全 文 ：中国农业科技导报，2014，16(4):71 － 78
Journal of Agricultural Science and Technology
收稿日期:2014-02-19;接受日期:2014-03-17
基金项目:国家自然科学基金项目(31372361)资助。
作者简介:雷 志，硕士研究生，主要从事植物分子生物学与基因工程研究。E-mail:zyzlei@ 163． com。* 通信作者:吴燕民，研究员，
博士生导师，主要从事植物分子生物学与基因工程研究。E-mail:Wuym65@ sina． com
铃铛刺抗逆转录因子基因 HhDＲEB2 的克隆及分析
雷 志1， 阴翠翠2， 李永亮3， 孙占敏1， 吴燕民1*
(1．中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081;2．西北大学生命科学学院，西安 710069;
3．甘肃农业大学草业学院，兰州 730070)
摘 要:利用同源克隆和 ＲACE(rapid amplification of cDNA end)技术从豆科铃铛刺属灌木铃铛刺中分离了一
个 DＲEB类转录因子基因的全长 cDNA序列，命名为 HhDＲEB2(GenBank No．:EU872018)。序列分析表明，该
基因全长为 873 bp，在 108 ～ 626 bp 处为开放阅读框，无内含子，编码 172 个氨基酸残基，分子质量为
19． 702 kDa，等电点 8． 92。系统进化树和同源序列比对分析结果显示，该基因编码的蛋白含有一个典型的
AP2 /EＲF保守结构域，并与大豆 GmDＲEB1 和 GmDＲEB2 的亲缘关系较近，属于 A5 亚组。通过酵母单杂交试
验，发现 HhDＲEB2 基因编码的蛋白具有转录激活的功能。此外，在洋葱表皮细胞中进行该基因的瞬时表达，
证实了 HhDＲEB2 蛋白定位于细胞核。半定量 ＲT-PCＲ 检测发现，HhDＲEB2 基因受干旱、高盐和低温的诱导
表达，而对 GA3、NAA、ABA和 6BA的处理无明显的变化。
关键词:铃铛刺;DＲEB转录因子;ＲACE技术;酵母单杂交;半定量 ＲT-PCＲ;亚细胞定位
doi:10． 13304 / j． nykjdb． 2014． 083
中图分类号:Q949． 748． 3 文献标识码:A 文章编号:1008-0864(2014)04-0071-08
Cloning and Analysis of Anti-stress Transcription Factor Gene
HhDＲEB2 from Halimodendron halodendron． Voss
LEI Zhi1，YIN Cui-cui2，LI Yong-liang3，SUN Zhan-min1，WU Yan-min1*
(1． Biotechnology Ｒesearch Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081;
2． College of Life Sciences，Northwest University，xian 710069;
3． College of Grassland Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)
Abstract:In this study，a full-length cDNA sequence of DＲEB transcription factor gene，HhDＲEB2 (GenBank No．:
EU872018)，was isolated from Halimodendron halodendron． Voss by homology-based cloning and ＲACE (rapid
amplification of cDNA end)technology． Sequence analysis showed that the cDNA sequence was 873 bp without
introns and had a maximum open reading frame from 108 to 626 bp，encoding 172 amino acid residues． Molecular
weight of the gene encoding protein was 19． 702 kDa，isoelectric point was 8． 92． Phylogenetic tree and homologous
sequence alignment analysis indicated that this protein contained a typical AP2 /EＲF conservative domain，and was
most closely related to soybean GmDＲEB2， belonging to the A5 subgroups． Yeast one-hybrid experiment
demonstrated that HhDＲEB2 gene encoded a transcription activator． In addition，subcellular localization analysis of a
construct with the transient expression vector of the HhDＲEB2 gene showed that the HhDＲEB2 protein was localized
in the nucleus． The expression level of HhDＲEB2 gene was greatly induced by high salt，drought and low temperature
through semi-quantitative ＲT-PCＲ，and had no significant change with GA3，NAA，ABA and 6BA treatments．
Key words:Halimodendron halodendron． Voss;DＲEB transcription factor;ＲACE technology;yeast one-hybrid;
semi-quantitative ＲT-PCＲ;subcellular localization
非生物逆境(如干旱、盐渍、低温等)是限制
作物产量至关重要的因素。为了适应或响应这些
不利因素，植物经过长期进化形成一套感知逆境
胁迫、传导逆境信号并在分子、细胞和生理水平上
响应的精细调控机制［1］。而转录因子在该调控
机制中扮演着至关重要的角色，作为反式作用因
子与靶基因启动子上的顺式作用元件发生互作，
从而对相关基因的表达起增强或抑制的作用［2］。
在拟南芥基因组中有超过 1 500 个基因编码转录
因子，它们主要包括 NAC、bZIP、MYB /C、WＲKY
和 AP2 /EＲF 转录因子［3］。其中，对 AP2 /EＲF 基
因家族的研究一直是热点。Mizoi 等［4］根据其序
列相似性和 AP2 /EＲF结构域的数量，将其分为 4
类，分别为 AP2、EＲF、DＲEB 和 ＲAV 亚家族。
DＲEB亚家族的分类特征是具有一个约 60 个氨
基酸组成的 AP2 /EＲF保守结构域，并且在保守结
构域的第 14、19 位分别为缬氨酸(V)和谷氨酸
(E)［5］。DＲEB亚家族成员可以识别干旱和冷诱
导响应元件(DＲE /CＲT、A /GCCGAC)，在植物响
应非生物胁迫的过程中发挥非常重要的作用，受
多种胁迫因子的诱导表达［6］。
铃铛刺(Halimodendron halodendron． Voss)系
豆科铃铛刺属灌木，具有极强的抗旱耐盐碱能力，
能够在极度干旱缺水的环境中生长，在长期的生
存进化过程中体内形成了完善的抗逆机制，且存
在着丰富的与逆境相关的基因资源。本研究以新
疆沙生植物铃铛刺为材料，利用同源克隆和
ＲACE技术分离了一个 DＲEB 类转录因子基因，
同时结合生物信息学的方法对 HhDＲEB2 基因的
结构以及所编码蛋白质的性质、结构及进化关系
进行预测和分析，并对 HhDＲEB2 基因的表达模
式以及所编码蛋白质的转录活性和亚细胞定位进
行了初步研究，为进一步研究基因的功能及转录
因子的作用机制奠定了基础，以期获得抗逆性能
良好的转录因子基因。
1 材料和方法
1． 1 材料
铃铛刺(Halimodendron halodendron)种子采
自于新疆罗布泊地区。以水培 4 周的铃铛刺幼苗
为材料，分别进行高盐(250 mmol /L NaCl 溶液浸
根)、干旱(20% PEG6000 溶液浸根)、低温(4℃
培养箱)以及不同激素(100 μmmol /L GA3、
100 μmmol /L NAA、100 μmmol /L ABA、100 μmmol /L
6BA浸根)的胁迫处理。取处理后不同时间点
(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)的叶片置于液氮中
速冻，－ 80℃保存备用。
研究所用到的 PCＲ 引物由北京奥科生物技
术有限责任公司合成，引物序列见表 1。
表 1 本研究所用 PCＲ引物序列
Table 1 PCＲ primer sequences used in this study．
引物名称
Primer names
引物序列
Primer sequences
退火温度(℃)
Annealing temperature(℃)
P1 5-C(A/C)(G/A)(A/T /C)GG(A/C /G)ATAAGGATG(A/C)GGAAGTG-3 58
P2 5-(G/A)(T /C)(T /C)TGGAG(C /A)GCGTCGACT-3 59
ＲT 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24 -3 －
3DP1 5-TATTCTACCTCAGAGGTCCTTCGGC-3 69
3DP2 5-TACCTCAGAGGTCCTTCGGCTC-3 65
G1 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 65
G2 5-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3 67
5DP1 5-GAACCCAACCAAATCCTTGACCT-3 68
5DP2 5-AAATTGAGGCGAGCCGAAGGAC-3 68
5-GＲ 5-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 70
5-NGＲ 5-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3 69
HD1 5-GTTTTGAAGAAAGATTATCAC-3 56
HD2 5-CGATTATCTAGGCTCAGGCA-3 60
HD-ＲT(F) 5-GGCGGTTATGATGGAAGAAGA-3 63
HD-ＲT(Ｒ) 5-GAAGAGCGGTTTGGATAGCAT-3 67
Actin-F 5-CAACCTTAATCTTCATGCTG-3 66
Actin-Ｒ 5-AGCAACTGGGATGACATGGAG-3 65
HDY(F) 5-CG GAATTCGTTATGATGGAAGAAGA-3 70
HDY(Ｒ) 5-AGC GTCGACCATTATGAGAGGTATC-3 68
GFPHD(F) 5-TT GTCGACGTTATGATGGAAGAAGA-3 70
GFPHD(Ｒ) 5-CG GGATCCATATATACGCTCTGTTA-3 72
注:下划线部分为酶切位点。
Note:Sequences underlined are the digestion sites．
27 中 国 农 业 科 技 导 报 16 卷
1． 2 方法
1． 2． 1 铃铛刺总 ＲNA提取及第一链的合成 用
Trizo1 试剂(北京康润诚业生物公司)提取处理过
的铃铛刺幼苗的总 ＲNA，测定 ＲNA 含量，电泳检
测 ＲNA完整性。按 ＲT-PCＲ试剂盒(Invitrogen公
司)提供的方法进行反转录，合成第一条链
cDNA，－ 20℃保存备用。
1． 2． 2 DＲEB 基因同源片段的获得 利用
DNAMAN软件分析 DＲEB 类转录因子基因的序
列同源性，按照其同源序列特征设计简并引物
(P1 /P2)。以铃铛刺 cDNA 为模板，设定退火温
度为 50℃，30 个循环，进行简并 PCＲ扩增目的片
段。电泳鉴定回收克隆到 pMD19-T(TaKaＲa 公
司)，转化大肠杆菌 DH5α(本实验室保存)，挑取
阳性单菌落进行测序。
1． 2． 3 3 ＲACE和 5 ＲACE 根据 Gene ＲacerTM
Kit试剂盒(Invitrogen)扩增 3端和 5端 cDNA 序
列。利用 Primer 5． 0 软件按照已分离的 DＲEB 基
因的同源片段，设计 2 条 3 ＲACE 特异引物
(3DP1 /3DP2)，同时结合 3通用引物 G1、G2 进行
50 μL 体系两轮 PCＲ 扩增，两轮 PCＲ 反应条件
为:94℃ 5 min;94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃
1 min，30 个循环;72℃ 10 min。将第一轮 PCＲ
产物稀释 100 倍作为模板，进行第二轮巢式 PCＲ。
电泳鉴定、胶回收之后克隆到 pMD19-T，进行测
序。结合中间保守片段和 3端 cDNA 序列，设计
基因特异引物(5DP1 /5DP2)。用 5-Full ＲACE
Kit对 4 μg total ＲNA 进行 CIAP、TAP 处理，并与
5-ＲACE Adaptor连接后，反转录合成 cDNA 作为
模板。再结合 5-GＲ 和 5-NGＲ 进行 50 μL 体系
两轮 PCＲ扩增反应。稀释(100 倍)第一轮 PCＲ
产物，将其作为模板，再次进行巢式 PCＲ 扩增，其
两轮 PCＲ 扩增程序为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，
60℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环;72℃ 10 min。
电泳鉴定并回收克隆到 pMD19-T测序。
1． 2． 4 HhDＲEB2 cDNA 全长序列的扩增 拼接
已知的 3端、5端以及中间同源片段，设计其全长
序列的特异引物(HD1 /HD2)，以 cDNA 为模板，
进行 20 μL 体系的 PCＲ 扩增反应，退火温度为
62℃，其余与上述扩增程序一致。经电泳鉴定回
收克隆到 pMD19-T，测序获得该基因的全长
cDNA序列。
1． 2． 5 生物信息学分析 运用生物信息学数据
库(如 NCBI、EBI、ExPASy)和生物信息学软件(如
DNAMAN、MEGA、SMAＲT、Primer5. 0 )等 对
HhDＲEB2 基因的序列以及所编码蛋白质的理化
性质、结构域、二级结构进行预测，同时对其进行
多序列比对和系统进化树分析。
1． 2． 6 酵母效应质粒 pBridge-HhDＲEB2 和融合
表达载体 p163-GFP-HhDＲEB2 的构建 根据
HhDＲEB2 基因的 cDNA 序列分别设计带有酶切
位点的特异引物［HDY(F)/HDY(Ｒ)，GFPHD
(F)/GFPHD(Ｒ)］(表 1)，以全长 HhDＲEB2
cDNA为模板，扩增出带有酶切位点的 HhDＲEB2
基因完整编码区序列。分别将目的片段连接在酵
母效应载体 pBridge(Clontech 公司)的 EcoＲⅠ和
SalⅠ位点之间，以及绿色荧光蛋白表达载体
p163-GFP(本实验室保存)的 SalⅠ和 BamHⅠ位
点之间，构建酵母融合效应质粒载体 pBridge-
HhDＲEB2 和绿色荧光蛋白融合表达载体 p163-
GFP-HhDＲEB2。通过转化大肠杆菌 DH5a，挑取
阳性单克隆菌落，测序并验证。
1． 2． 7 融合载体转化酵母及洋葱表皮细胞 利
用热 激 法，将 酵 母 效 应 质 粒 载 体 pBridge-
HhDＲEB2 导入酵母菌株 AH109(Clontech 公司)
中。以空载质粒 pBridge 和 pBridge-GAL4 为对
照，分别在 SD单、双缺陷培养基(Trp －或 Trp －和
His －)上筛选阳性转化子。同时，用 Whatman 滤
纸进行显色鉴定。
利用基因枪法将绿色荧光蛋白融合表达载体
p163-GFP-HhDＲEB2 转化洋葱表皮细胞，以空载
质粒 p163-GFP作为对照，孵育 30 h 之后，在激光
共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，
来对 HhDＲEB2 蛋白进行亚细胞定位分析。
1． 2． 8 半定量 ＲT-PCＲ 根据 HhDＲEB2 基因
cDNA序列，设计半定量 ＲT-PCＲ扩增的特异引物
［HD-ＲT(F)/HD-ＲT(F)］。以不同处理的铃铛
刺叶片总 ＲNA反转录而成的 cDNA为模板，用肌
动蛋白基因作为内参基因，设计内参基因特异引
物(Actin-F /Actin-Ｒ)，进行 20 μL体系 28 个循环
的 PCＲ扩增，Actin扩增的退火温度为 60℃，特异
片段扩增的退火温度为 58℃。以此来检测
HhDＲEB2 基因的表达变化。
2 结果与分析
2． 1 HhDＲEB2 基因的分离与鉴定
根据 AP2 /EＲF保守性结构域设计简并引物，
374 期 雷 志等:铃铛刺抗逆转录因子基因 HhDＲEB2 的克隆及分析
以反转录的 cDNA为模板，PCＲ 扩增出 282 bp 的
中间保守序列(图 1A)。利用得到的中间保守序
列分别设计 2 对 3ＲACE 和 2 对 5ＲACE 的巢式
特异引物和外侧延伸引物，通过巢式 PCＲ分别扩
增出约 532 bp(图 1B)和约 373 bp(图 1C)的片
段。将 3端、保守区和 5端 cDNA序列拼接，设计
扩增全长基因的特异引物(HD1 /HD2)，电泳检测
及序列测定出该片段长度为 873 bp(图 1D)，Blast
同源搜索和序列比对发现其与植物的 DＲEB类转
录因子有较高的同源性，推测该基因为铃铛刺的
DＲEB 转 录 因 子 基 因，并 命 名 为 HhDＲEB2
(Genbank No．:EU872018)。
利用 DNAMAN 软件对 HhDＲEB2 基因的序
列进行分析，该基因有一个 519 bp 最大开放阅读
框，编码 172 个氨基酸，起始于第 108 bp，终止于
第 626 bp。同时，对铃铛刺 cDNA及其基因组 DNA
进行特异引物(HD1 /HD2)扩增，得到大小相同的
扩增片段，表明 HhDＲEB2基因无内含子(图 2)。
图 1 HhDＲEB2 基因的分离过程
Fig． 1 Isolated process of HhDＲEB2 gene
注:A． 简并 PCＲ扩增结果;B． 3 ＲACE-PCＲ;C． 5 ＲACE-PCＲ;D． HhDＲEB2 基因全长 cDNA扩增。M:Marker;1:目的片段
Note:A． Amplification of degenerate PCＲ;B． 3 ＲACE-PCＲ;C． 5 ＲACE-PCＲ;D． Full-length amplification of HhDＲEB2． M:Marker;1:
Target fragment．
图 2 HhDＲEB2 的基因结构分析
Fig． 2 Genomic structure analysis of HhDＲEB2．
M:Marker;1:cDNA扩增片段;2:基因组 DNA扩增片段
M:Marker;1:Amplification of cDNA;2:Amplification of genomicDNA．
2． 2 HhDＲEB2 基因的生物信息学分析
2． 2． 1 HhDＲEB2 蛋白的理化性质、二级结构及
结构 域 分 析 应 用 ProtParam (http:/ /web．
expasy． org /protparam /)在线程序预测 HhDＲEB2
编码蛋白的理化性质，推测该蛋白的分子式为
C852H1364N258O270S5，相对分子质量为 1． 970 2 kDa，
等电点(pI)为 8． 92。疏水性氨基酸残基共 63
个，极性带负电荷氨基酸残基有 27 个，极性带正
电荷氨基酸残基共 30 个，亲水性指数为 － 0． 890。
由 CFSSP (http:/ /www． biogem． org / tool /chou-
fasman /)软件预测 HhDＲEB2 氨基酸序列的二级结
构，结果如图 3所示。其中，α-螺旋和 β-折叠片大量
地分布在肽链中，β-转角和无规卷曲散布在其中。
利用 SMAＲT(http:/ / smart． embl-heidelberg．
de /)软件分析 HhDＲEB2 蛋白结构域，发现
HhDＲEB2 蛋白主要具有 AP2 /EＲF(33 － 96)、Low
complexity(137 － 147)两个结构域，AP2 /EＲF 结
构域是 DＲEB基因家族的保守区;Low complexity
位于蛋白质 C-端区域，这种低复杂度的氨基酸组
成，可能对蛋白质的构象变化具有重要影响力，
在蛋白质行使功能的物理化学过程中起重要
作用。
2． 2． 2 系统进化树及氨基酸多序列比对分析
通过对 HhDＲEB2 基因所编码的蛋白质序列
进行 Blastp 同源搜索发现，该蛋白与沙冬青
AmDＲEB1(74%)、大豆 GmDＲEB1(67%)、大豆
GmDＲEB2(73%)、毛果杨PtDＲEB36(69%)、马
47 中 国 农 业 科 技 导 报 16 卷
图 3 HhDＲEB2 蛋白的二级结构分析
Fig． 3 Secondary structure analysis of HhDＲEB2．
铃薯 StDＲEB2(67%)、蓖麻 ＲcDＲEB1B(67%)、
棉花 GhDＲEB1(62%)、马铃薯 StDＲEB3(56%)、
野毛 豆 GsDＲEB1 (62%)、拟 南 芥 AtDEAＲ3
(55%)以及可可树 TcDEAＲ2(54%)的氨基酸序
列具有较高的相似性。利用 MEGA 软件进行系
统进化树分析，发现铃铛刺 HhDＲEB2 的进化关
系 介 于 GmDＲEB1 和 GmDＲEB2 之 间，与
GmDＲEB1 的亲缘关系更近(依据分歧时间界定)
(图 4)。同时，用 DNAMAN进行氨基酸多序列比
对，该基因编码的氨基酸在总体水平上与其他序
列的一致性约为 55%，且存在一个约 58bp 的
AP2 /EＲF保守结构域，其中第 14、19 位分别为保
守的缬氨酸(V14)和谷氨酸(E19)(图 5)。这些
均为区分是否为 DＲEB类转录因子的典型特征。
2． 3 HhDＲEB2基因所编码蛋白的转录激活验证
将构 建 的 酵 母 效 应 质 粒 载 体 pBridge-
HhDＲEB2 导入酵母菌株 AH109 中。以空载质粒
pBridge 和 pBridge-GAL4 为对照，分别在 SD 单、
双缺陷培养基(Trp －或Trp －、His －)上进行筛选。
图 4 HhDＲEB2 蛋白与其同源蛋白的系统进化树分析
Fig． 4 Phylogenetic relationship of HhDＲEB2 and homologous proteins．
图 5 HhDＲEB2 与其同源蛋白的氨基酸多序列序列比对分析
Fig． 5 Multiple alignment analysis of HhDＲEB2 and homologous proteins．
注:下划线部分为保守的 AP2 /EＲF结构域，箭头所示为第 14、19 位的保守氨基酸残基:缬氨酸和谷氨酸。
Note:The AP2 /EＲF domain is underlined． The 14th(Valine)and 19th(Glutamate)conserved amino acid residues were shown by the arrows．
574 期 雷 志等:铃铛刺抗逆转录因子基因 HhDＲEB2 的克隆及分析
空载质粒 pBridge在 SD /His － /Trp －培养基中未能
生长，而 pBridge-GAL4 和 pBrige-HhDＲEB2 均能
正常生长(图 6A)。同时，在 SD 双缺陷培养基中
放入 whatman滤纸进行 β-半乳糖苷酶活性检测，
可以清晰地观察到 pBridge-GAL4 和 pBrige-
HhDＲEB2 重组质粒菌落区域呈现蓝色，且
pBrige-HhDＲEB2 菌落区域较明显，而空载质粒处
无变化(图 6B)。这样证实了 HhDＲEB2 基因编
码的转录因子蛋白具有转录激活的功能。
2． 4 HhDＲEB2 基因所编码蛋白的亚细胞定位
融合表达载体 p163-GFP-HhDＲEB2 和空载
质粒 p163-GFP 导入洋葱表皮细胞内，瞬时表达
发现，转入空载 p163-GFP 的整个细胞内呈现绿
色荧光(图 7A)，而转化融合表达载体 p163-GFP-
HhDＲEB2 的洋葱表皮细胞，只能在细胞核内呈现
出绿色荧光(图 7B)。由此，可以推断该蛋白定位
于细胞核。
2． 5 HhDＲEB2 基因的表达模式分析
取水培四周的铃铛刺幼苗分别进行低温
(4℃培养箱)、高盐(250 mmol /L NaCl溶液浸
图 6 酵母单杂交检测转录激活活性
Fig． 6 Identification of transoript activation by yeast
one hybrid．
A．重组质粒酵母菌株的筛选;B． Whatman滤纸检测
A． Screening of yeast AH109 strains containing recombinant plasmids;B．
Whatman-filter detection．
图 7 洋葱表皮细胞 GFP荧光观察
Fig． 7 Fluorescence detection in the onion skins cells．
根)、干旱(20% PEG6000 溶液浸根)以及不同激
素(100 μmol /L GA3、100 μmo /L NAA、100 μmol /L
ABA、100 μmol /L 6BA浸根)的胁迫处理，对不同
处理时间(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)的样品(重
复三次)进行半定量 ＲT-PCＲ 检测(图 8)。发现
幼苗在 4℃低温下，处理 6 h 后 HhDＲEB2 基因的
表达量达到最大，随后又逐渐降低。而用
250 mmol /L NaCl处理 1 h后，该基因的表达迅速
增加，3 h时达到最大，随后开始降低，24 h 和 0 h
时表达量相当。在 20% PEG6000 溶液的处理下，
1 h后表达量开始逐渐增加，6h时达到最大，随
图 8 不同胁迫下 HhDＲEB2 基因的表达模式分析
Fig． 8 Expression profiling analysis of HhDＲEB2
with the treatment of different stresses．
67 中 国 农 业 科 技 导 报 16 卷
后迅速下降。但是在不同激素的胁迫下，
HhDＲEB2 基因的表达无明显的变化。因此，可推
测出 HhDＲEB2 基因的表达受低温、高盐和干旱
的诱导响应，而对外源激素的刺激无响应，进一步
说明该基因可能不参与 ABA 依赖的信号调节
途径。
3 讨论
DＲEB转录因子在植物应答环境胁迫的信号
转导途径中起重要的调控作用。CBF1、DＲEB1A
和 DＲEB2A是最早从拟南芥的 cDNA文库中分离
得到的 DＲEB 类转录因子［7，8］。经 NCBI 检索发
现，至今已从许多植物中克隆的 DＲEB 转录因子
基因的 mＲNA序列有 238 条，主要集中在双子叶
草本植物中，而对木本植物 DＲEB 转录因子基因
的研究较少。因此，本研究以沙生豆科植物铃铛
刺为材料，采用了同源克隆和 ＲACE技术，成功地
克隆了 1 个 DＲEB 类转录因子基因—HhDＲEB2。
因其氨基酸序列 N 端 33 － 96 的氨基酸区域为
AP2 /EＲF保守结构域，且在保守结构域的第 14、
19 位分别为缬氨酸(V)和谷氨酸(E)，这表明该
转录因子为 AP2 /EＲF 家族中的 DＲEB 亚家族转
录因子中的成员。
利用生物信息学软件对 HhDＲEB2 基因进行
分析，其在 108 ～ 626 bp 处为开放阅读框，编码
172 个氨基酸残基，无内含子序列。HhDＲEB2 蛋
白质的分子质量为 1． 970 2 kDa，等电点 8． 92，且
定位于细胞核。经氨基酸多序列同源比对发现，
AP2 /EＲF 保守结构域中的第 14 位为缬氨酸
(V)，第 19 位为谷氨酸(E)，这两个保守的氨基
酸残基在识别顺式作用元件过程中起着至关重要
的作用［5］。对该基因所编码蛋白以及同源蛋白
的进化关系分析表明 HhDＲEB2 蛋白的进化介于
大豆 GmDＲEB1 和 GmDＲEB2 之间，与 GmDＲEB1
的亲缘关系更近，归属于 DＲEB 亚家族的 A5
组［9］。DＲEB 类转录因子主要被划分为两类:
DＲEB1 型和 DＲEB2 型，分别参与两种信号传导
途径，前者与低温胁迫有关，后者主要与干旱和高
盐胁迫有关，但有时也会出现交叉途径［10，11］。Jin
等［9］用盐胁迫处理转 GmDＲEB1 基因的苜蓿，发
现转基因苜蓿比对照组明显地增强了对盐胁迫的
耐性。Chen 等［12］的研究认为，GmDＲEB2 基因的
表达受干旱、高盐、低温以及脱落酸的诱导，并且
体外试验发现 GmDＲEB2 可以特异地结合 DＲE
元件。因此，可以推测 HhDＲEB2 转录因子基因
可能参与植物对低温、干旱、高盐等逆境的应答
反应。
同时，对 HhDＲEB2 基因的表达模式分析表
明，在不同激素的处理下，该基因转录水平的表达
量无明显的变化。结合先前的研究:大部分的
DＲEB2 类转录因子不参与 ABA 依赖的信号传导
途径［13，14］。以此，推测该基因参与不依赖 ABA
信号传导途径的逆境胁迫应答机制。在酵母中通
过单杂交的方法，验证了该转录因子的转录激活
功能。类似的研究报道，如拟南芥 G-box 结合蛋
白 GBF1，玉米的 C1、VP1，菜豆的 PvAlf，水稻的
PCF1、PCF2 以及烟草的 JEＲF1［15 ～ 19］。通过构建
目的基因与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体
对编码蛋白进行亚细胞定位研究，该方法操作简
单，实验周期较短，灵敏度高，被广泛应用［20］。本
研究将构建的融合表达载体 p163-GFP-HhDＲEB2
在洋葱表皮细胞中进行瞬时表达，发现 HhDＲEB2
蛋白定位于细胞核中。以上对 HhDＲEB2 基因功
能的初步研究，为后续的基因功能验证、转录因子
的作用机制提供了指导并奠定了基础。最终，希
望获得在作物抗逆性改良方面具有应用潜力的候
选转录因子基因。
参 考 文 献
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会议索引
中国兽医药品监察所动物药品学分会 2014 年学术年会(9)，第十二届全国土壤微生物学术讨论
会暨第五届全国微生物肥料生产技术研讨会(22)，农产品产地环境质量与绿色农业生产国际研讨会
(33)，中国环境科学学会生态农业专业委员会 2014 年学术年会(108)，第六届全国微生物遗传学学
术研讨会(142)
87 中 国 农 业 科 技 导 报 16 卷