物中，水稻同源基因 OsMADS14 起初在
分生组织的所有区域表达，随后仅在外稃、内稃和浆片
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中表达［23，28］。PvVＲN1 基因在开花雷竹和未开花雷竹
的各个组织中均有表达，与 OMADS14 基因的表达模
式不同，而与不需要春化处理的春性小麦 VＲN1 基因
的表达模式相同。功能分析显示，PvVＲN1 转基因拟南
芥在开花时间上与野生型没有差异，而拟南芥、水稻和
小麦 VＲN1 基因在拟南芥中过量表达能够提早开
花［26 － 27，29］;并且亚细胞定位结果显示 PvVＲN1 在细胞
膜上也有分布，表明 VＲN1 基因在不同竹类植物中的
功能有所差异。
4 结论
本研究采用 ＲT-PCＲ 技术从雷竹中克隆得到
MADS-box基因家族成员 PvVＲN1 基因。实时荧光定
量 PCＲ 结果表明，PvVＲN1 表达量在开花雷竹和未开
花雷竹的各个组织中均有表达。亚细胞定位分析表
明，PvVＲN1 蛋白质主要定位在细胞核上。转基因试
验结果显示 PvVＲN1 的过表达使转基因拟南芥矮小，
花瓣和萼片比野生型短，但开花时间与野生型无差异。
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From Phyllostachys violascens
MA Jingjing LIU Shinan ZHU Longfei QI Tiantian LIN Xinchun
(The Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A＆F University，Linan，Zhejiang 311300)
Abstract:In Arabidopsis thaliana，VEＲNALIZATION 1(VＲN1)gene plays an important role in the regulation of
flowering time through mediating vernalization pathway． To investigate the function of homologue VＲN1 from bamboo，a
VＲN1 － like gene was isolated from Phyllostachys violascens，named as PvVＲN1． Sequence analysis showed that PvVＲN1
encoded a protein with 245 amino acids and shared a homology of 86. 56% and 88. 98% with VＲN1 from Triticum
aestivum and Oryza． sativa，respectively． qＲT-PCＲ analysis indicated that the expression level of PvVＲN1 was higher in
flowering bamboo than in non-flowering bamboo． In flowering bamboo，PvVＲN1 was relatively expressed high in stem，
flower and leaf bud． Subcellular localization analysis revealed that PvVＲN1 protein was mostly located in the nucleus．
Meanwhile，ectopic expression of PvVＲN1 in Arabidposis showed a dwarf phenotype and produced short sepals and petals
compared with wild-type plants，while no significant difference in flowering time was observed． These results suggest that
PvVＲN1 may be involved in many development processes in bamboo other than flower development． This study will
provide scientific evidence underlying the mechanism of bamboo flowering．
Keywords:Phyllostachys violascens，PvVＲN1，subcellular localization，functional analysis
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