全 文 ：第 1 7卷 第 3 期
19 9 5 年 9 月
云南大学学报 (自然科学版 )
Jou r na lo fY u
a n n nU n l ve s ri ty
VOI
.
1 7
S e P
.竺
l夕9 5
微生物降解紫茎泽兰毒素的初步研究①
余晓华 江蕴华 张 无敌 赵 凡
(云南省微生物研究所 , 昆明 , 65 009 1)
摘要 紫茎泽兰 ( E u那 lo lr u m a de on 神 or u m S p r en g) 是一种世界性恶性有毒植物 . 本文首次
报道 T 两种微生物 [A s详限 il lu s u s r u s (B a in ie r ) T h o m e t c h r u e人, 尸 e n ie i zlu m e六即 5 0 。 n u o T h o m
能显著降解其主要毒素 .
关键词 微生物 , 降解 , 紫茎泽兰 , 毒素
紫茎泽兰分布于世界 30 多个国家 . 目前已在我国的云南 、 四川 、 广西 、 贵州等省内
广泛发生 . 鲜紫茎泽兰导致地方性马哮喘病 , 对其它牲畜和人类都有一定的伤害 . 对 沼气
发酵微生物群有也慢性毒害作用 . 它霸占上亿亩的 山地 , 形成单优群落 , 导致特殊的 `性
态灾难 ” 〔’ 〕 . 目前查 明 , 紫茎泽兰含有毒丹宁类 (可水解丹宁和缩合丹宁 )7 . 8 1% ; 香豆素
类 0 . 34 % ; 挥发油类 (芳香油 ).0 8 m l门 0 9 ( T )S . 微生物能降解各种有机物 , 已为人们所
熟悉 . 但是 , 某些微生物能否降解上述植物毒素 , 并用于快速地大批量处理有毒植物 , 则
未见报道 . 本文报道在这方面的研究应用结果 .
1 材料和方法
L l 待测菌株来源
待测菌株来 源于紫茎泽 兰批量脱毒 过程及随机的外 来菌株 . 鲜 紫茎泽兰 来 自昆明
西郊 . 为了证明某些微生物对紫茎泽兰毒素的专噬性 , 配制了不常用的 “ E . A . S ”琼脂 .
其具体做法是 : 选取幼嫩的紫茎泽兰茎 、 叶 、 花等 250 9 , 洗净 , 加水 10 0 0 m l , 在匀浆
机 中捣碎 10 m in , 煮 沸 30 m in , 四层 纱布 过 滤 , 将 滤 液 按 2 % 加 琼 脂溶 化 分 装 ,
98
.
0 7 k P a / 2 0 m in 灭菌 , 作为实验菌株的传代培养基 .
1
.
2 紫茎泽兰丹宁降解率的测定
选用了“ 皮粉法 ” . 其具体做法是取样品适量 (准确称取 ) , 采用一种简易水蒸气抽提器
进行抽提 , 约抽提 150 m l 左右 , 用 9% 的 F e CI : 液检验其滴出液 , 直至呈负反应为止 .
将此抽提液加水稀释至 2 50 m l , 冷置后 , 过滤去除析出沉淀 . 再将此滤液用 “ 皮粉法 ” 测
定其中靴质含量变化 〔 2〕 .
由于 紫 茎 泽 兰 丹 宁 含 量 不 高 , 提纯 有 一定 困难 , 我 们 采 用 了 市 售 的 丹 宁 酸
(T a n in
n c ac 记 )代替 , 定量加入麦鼓培养基成分 , 以测定菌株降解丹宁的能力 . 并用 F e C 13
比色法半定量比较降解程度 .
1
.
3 紫茎泽兰所含香豆素的降解率测定
化学上香豆素种类很 多 , 其测定方法也有多种 , 我们选用了分光光度比色法 ( 7 21 分
工本课题先后得到农业部环 能司 、 中国生物质能技术开发中心 、 云 南省科委的资助 . 19 9 4 一 0 9 一 2 6收稿
2 6 0 云南大学学报 ( 自然科学版 )第 17卷
光光度计 ).其基本原理是利用破坏香豆素中内醋环所产生的酚基 , 与试剂反应呈红色 . 利
用这种红色 , 在波长 只二 50 n m 处 比色测定 川 .
由于紫茎泽兰香豆素含量很低 , 提纯更加困难 . 故仍选用市售的香豆素 (C o u m ar in) 代
替 , 定量加入普通培养基 (固体 )以测定菌株降解香豆素的能力 .
1
.
4 紫茎泽兰芳香油降解率的测定
这项测定 , 我们选用了市售的 “ 挥发油测定器 ” . 定量称取脱毒前后的紫茎泽兰样品 ,
加热蒸馏 , 读数 , 计算其中芳香油的变量 .
2 结果
l) 为 了初步证 明广泛分布的常见微生物 (细菌 、 酵母 菌 、 放线菌 、 半知菌 )是否都能
适应特殊的紫茎泽兰基质 . 我们从各个方面搜集到 4 株菌株 , 接种 于 “ E . A . S ”琼脂上 ,
以观察这些微生物能否生长 . 其结果列于下表 1 .
表 1 各微生物在 E . A . S 琼脂上的生长情况
T a b 1
.
T h e g r o w th o f m ie r o b e s i n E
.
A
.
S e u ir u r e m e d i u m
生 长 情 况 能生长的
株数
微生物
类别 良好 (+ + +) 一般 (+ + ) 微弱 (+) 不生长
株数 Y / % 株数 Y / % 株数 Y / % 株数 Y / %
占投人
株数百
分率 / %
试验菌株数
总 数 2 5 . 0 1 5 . 9 25 56 . 8 1 9 4 3 . 2
细 菌 29 . 0 1 1 64 . 7 3 5 . 3
酵母菌 10 . 0 1 0 . 0 8 80 . 0 2 0 . 0
放线菌 2 22 . 2 6 66 . 7
半知菌 8 8 100
3 3
.
3
10 0
,、àn石
}一占试验菌株总数的百分率
从表 1看出 , 并不是各种常见微生物都能适应特殊的紫茎兰基质 . 在初筛 中 , 只有
43
.
2 % 的菌株基本上能够生长 , 大部分不能生长 . 其 中 , 以半知菌类的 8 株入筛选菌株生
长较好 . 将基本上能够生长的菌株继续反复地用 “ E . A . S” 琼脂传代转接 中发现 , 不是全
部都能长期适应紫茎泽兰基质 . 大部分在转接 中不再生长 , 还是只有半知菌类的几株能在
这种传代过程 中良好地生长繁殖 .
2) 为 了深 入 研究 这些 菌 株对 紫 茎泽 兰毒 素 的降 解机 理 , 将上 述 8 株半 知 菌 在
“
E
.
A
.
S ” 琼脂 上的第 6 代接种于含不同浓度的纯丹宁麦鼓培养基上 , 观察生长情况 . 其
结果见表 2 .
表 2 表示 , 不同菌株在含有不同浓度丹宁的麦鼓培养基上的长势是不一样的 . 14 # 由
于长期在不适宜的紫茎兰基质 中生活 , 繁殖力逐渐丧失 , 此时已经不能再繁殖 . 1 9二在一
般麦鼓培养基上生长繁殖良好 , 在含丹宁的基质 中则不再繁殖生长 .
第 3 期 余晓华等 :微生物降解紫茎泽兰毒素的初步研究
表 2 8株菌在含纯丹宁培养基上的生长势
Ta b 2
.
T He w a s 8s ta ri s nw e e rg o rw i ng i n Ta n ni ne ea i de u l tu re me di u m x1 0
浓度 (砰 ) 3 00 01 0 0 0 0 2 0 0 0 0 45 0 0 0 0 0 0 0 07 0 0 0 0
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + 十
+ + + + 十+ 十+ + + + + 十+ 十 + + +
+ + + + + + + + + + + + 十+ + + + +
+ + + + + + + + 十 + + + + + + + + + 十+ +
一升耸#牡才 4lr、à ùU`
,.盖1J.几
j且
1 8~ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
19 一 + + + 一 一 一 一 _ _
“ 一 ” 表示接种后不长菌 , “ + + + ” 表示生长很 好
由于许 多微生物对 其基质 中的某些 特殊化学成 分表 现为忍耐 或转化 利用两种不 同
情 况 〔 4 〕 , 我们进一步用比色法比较研究 了选出的 6 株菌对丹宁的转化能力 . 结果显示 ,
1 1#
,
1 3#
,
16# 菌株对丹宁的分解转化能力比较强 . 2# , 4 # 的转化能力就比较弱 . 18# 的转
化能力最弱 , 只表现了忍受性 . 进一步用 “ 皮粉法 ” 定量侧定 1 6# 菌株对丹宁的转化力 , 其
转化率达 72 . 2 4% .
3) 将上述 6 株半知菌接种于 “ 香豆素一马丁琼 脂 ” 上 , 观察了它们的生长情况 . 其结
果见表 3 .
表 3 6 株菌在 “ 香豆素一马丁琼脂”上的长势
T a 3
.
T h e w a y 6 s t
r a i n s w e r e g r o w i n g i n E
.
A
.
S一M a r t in c u lt u r e m e d iu m 义 10 6
浓度 (W ) 0 100 50 0 1 00 0 5 0 00
2# + + + + + + + + + + + 一
4# + + + + + + + + + + + 一
1 1一 + 十 + + + + + + + 一 一
13# + + + + + + + + + - -
16# + + + + + + + + + - -
18# + + + + + + + + + + + 一
“ 十 ” 越多表示生长越好 ; “ 一 ”表示不生长
表 3 显示 , 6 个菌株对香豆素的忍受或转化能力比转化丹宁的能力要低得多 . 基质 中
含香豆素量达 5 0 0 x l0 一 “ 时 , 全部不能生长 , 繁殖受到抑制 . 其 中的 1 1# , 13# , 16 # 则
在 1 0 0 0 x l-0 “ 就受到抑制 . 我们还用定性 比色法测定 了 6 株菌株对香豆素的转化能力 ,
结果表明 , 2二 , 4气 1 8# 转化香豆素的能力最强 . 这与表 3 指出的各菌株长势变化是吻合
的 . 为了定量测定这 3 株菌转化香豆素的能力 , 我们用 7 21 型分光光度具体测定 了它们的
转化力 . 其结果是 : 2# = 92 . 2% ; 4扛一 % . 1% ; 1 8# 二 94 .0 % .
2
.
1 菌种的分类鉴定
2 6 2 云南大学学报 ( 自然科学版 )第 17卷
将 1 1二 , 1 3= , 】6二 , 4 = , 18二 , 用标淮的察氏培养基接种 , 在培养皿上进行三点植入
和试管斜面 卜划线接种 , 恒温 28 ℃培养 s d 后进行 详细分类鉴定 . 参考 《常见与常用真
菌》 和其它分类手册 〔 , 〕看出 , 1广 、 1 3# , 16 # 属于曲霉属的同一种 ; 2# , 4# , 18 #则属于
青霉属的同一种 , 两种的分类地位区别较大 .
1 1二 , 1=3
,
16 二菌落的镜检特征 : 菌落生长较快 、 絮状 、 最初黄褐色继变为褐色或絮
状灰色 、 反面为淡 黄色 . 基外菌丝的分生抱子头成不规则半球形 、 顶囊半球形至近球形 、
上 部 2 / 3 处 着生 小梗 、 小梗 双层 、 分 生抱 子球形 粗糙 . 定名 为 焦黄 霉 〔 A s详 gr il us
u s z u s ( B a i n i e r ) T h o m
e t C h u r c h 〕 .
2二 , 4 二 , 18二的菌落和镜检特征 : 菌落生长快 、 致密绒状 、 有的菌落略显絮状 、 有 明
显的放射状沟纹 、 边缘 白色 。 抱子很多 、 蓝绿色 。 菌落渗出液聚成醒 目的淡黄色大滴 , 很
具特色 ; 无特殊气味 . 色素扩散 于培养基内 . 基外菌丝的分生抱子梗呈帚状枝 , 非对称 ,
自主轴作 2一 3次分枝 . 分生抱子链呈相当明确的分散粒状 . 分生抱子椭圆型 、 壁光滑 . 定
名为产黄青霉 ( p e 。 i e zzu m e人尽 s叮 e n u m T h o m ) ·
.2 2 紫茎泽兰的脱毒利用试验 闹
采用产黄青霉和焦曲霉的混合菌种对紫茎泽兰脱毒 , 批量发酵 1 . 5 t 一堆 . 发酵室或
野外温度 25 ℃左右 , 发酵堆心温度达 5 ℃ . 湿度保持在原料不干缩 . 7 d 发酵成熟 .
发酵脱毒处理后的紫茎泽兰 , 其丹宁降解率 > 70 % ; 香豆素降解率为 67 . 0% ; 芳香
油总体降解率为 91 . 2% . 经用小白鼠进行毒理试验表明 , 其毒性已经消除 .
脱毒处理的紫茎泽兰 , 含粗蛋白 19 . 74 % ; 粗纤维 17 % ; 粗脂肪 2 . 5% . 利用作沼气
发酵原料 , 产气率为 7 m , / t 鲜料 . 利用它作成的配合饲料 , 用于养猪 、 鸡 、 兔等 , 其
增重均达到或超过国内一般水平 〔7〕 .
3 小结
l) 有什 么微生物能 降解香豆素类 , 目前未见报道 . 本文报道产黄青霉能 降解香 豆
素 , 则还是首次 . 有人报道 了黑 曲霉 (A s尸 n g l’ lus n心er )和青霉 (尸en i ic lu o iL n k) 可以用 于
工业生产的丹宁转化 . 本文报道焦曲霉也能转化丹宁 , 仍是首次发现 .
2) 上述全部研究结果表 明产黄青霉和焦曲霉各有转化重点 , 产黄青霉转 化香豆素 、
焦曲霉转化丹宁 . 两者都能适应特殊的紫茎泽兰基质 . 这两者可以作成复合菌种 . 在生产
上的应用已达到开发规模 , 并通过了省级专家鉴定 .
3) 本文提到紫茎泽兰芳香油总体降解率为 91 . 2% , 但参与这一降解过程的微生物还
有待深入研究 .
致谢 段群彗 、 李红梅 、 危 亮 、 王海涛 、 徐敏冲参与 了本项研究 , 杨 发 蓉副教授参与
了菌种 鉴 定 , 云 南省 微生物研 究所其他 同志提供 了部分入试菌种 . 借此一并致谢 .
参 考 文 献
薛纪如 , 董世仁 , 洪椒德 , 等 . 紫茎泽兰 的适应性能 、 危害情况及防除措施 . 云南植物研究 , 19 79,
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吕湘林 , 沈珠凤 . 一种简单的水蒸汽抽提器 . 药学通报 , 19 63 , 9 (8) : 370 一 3 71
第 3期 余晓华等 : 微生物降解紫茎泽兰毒素的初步研究 2 6 3
沙世炎 , 严敏如 , 曾纪淡 , 等 . 中草药有效成分分析法 ( L册 ) . 北京 : 人民卫生出版社 , 1 9 82 . 75
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【美 ]H . L . 巴尼特著 , 半知菌属图解 . 沈崇尧译 . 北京 : 科学出版社 , 19 7 . 93
J i a n g Y u n h u a
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H a r t m a n n L
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A P r e l im i n a r y S t u d y o n R e d u e i n g t h e T o x i n s
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Y u X i a o h u a J i a n g Y u n h u a Z h a n g W
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P o i s o n o u s h e r b
.
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,
C o u m a r i n s a n d E s s e n t i a l 0 115
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P e n ic il u m e h yr s og
e n u m T h o m l t h a t e a n r e d u c e t h e m
.
K e y w o r d s m i c r o b e s
, r e d u c e
,
E u脚 t o r i u m a de n o砷 o r u m S P r e n g , t o x i n s