全 文 ：申 旧 种 堂
第 3 0 卷 第 4期 S C I E N C E IN C H IN A
( C 辑 )
S e r i e s C ) 2 0 0 0 年 8 月
拟南芥中一个新的 sn 0 RN A 基因簇的
鉴定及结构分析 *
周 惠 孟 清 屈 良鸽 “
(中山大学生物工程研究中心 , 广州 5 10 2 7 5)
摘要 在拟 南芥中发现和鉴定 了 2 2 Sno R N A 基 因簇 , 该基 因簇由 4 个相 同的
2 2 s n 0 RN A 基因组成 , 分别命名为 Z a , Z b , Z c 和 Z d . 在 2 2 S n o R N A 基因簇的基因
间隔区中没有发现 已知的植物 s n 0 R N A 基因保守的启动元件 , 因此 , 2 2 S n o R N A 基因
簇是由一个上游启动子控制转录的 . 对 2 2 s n o R N A 基因间隔区序列的二级结构分析也
表明 , 在 3 个基因间隔区中都编码 一种与酿酒酵母 S n o R N A 前体切割加工的识 别信号
类似的发夹结构 . z Z sn 0 R N A 基 因簇的发现 , 揭示出植物 S n 0 R N A 基因具有多拷贝的特
点 , 并为进一步研究植物 Sno R N A 基因簇的转录和转录后的加工机制提供 了一个良好
的研究体系 .
关键词 2 2 s n o R N A 拟南芥 r R N A 甲基化
最新的研究表明 , 发生在细胞核中的 r RN A 前体的加工成熟过程需要大量的核仁小分子
R N (A sn
o R N )A 的参与 [ ’ , 2] . 迄今为止 , 新发现和鉴定的 s no R N A 已达 130 余种 , 主要来自脊椎
动物和酵母 ; 而植物中发现和鉴定 出来的 s no R N A 只有 10 余种 , 主要是在水稻 、 玉米等植物
中 . 已发现和鉴定的植物 S no R N A 虽然在种类上与动物有较大的相似性 , 但是在 s no R N A 基因
组织方式上与动物有很大差异 . 例如 , 我们过去报道在水稻 H s p 7 0 基因的第 1 个内含子中连
续编码多个 S no RN 1A 3 ,4] ; eL ad e r等人 5[] 在玉米中发现成簇的的 s on R N A基因 . 植物 Son R N A 基
因簇的表达过程和机制至今尚未被 阐明 . 由于植物 中发现和鉴定的 son R N A基因数量较少 , 因
此采用各种方法发现和鉴定植物中新的 s no R N A 及其基因组织 , 对于阐明植物 S no R N A 基因
的表达和调控过程及机制具有重要 的意 义 , 也是 目前该领域国际竞争的前沿 6[] . 拟南芥
(A ar b id op is ht
o
ial an )作为植物分子生物学研究的模式植物 , 其基因组全序列的测定即将完成 ,
各类基因的识别和鉴定已成为 当务之急 . 虽然 , 拟南芥中大量 的编码蛋白质基因被源源不断地
鉴定出来 , 但是 目前在拟南芥中仅发现和鉴定 了一个 u 3 Sno R N A 基因 .
本研究通过对拟南芥基 因组数据库分析 和实验验证 , 发现 和鉴 定 了拟 南芥 中一个
2 2 s no R N A 基因簇 , 并对 2 2 s on R N A 基因簇的结构及表达方式进行了分析和讨论 .
19 9 9
一
0 5
一
1 2 收稿 , 1 9 9 9一 0 9 一 2 9 收修改稿
* 国家自然科学基金重点资助项 目 (1[ t准号 : 3 9 7 3 0 3 0 0)
* * 联系人 ( E 一 m a i l : L s b r e 0 4 @ z s u 七 du . e n )
第 4 期 周 惠等 : 拟南芥中一个新的 s no R N A 基因簇的鉴定及结构分析
1 材料与方法
通过 In te r ne t 以 B L A S TA 和 FA S TA 程序对国际基因数据库中的的核酸数据进行分析 l7] ,
再以 P C g e n e 6 . 0 软件包对所获数据作进一步序列鉴定和分析 .
用于总 R N A 提取制备的拟南芥新鲜幼苗 由中国科学院遗传研究所李家洋博士和中国农
业大学植物学系武维华博士提供 . 按酸性异硫氰酸肌法提取纯化总 R N A {” ] .
用于 2 2 sn o R N A 基因簇 N or t h er n 杂交或逆转录分析的寡核昔酸探针 (或引物 )序列为 5 `
G G G AT C A G A C T G A C G T G C A A A T A 3
` , 位于 2 2 Sn o R N A 序列的 3 ’ 末端 . 寡核昔酸探针的
5
’ 端以 -Y[ 3 2 P] AT (P 北京亚辉公司 )标记 9[] , 10 此 总 R N A 以 8%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离 ,
转移至尼龙膜 (A m er s ha m ) , 尼龙膜经紫外交联后以标记探针进行杂交检测 [ ’ “ } . 逆转 录反应 的
体积为 2 0 林L , 含 10 林g 总 R N A , 2 0 n g 睁 , ZP ]灯 P标记的特异性引物和 2 5 0 林m o l zL 的 d N T P, 反
应液经充分混匀后 , 于 65 ℃变性 5 m in , 置 42 ℃保温 10 m in , 加人 2 0 u M 一M vL 逆转录酶
(P or m ge a)
, 于 4 2 ℃延伸反应 60 m in , 以 8 ’ m ol L/ 脉素一 8% 聚丙烯酞胺凝胶电泳检测逆转录结果 .
2 结果
用计算机对欧洲 E M B L 基因库和美 国 S t an fo dr 大学的拟南芥基因组数据库进行分析 , 发
现了一批具有 S no R N A 基因结构特征的 D N A 序列 (屈 良鹊等 , 待发表 ) , 其中一段位于拟南芥
第 2 号染色体上 (克隆编号 B a c F 14 B Z )第 7 0 2 0 5一7 0 7 6 8 位 , 命名为拟南芥 2 2 D N A (图 一) . 该
D N A 包含 4个分别具有反义 S no R N A 结构特征的序列 , 即具有 b o x C (T G AT G )A 和 b ox (D C T G )A
7 0 14 1 70 8 60
染色体 n
( B a e F 14 B Z )
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( b )
图 1 拟南芥 2 2 Sno R N A 基因簇的模式图 a( )和拟南芥 2 2 S no R N A 基因簇的序列 (b)
sn 0 R N A 基因以大写字母排出 ; b o x C 和 b ox D 序列 以线框出 , 与 2 5 r R N A 互补的 13 个核昔酸以下划线标明
中 国 科 学 (C 辑 ) 第 03 卷
两个保守 的 sno R N A 结构元件 , 紧接 b ox D 上游均有一段长达 13 个核昔酸的反义 Sno R N A 功
能序列 (图 1 中以下划线标出 ) , 该序列可与拟南芥 25 5 : R N A S ` 端的一段保守核心序列互补 ;
在 b o x C 的上游和 b ox D 的下游分别有一段 4 一6 个核昔酸的反向重复序列 , 可使对应的 R N A 分
子形成较为稳定的末端二级结构区 . 将上述 4 个可能编码 sno R N A 的序列进行排列和比较 (图
2)
, 发现它们之间的序列差异可达 25 % 以上 , 但是功能序列完全相同 , 因此是 同一种 s on R N A
基因 . 将该基因与各种生 物 中已 鉴定 的 S on R N A 基 因进行比较 , 发 现该基因与酿酒酵母
(s a e e h a or m 夕e e s e e re v i s i a e ) 2 2 s n o R N A 有相同的功能序列 , 所以命名为拟南芥 2 2 s n o R N A 基
因 . 以上分析表明 , 2 2 D N A 是一个编码 4 个 2 2 S no R N A 的基因簇 , 是拟南芥中的一种新的
s
no RN A 基因组织 .
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图 2 拟南芥 2 2 s no R N A 基因的核昔酸序列 比较
短划表示相同的核昔酸 ; 星号表示缺失 ; 2 2 Sno R N A 末端可配对的核昔酸 以箭头指示
nt M at M at
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6 4一
5 7一
5 1—
(
a ) ( b )
图 3 拟南芥 2 2 s no R N A 的鉴定
(
a
) 以 P z Z 为探针对拟南芥总 R N A 进行 N o r t h e r n
杂交的结果 ; (b) 以 P Z Z 为引物对拟南芥总 R N A 进行
逆转录 的结果 . M 为 p B R 3 2 2 质粒用 H a e l 和 T a g l
酶切后以 Y-[ , Z P] AT P 标记的分子量标准 ; a t为 10 此
拟南芥总 R N A
根据 2 2 D N A 中的 S n 0 R N A 编码区序列 , 设计
合成了一个 2 个核普酸长的 2 2 Sno R N A 特异性探
针 (或引物 ) P Z Z , 对 2 2 S no R N A 基因簇的表达产物
进行实验验证 . 以 3 2 P 标记 P z Z 对拟南芥总 R N A 进
行的 N or t h er n 杂交的结果证实 (图 3 a() ) , 在严格的条
件下 , P z Z 探针仅与一个大小为 80 个核昔酸的
R N (A 即 2 2 s n o R N A )稳定地杂交 , 这一长度与预期
的结果相吻合 , 因为大部分具有 b ox D 和 b o x C 的
s n o R N A 的 5 ` 和 3 ` 末端都在其 b o x C 上游和 b o x D
下游 10 个核昔酸以内 . 这一结果也表明 , 由 4 个不
同基因拷贝所编码的 2 2 S on R N A 在长度上没有明显
的差异 . 以 P z Z 为引物对拟南芥总 R N A 进行逆转
录 , 得到一个长度为 80 个核昔酸的 c D N A (图 3( b) ) ,
根据这一结果 ,可进一步将 2 2 Sno R N A 的 5 ` 末端定
位于 b ox C 上游第 6 (或 7) 个核昔酸处 .
用计算机对 2 2 s no R N A 基因簇的基因间隔区进行分析表明 , 各个 Sno R N A 编码区紧密相
联 , 间隔区长度仅为 76 一80 bP , 富含尿嚓吮核昔 (达 45 % 以上 ) , 其中没有发现已知的植物
第 4期 周 惠等 : 拟南芥中一个新的 S no R N A 基因簇的鉴定及结构分析
s
no R N A 基因保守的启动元件 , 因此 , 2 2 S no R N A 基因簇是由一个上游启动子控制转录的 . 对
2 2 s no R N A 基因间隔区的结构分析也表明 , 在 3 个间隔区中都编码一种发夹结构 (图 4) , 与酿
酒酵母 s no R N A 多顺反子前体切割加工的识别信号十分类似 17 } .
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图 4 拟南芥 2 2 Sno R N A 间隔区的二级结构分析
3 讨论
2 2 s no R N A 首次被发现于酿酒酵母中 , 是一种指导酵母 25 5 r R N A A m 8 74 核糖甲基化的
反义 S no R N A 7t] . 虽然该段 : R N A 序列保守地存在于人与植物之中 , 但尚未在酵母之外的生物
中发现对应的 Sno R N A . 拟南芥 2 2 Sno R N A 的发现 , 表明该基因的结构和功能在生物进化中
的保守性 , 并且有可能存在于多种真核生物中 . 但是拟南芥 2 2 S no R N A 基因组织与酵母有不
同之处 , 拟南芥 2 2 S no R N A 基因簇是由 4 个相同的 2 2 S no R N A 基因组成 , 而酵母 2 2 S no R N A
基因却与另外 6 个不 同的反义 S no R N A 基因组成了一个基因簇 , 这表明 , 2 2 S no R N A 的基因
组织在生物进化过程中发生了变化 . 同时 ,也反映出植物中的 s no R N A 基因具有多拷贝的特点 .
由于拟南芥 2 2 Sno R N A 基因簇与酵母 s no RN A 基因簇在基因间隔区中有相似的结构 , 因此可
能与酵母 S no R N A 有类似的转录和加工机制 , 即以多顺反子 S no R N A 前体的方式转录 , 单个
s
no R N A 分子的释放 以及成熟需要一种核酸 内切酶 (R N A 酶 l )的参与 , 以及一些外切核酸酶
的修饰 17] . 对植物 R N A 酶 1 的研究将有助于这一加工过程和机制 的阐明 .
在玉米和水稻中已发现几种 S on R N A 基因簇 , 拟南芥 2 2 S no R N A 基因簇是双子叶植物中
第 1个被鉴定的 S no R N A 基因簇 ,我们在拟南芥基因组 中还发现多个 Sno R N A 基因簇 (待发表 ) ,
这些结果表明 , Sno R N A 基因簇是高等植物 S no R N A 基因组织存在的一个普遍形式 . 拟南芥
2 2 sn o R N A 基因簇的发现和鉴定 , 为进一步揭示 Sno RN A 基因组织 的多样性及表达新机制提
供了良好的研究体系 .
拟南芥 zZ a , z bZ , 2z 。 和 zZ d S no RN A 基因序列已被 国际基因数据库 EM B L 收录 , 收录号
分别为 A JO 10 6 6 9 , A J 0 10 6 7 0 , A J O 10 6 7 1 和 A JO一0 6 7 2 .
参 考 文 献
M
a x w e l l E S
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F o u r n i e r M J
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T h e sm a l l n u e l e o l a r R N A
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3 8 6 中 国 科 学 ( c 辑 ) 第 3 0 卷
l 0
s P e e i e s P o i nt s t o t he i r d i r e e t r o l e a s g u ide s fo r t h e Z
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