全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(9): 14451453 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08002-003B), 陕西省农业科技攻关项目(2013K02-01), 陕西省科技统筹创新工
程计划项目(2014KTZB02-01-01)和北京市科技计划项目(Z14110000231418)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 闵东红, E-mail: mdh2493@126.com, Tel: 13609123593; 陈明, E-mail: chenming02@caas.cn, Tel: 13683360891
第一作者联系方式: E-mail: wangerhui191132@163.com, Tel: 13366320737 **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2015-03-27; Accepted(接受日期): 2015-06-01; Published online(网络出版日期): 2015-06-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150612.1503.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01445
谷子转录因子基因 SiNAC45 在拟南芥中对低钾及 ABA 的响应
王二辉 1,2,** 胡利芹 2,** 薛飞洋 1,2 李微微 2 徐兆师 2 李连城 2
周永斌 2 马有志 2 刁现民 2 贾冠清 2 陈 明 2,* 闵东红 1, *
1 西北农林科技大学农学院 / 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物
基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与作物遗传育种重点实验室, 北京 100081
摘 要: NAC (nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的
调控作用, 目前, 关于 NAC 转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基
础上, 对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的 NAC 类转录因子基因 SiNAC45 进行了深入研究。结果表明, SiNAC45
基因全长 1383 bp, 编码 461个氨基酸, 分子量为 50.7 kD, 等电点为 6.92。SiNAC45在 20~100个氨基酸之间有一段 NAM
保守结构域。系统进化树结果显示, SiNAC45位于 NAC基因家族的第 1亚族。基因表达谱分析显示, SiNAC45主要在谷
子根部表达, 并且能够被低钾和 ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示 SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,
在不同浓度低钾处理下 , 和野生型拟南芥相比 , SiNAC45 转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加 , 说明过表达
SiNAC45 可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示, 在 SiNAC45 转基因植物中两种重要的
钾离子转运体基因 AKT1和 HAK1的表达显著提高, 证明 SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低
钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示, SiNAC45 转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对 ABA 的敏感性降低, 说明
SiNAC45可能负调 ABA信号。
关键词: 谷子; NAC转录因子; 低钾胁迫; ABA反应; 基因功能分析
Overexpression of Millet Transcription Factor Gene SiNAC45 to Response of
Low Potassium Stress and ABA Treatment in Transgenic Arabidopsis
WANG Er-Hui1,2,**, HU Li-Qin2,**, XUE Fei-Yang1,2, LI Wei-Wei 2, XU Zhao-Shi2, LI Lian-Cheng2, ZHOU
Yong-Bin2, MA You-Zhi2, DIAO Xian-Min2, JIA Guan-Qing2, CHEN Ming2,*, and MIN Dong-Hong1,*
1 College of Agronomy, Northwest A＆F University / State Key Laboratory of Arid Region Crop Adversity Biology, Yangling 712100, China; 2 Insti-
tute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility For Crop Gene Resource and Genetic Improvement / Key
Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crop, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China
Abstract: NAC (nascent polypeptide-associated complex) like transcription factors play important role in plant growth and de-
velopment, abiotic stress response, and other processes. Currently, few researches reported NAC like transcription factors involv-
ing in tolerance to low potassium stress. In this study, we found and researched a NAC like transcription factor gene SiNAC45 on
the basis of transcriptome sequence of millet under low potassium stress which had been completed in previous work. The result
show that the full-length of SiNAC45 is 1383 bp, encoding 461 amino acids, with molecular weight and isoelectric point of 50.7
kD and 6.92, respectively. There is a conserved NAM domain between 20–100 amino acids of SiNAC45. The phylogenetic tree
showed that SiNAC45 belonged to the first subfamily of NAC gene family. The gene expression profile results indicated SiNAC45
mainly expressed in roots and was induced by ABA and low potassium treatment. The protein subcellular localization results of
SiNAC45 revealed that it was localized in the nucleus. Gene functional analysis showed that under treatment with different con-
centrations of potassium, root length and fresh weight of SiNAC45 transgenic Arabidopsis significantly increased compared with
those of wild-type Arabidopsis, and there was no significant difference in the number of lateral roots between transgenic and
wild-type Arabidopsis, indicating that overexpressing of SiNAC45 in transgenic plants can enhance tolerance to low potassium
stress. Expression analysis of downstream gene showed that expression of two important potassium transporter genes AKT1 and
1446 作 物 学 报 第 41卷
HAK1 increased significantly in SiNAC45 transgenic plants, indicating that SiNAC45 affects the tolerance to low potassium stress
of plants by regulating the expression of potassium transporter gene. Seed germination test results showed that Arabidopsis carry-
ing SiNAC45 decreased the sensitivity to ABA compared with wild-type Arabidopsis, indicating that SiNAC45 maybe negatively
regulate ABA signal pathway.
Keywords: Millet; NAC transcription factor; Low potassium stress; ABA response; Gene function analysis
NAC 是一类植物中的重要转录因子基因家族[1-2], 首
次报道的 NAC转录因子与矮牵牛顶端分生组织和胚胎形
成有关[3], 随后在不同植物中报道了越来越多的 NAC 转
录因子, 到目前为止, 已经发现 100 多种 NAC 转录因子,
除拟南芥和水稻外, 在大豆[4]、马铃薯[5]、柑橘[6]、谷子[7]、
苹果[8]、葡萄[9]等其他植物中也发现 NAC 转录因子。但
是在动物中还未发现 NAC家族基因[10]。在拟南芥和水稻
中, NAC 基因家族有一百多个成员[11], 但是这些成员中
功能得到证明的却很少。NAC 家族基因在植物的发育、
形态建成、次级细胞壁、次生根、胚胎和花的形成以及抵
抗非生物胁迫过程中具有很重要的作用。NAC 家族蛋白
的共同特征是在 N端有一个高度保守的 NAM结构域, 而
在 C 端有一个序列和长度多样化的转录激活域[12], 但是
有些 NAC 家族的基因没有这种特殊的结构域 (NAM,
CUC)[13]。NAC家族转录因子能够通过这种结构域特异地
结合顺式作用元件 CGT(G/A)和 CACG来调节下游靶基因
的表达[14-15]。NAC 基因家族可以分为 5 个亚家族[16], 其
中第 3 亚家族成员在非生物胁迫响应过程中发挥重要作
用[17-18]。虽然对于 NAC转录因子基因在生物胁迫和非生
物胁迫响应中的作用有很多报道 , 但是到目前为止少见
对其参与植物耐低钾胁迫的报道。另外, 有些 NAC 家族
成员被报道参与植物对 ABA 的反应 , 例如拟南芥的
ANAC019 和 ANAC055 基因, 对于其参与 ABA 信号途径
的分子机制仍然未知[19]。
钾元素在植物生长发育和代谢过程中有很重要的作
用, 植物根系从土壤中吸收钾来维持正常的生命活动。当
土壤中缺乏钾营养时会激活植物体内两种重要的营养吸
收机制 , 一种是植物体内营养的储存和分配机制 [20], 比
如转运蛋白和转运通道。另一种是植物根系生长发育进程
的改变, 包括主根生长、侧根形成、根毛伸长[21]。文献报
道, 植物体内缺乏 K+时会激活 K+转运蛋白来促进植物根
系对 K+的吸收[20]。拟南芥中的 K+转运体有整流 K+通道
AKT1和低钾诱导 K+转运体 HAK5两种, 它们主要在低钾
胁迫时促进植物对 K+的吸收[22]。在拟南芥和其他物种中
HAK5在低钾胁迫下能够被快速激活响应钾胁迫[23]。拟南
芥根系吸收 K+有高亲和 K+吸收和与低亲和 K+吸收 2种方
式, KUP/HAK/KT家族的转运体为高亲和性 K+转运体[24],
AKT1 可以与其亚族中的成员形成异源多聚体来调节植物
根系对 K+的吸收。KAT1 主要参与植物叶片气孔打开时对
K+的吸收[25], GORK 主要控制叶片气孔关闭时 K+的流出[26]。
KUP/HAK/KT可能对维持植物体内 K+平衡有重要作用。
KUP4/TINY ROOT HAIR1(TRH1) 突变后会损害拟南芥
根毛的伸长[27]。有些转录因子可以在低钾胁迫下激活钾
离子转运体和钾离子运输通道基因转录, 例如 AtMYB35在
低钾胁迫下可以激活 KPU转运体促进植物对钾的吸收[27]。
谷子具有抗旱、耐贫瘠等特点, 是作物抗逆研究的理
想材料。目前植物中关于 NAC类转录因子的研究主要集
中在拟南芥、水稻等模式植物中, 关于谷子 NAC 类转录
因子参与植物逆境胁迫应答的分子机制尚缺乏了解。为揭
示谷子中 NAC 类转录因子的特性及功能, 本研究分析低
钾胁迫条件下表达量逐渐上升的 SiNAC45 基因的特性及
生物学功能, 旨在为研究谷子抗逆分子机制提供证据, 也
为作物耐低钾遗传改良提供新的基因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 拟南芥野生型(Columbia生态型, WT)
由本实验室保存, 谷子品种 H214 由中国农业科学院作物
科学研究所刁现民课题组提供。
1.1.2 载体和菌株 大肠杆菌、农杆菌 GV3101、pBI121
载体、GFP 载体的质粒都由本实验室保存, pZeroBack 载
体购于北京天根公司。
1.1.3 试验试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于
Promega公司; 质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、
RT-PCR 试剂盒购于天根公司; 由奥科生物技术科技有限
公司合成引物和测序; 其他化学药品为国产分析纯试剂。
1.2 进化树和基因蛋白序列分析
谷子数据来源于 Phytozome (http://www.phytozome.
net/search.php), 根据谷子 SiNAC45 蛋白序列在 Phytozome
数据库中进行同源性搜索, 下载与谷子 SiNAC45 蛋白序
列相似度较高的其他物种的蛋白序列。用 MEGA5软件对
谷子 SiNAC45 蛋白序列及其同源蛋白序列进行多序列比
对分析 , 用邻接法生成系统进化树 , 设 BootStrap 值为
1000。利用 MEME (Multiple Em for Motif Elicitation)在线
工具分析蛋白序列。利用 SMART (http://smart.embl-hei-
delberg.de/)在线工具分析谷子 SiNAC45蛋白的结构域。
1.3 SiNAC45启动子分析
从谷子基因组数据库 Phytozome (http://phytozome.
jgi.doe.gov/pz/portal.html)搜索 SiNAC45 序列并截取起始
密码子ATG上游 2000 bp作为 SiNAC45启动子。用 PLACE
(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)数据库对 SiNAC45 启
动子中的顺式作用元件进行分析。
1.4 基因的扩增及载体构建
根据谷子基因 SiNAC45 的 CDS 序列设计基因引物
第 9期 王二辉等: 谷子转录因子基因 SiNAC45在拟南芥中对低钾及 ABA的响应 1447
45-F 和 45-R (表 1), 用 TRIzol 试剂盒(TIANGEN, 北京)
提取谷子 H214植株总 RNA, 用 Primer Script反转录试剂
盒 (TaKaRa)反转录成 cDNA, 以 cDNA 为模板扩增
SiNAC45, 并将其回收纯化后连接到 pZeroBack 载体上。
以 pZeroBack-SiNAC45 质粒为模板扩增 SiNAC45, 引物为
45-F3和 45-R3。采用 In-Fusion试剂盒(TaKaRa)将 SiNAC45
从连接的 pZeroBack载体上扩增并插入带有 CaMV35S启动
子的 pBI121表达载体, 采用农杆菌转化法[28]转化拟南芥。
1.5 谷子的胁迫处理及 SiNAC45的 Real-time PCR表达
分析
谷子幼苗在营养土中正常生长(温度 22℃、相对湿度
65%、光照周期 16 h/8 h) 3周, 然后将幼苗分别移至低钾
(20 μmol L–1)、干旱(6% PEG)、ABA (100 μmol L–1)、NaCl
(100 mmol L–1)、低氮(0.2 mmol L–1氮)、低磷(5 μmol L–1)
的水培营养液中胁迫处理, 并于处理后的 0、1、3、6、12、
24和 48 h分别取样, 用 TRIzol (TianGen, 北京)提取谷子
植株总 RNA; 将低钾(20 μmol L–1)处理的部分幼苗分成
根、茎、叶, 用 TRIzol (TIANGEN, 北京)提取其 RNA; 分
别取低钾(MS+20 μmol L–1)处理转基因和野生型拟南芥植
株, 提取总 RNA 检测下游基因。分别用 6 种胁迫下的谷
子总 RNA、低钾处理下的谷子根、茎、叶 RNA和低钾处
理下的转基因和野生型拟南芥RNA反转录产物作为模板,
以 SYBR Green染料法, 在 ABI Prism 7500上进行实时荧
光定量 PCR。RT-PCR体系含 2×SuperReal PreMix Plus (含
荧光染料)(天根公司) 12.5 μL、10 μmol L–1正向引物和反
向引物各 0.5 μL、 50×ROX Reference Dye∆0.5 μL、
RNase-free ddH2O 9.5 μL。反应条件为 95℃预变性 10 min;
95℃变性 15 s, 60℃退火 20 s, 72℃延伸 30 s并收集荧光信
号, 35个循环, 用 2–∆∆Ct法计算该基因表达量。RT-PCR引
物序列为 45-F4 和 45-R4 (表 1), 用谷子 Actin 基因
(Si001873m.g)作为内参基因 , 其引物为 SiActin-F 和
SiActin-R; 下游基因检测引物为 AKT1-F 和 AKT1-R、
HAK-F和HAK-R, 内参基因(AT3G15260)引物为AtActin-
F和 AtActin-R (表 1)。
表 1 SiNAC45 基因克隆和 Real-time PCR 分析所用引物以及引物退火温度
Table 1 Primers used for SiNAC45 gene cloning and Real-time PCR analysis and annealing temperature of the primers
名称
Primer
序列
Primer sequence (5′–3′)
用途
Function
退火温度
Annealing temp. ( )℃
45-F ATGAAGGAAGCTCGAATGCGG
45-R CTAGCGCATCATCATGTCCTC
基因克隆
Gene cloning
55
45-F1 TATCTCTAGAGGATCCATGAAGGAAGCTCGAA
45-R1 TGCTCACCATGGATCCCTAGCGCATCATC
构建 GFP载体
Vector construction of GFP
63
45-F3 CTCTAGAGGATCCCCGGGATGAAGGA
45-R3 ACTAGTGGATCCCCCGGG CTAGCGCATC
构建 pBI121载体
Vector construction of pBI121
64
45-F4 TACTACGACTACCGCAGGGT
45-R4 ATCATCACCGTCCGACCAAG
实时定量 PCR
Real-time PCR
58
SiActin-F GGCAAACAGGGAGAAGATGA
SiActin-R GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG
谷子内参基因
Internal control gene in millet
58
AKT1-F TCAAGAGCATAAGCAGTTCGGT
AKT1-R AATGTAACCCGTGCAGTCCA
下游基因检测
Testing of downstream gene
60
HAK-F CATTTCAGCGGTTTGGCACC
HAK-R GCCTGCCCGCAATATATCGTT
下游基因检测
Testing of downstream gene
60
AtActin-F TGTTCCCATCAGAACCGTGA
AtActin-R CACCTGTCTTTGGGTCAACAA
拟南芥内参基因
Internal control gene in Arabidopsis
60
1.6 SiNAC45亚细胞定位
扩增 SiNAC45 基因的编码区全长, 引物为 45-F1 和
45-R1 (表 1), Bam H I酶切 GFP表达载体, 利用 In-fusion
技术构建 phGFP-SiNAC45载体。参考 Yoo等[29]的方法制
备拟南芥原生质体 , 将融合表达的重组质粒 phGFP-
SiNAC45 和作为对照的 GFP 空载体质粒分别转化制好的
原生质体, 黑暗培养 18 h以上, 并在激光共聚焦显微镜下
观察结果。
1.7 转 SiNAC45基因拟南芥的表型分析
野生型和转基因拟南芥的种子经 70%酒精处理 3 min,
无菌水洗 3次, 每次 1 min左右; 用 0.5%~0.8%的次氯酸
钠处理 10~15 min, 无菌水清洗 3次, 每次 1 min; 4℃春化
2~3 d, 然后将部分种子分别移到 MS、MS+1 μmol L–1
ABA、MS+2 μmol L–1 ABA和 MS+4 μmol L–1 ABA的培
养基中培养(温度 22℃、相对湿度 65%、光照周期 16 h/8 h)
一周, 统计种子萌发率; 其余部分种子分别移到 MS 培养
基培养 4~5 d, 再移至 MS、MS+5 μmol L–1 K+、MS+10
μmol L–1 K+培养基上生长一周, 分别测量不同处理下过
表达株系和野生型拟南芥的根长和植株鲜重 , 使用根系
扫描仪扫描根表面积, 运用方差分析软件分析统计结果。
1448 作 物 学 报 第 41卷
2 结果与分析
2.1 SiNAC45的特性分析
本研究前期对谷子低钾胁迫转录组测序 , 从中发现
一个低钾诱导下表达上调的 NAC 类转录因子 SiNAC45。
在谷子基因组数据库 (http://www.phytozome.net/)搜索
SiNAC45全长序列, 发现 SiNAC45基因全长 1383 bp, 有 3
个外显子, 4个内含子, 编码 461个氨基酸, 分子量为 50.7
kD。运用 MEGA5 软件对 SiNAC45 蛋白及其他物种中的
同源蛋白做了系统进化树分析(图 1-A, 图 1-B), NAC转录
因子共分为 5个亚家族, 其中 I亚族成员最多。SiNAC45
位于第 I 亚族, 与谷子中的 SiNAC094 进化关系最近。
SiNAC45与其他植物中的 NAC基因的蛋白序列比对结果
(图 2)显示, SiNAC45 与来自水稻、玉米、大豆等植物的
NAC 蛋白序列都包含一个 NAM 保守域, SiNAC45 与
ANAC029同源性最高, 达到 59%。
2.2 SiNAC45基因启动子分析
用 PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在线工
具分析 SiNAC45 上游启动子区的顺式作用元件(表 2), 发
现 SiNAC45 启动子区域中包含 WARK、W-box (wound
responsive element)、LTRE (cold responsive element)、MYB
(drought responsive element)、ABRE (ABA responsive
element)、MYC (ABA and cold responsive element)、I-box
(light responsive element)等逆境相关顺式作用元件, 其中
MYC元件最多, 为 32个, 其次为 W-box, 共 24个, MYB
元件为 16 个。据报道, 这些元件在植物干旱、ABA、低
图 1 谷子与拟南芥、水稻、大豆、玉米 NAC 蛋白进化树分析
结果
Fig. 1 Phylogenetic analysis of NACs protein from Seteria
italica (Si), Oryza sativa (Os), Arabidopsis thaliana (At), Glycine
max (Gm), and Zea mays (Zm)
所示物种的 NAC蛋白质序列从数据库 Phytozome v10.0.4中获得。
The NAC protein sequences in those plants were obtained from the
database Phytozome v10.0.4.
图 2 部分物种中 NAC 家族基因的进化关系
Fig. 2 Evolutionary relationship of some NAC family genes
第 9期 王二辉等: 谷子转录因子基因 SiNAC45在拟南芥中对低钾及 ABA的响应 1449
表 2 SiNAC45 启动子逆境相关顺式作用元件分析
Table 2 Analysis of cis-elements in the SiNAC45 promoter
顺式作用元件
cis-element
数目
Number
识别序列
Target sequence
功能
Function
文献
Reference
WRKY 16 TGAC WRKY结合元件 WRKY binding element Zhang Z L et al.[30]
W-box 24 TGACY 损伤响应元件 Wound responsive element Yu D et al.[31]
LTRE 3 CCGAA 低温响应元件 Cold responsive element Baker S S et al.[32]
MYB 16 GGATA 干旱响应元件 Drought responsive element Urao T et al.[33]
ABRE 7 ACGTG ABA响应元件 ABA responsive element Simpson S D et al.[34]
MYC 32 CANNTG ABA和低温响应元件 ABA and Cold responsive element Abe H et al.[35]
I-box 6 GATAA 光响应元件 Light responsive element Terzaghi W B et al.[36]
温等胁迫响应中发挥作用。
2.3 SiNAC45基因的表达模式分析
通过荧光定量 PCR 检测低氮(0.05 mmol L–1)、低钾
(0.5 μmol L–1)、低磷(0.5 μmol L–1)、干旱、脱落酸(ABA)、
NaCl (50 mmol L–1)等不同胁迫处理下的谷子幼苗植株中
SiNAC45的表达量(图 3-A)表明, 在ABA处理下, SiNAC45
的表达量逐渐上升并在 48 h 时达到峰值, 表达量是处理
前的 6 倍; 在低钾处理下, SiNAC45 的表达量逐渐上升,
在 48 h 时达到最高值, 表达量提高了 35 倍; 在 PEG、
NaCl、低氮和低磷处理下, SiNAC45的表达量提高并不显
著, 表明 SiNAC45对低钾胁迫和 ABA有明显响应。
SiNAC45 在谷子组织表达特异性分析结果(图 3-B)显
示, 在正常生长和低钾处理条件下的谷子根、茎和叶均有
SiNAC45的表达, 在正常条件下 SiNAC45在根部的表达量
最高, 在低钾处理条件下, SiNAC45 在根部的表达量相对
增加(图 3-B), 证明 SiNAC45主要是在根部响应低钾胁迫。
图 3 SiNAC45 在不同处理下的表达模式
Fig. 3 Expression patterns of the SiNAC45 gene under various treatments
A: 不同处理下 SiNAC45的表达模式; B: 正常生长和低 K处理条件下 SiNAC45在谷子不同组织中的表达。
A: expression pattern of SiNAC045 under different treatments; B: tissues specific expression of SiNAC45 under normal condition and low
potassium treatment condition.
1450 作 物 学 报 第 41卷
2.4 SiNAC45蛋白亚细胞定位分析
将 SiNAC45与 GFP蛋白融合的 SiNAC45-hGFP融合
表达载体和 GFP 空载体分别转入拟南芥原生质体中, 激
光共聚焦显微镜下观察结果显示, 转入对照 GFP 空载体
的 GFP 蛋白在细胞核、细胞质、细胞膜中均有表达; 而
转入 SiNAC45-GFP融合表达载体的原生质体只在细胞核
中能够发现绿色荧光信号, 表明 SiNAC45 定位在细胞核
中(图 4)。
2.5 转 SiNAC45拟南芥低钾胁迫耐性分析
通过在 MS 培养基中分别添加 5 μmol L–1 K+和 10
μmol L–1 K+, 对 2个转 SiNAC45基因拟南芥株系和野生型
拟南芥进行 2种浓度的低钾处理, 结果显示在 MS培养基
上过表达 SiNAC45 的转基因拟南芥的根长、植株鲜重和
根表面积与野生型拟南芥没有明显差别(图 5-A), 而在 5
μmol L–1 K+和 10 μmol L–1 K+的低钾胁迫处理下, 与野生
型拟南芥相比, 过表达 SiNAC45 的转基因拟南芥的根表
面积增大(图 5-A)但并不明显 , 根长增长 , 差异达到极
显著水平(图 5-B), 植株鲜重明显提高, 差异达到显著水
平(图 5-B)。以上结果显示 SiNAC45转基因拟南芥低钾胁
迫的抵抗力显著强于野生型拟南芥。
图 4 SiNAC45 蛋白的亚细胞定位分析结果
Fig. 4 Subcellular localization of SiNAC45 protein
A: 对照 GFP定位于整个细胞; B: SiNAC45-GFP定位于细胞
核中。
A: control GFP; B: SiNAC45-GFP localized in the nuclear.
图 5 SiNAC45 转基因和野生型拟南芥的表型分析
Fig. 5 Phenotype analysis of SiNAC45 transgenic and wild-type Arabidopsis to low potassium stress
A: 对照和低钾处理下的表型, 低钾浓度分别为 5 μmol L–1和 10 μmol L–1。B: 正常条件和低钾处理下的主根长、鲜重和根表面积; 采
用单因素方差分析法对数据统计分析, 柱上不同的小写字母代表柱值在 0.05水平上差异显著, 不同大写字母代表柱值在 0.01水平上
差异显著。
A: phenotype of control and low potassium treatment with 5 μmol L–1 and 10 μmol L–1 K. B: primary root length, fresh weight and root sur-
face under low potassium treatment. Data statically analysis was made by the means of one-way ANOVA. The values marked with different
lower-case letters on the columns are significantly different at the 0.05 probability level; those with different capital letters are significantly
different at the 0.01 probability level.
2.6 钾吸收相关基因的表达分析
为了研究 SiNAC45 耐低钾胁迫的机制, 检测了在低
钾处理下 SiNAC45 下游与钾离子吸收有关基因的表达。
结果(图 6)显示, 在低钾条件下, 在 SiNAC45 转基因拟南
芥中钾离子转运体基因 AKT1和 HAK1的表达量都明显高
于野生型拟南芥, 说明 SiNAC45过表达后通过影响 AKT1
和 HAK1的表达来提高植物对低钾胁迫的耐性。
2.7 SiNAC45转基因拟南芥对 ABA的敏感性
将野生型和过量表达 SiNAC45 转基因拟南芥种子分
别播种于 MS、MS+1 μmol L–1ABA、MS+4 μmol L–1ABA
培养基中的种子萌发试验显示, 在MS培养基中过量表达
SiNAC45 转基因拟南芥和野生型拟南芥种子萌发速率基
本保持一致, 在第 4天以后萌发率维持在 95%左右(图 7-A,
D); 在含 1 μmol L–1ABA的培养基中 SiNAC45转基因拟南
第 9期 王二辉等: 谷子转录因子基因 SiNAC45在拟南芥中对低钾及 ABA的响应 1451
芥的萌发速率明显高于野生型拟南芥(图 6-B), 转基因拟
南芥在第 6天萌发率达到 96%, 野生型拟南芥在第 8天达
到 85% (图 7-E); 在 4 μmol L–1ABA处理时野生型拟南芥
的萌发速率明显比转基因拟南芥慢, 直到第 3天才开始萌
发, 到第 8天达到最高值 71%, 而转基因拟南芥的萌发率
最高为 93% (图 7-C, F)。在 ABA处理下野生型拟南芥种
子的萌发率明显低于 SiNAC45转基因植物, 说明 SiNAC45
过表达降低了对 ABA的敏感性, SiNAC45负调植物 ABA
信号途径。
图 6 低钾处理下转 SiNAC45 基因和野生型拟南芥中与钾相关
下游基因检测
Fig. 6 Testing of downstream gene related to potassium in
SiNAC45 overexpression and wide-type Arabidopsis
图 7 35S::SiNAC45 过表达拟南芥种子在不同 ABA 浓度处理下的萌发率
Fig. 7 Seed germination rates of 35S::SiNAC45 transgenic lines under treatments with different concentrations of ABA
A和 D: 种子在无 ABA处理条件下的萌发率; B和 E: 种子在 1 μmol L–1 ABA处理条件下的萌发率; C和 F: 种子在 4 μmol L–1 ABA处
理条件下的萌发率。
A and D: seed germination rates under the condition without ABA; B and E: seed germination rates under the condition with 1 μmol L–1 ABA;
C and F: seed germination rates under the condition with 4 μmol L–1 ABA.
3 讨论
NAC 转录因子家族是植物中最庞大的家族之一, 其
家族成员的数量在不同物种中差异较大。许多 NAC家族
的成员在作物胁迫响应中发挥重要的作用[37-38]。到目前为
止, 在水稻和拟南芥中发现了 140多种 NAC或 NAC类似
基因, 被分为 5 个亚族[39], 所有已知与胁迫相关的 NAC
类基因被分在第 III亚族[40]。例如, 属于 NAC第三亚族的
SNAC1基因过表达后能提高植物的抗旱性, OsNAC6过表
达能提高植物抗旱性和耐盐性[41]。其他亚族与非生物胁
迫相关的 NAC基因还未见报道。NAC第 I亚族的基因大
多与植物发育相关[42]。本研表明 SiNAC45属于第 I亚族(图
1-A), 可被多种非生物胁迫诱导表达, SiNAC45 在低钾胁
迫处理下表达很高(图 2-A), 在处理 48 h 时 SiNAC45 的
表达量提高了大约35倍 (图2-A) , 在低钾处理条件下
SiNAC45转基因拟南芥的根系明显比野生型拟南芥发达,
鲜重显著大于野生型拟南芥, 表明 SiNAC45过表达后提
高了植物对低钾胁迫的耐性(图4)。这是第一次报道 NAC
类基因家族成员参与植物低钾胁迫的响应, 正向调控植
物对低钾胁迫的耐性。另一方面, 一些 NAC 家族的基因
包括 OsNAC6/SNAC2[43-44]和其他家族基因 OsDREB1A、
OsDREB1B、AtDREB1A、AtDREB1B [45]过表达后能够在
正常条件下延缓植物的生长, 这一表型限制了这些基因
在生产中被应用, 而 SiNAC45转基因拟南芥在正常条件
下和野生型拟南芥的生长一致, 并没有延缓拟南芥的生
长。因此, SiNAC45基因克隆为作物钾高效利用遗传改良
提供了新的候选基因。到目前为止, 在拟南芥中已经发现
71种钾离子通道和钾离子转运体 , 它们被分为6个基因
1452 作 物 学 报 第 41卷
家族, 包括 3 个钾离子通道家族(Shaker、TPK 和 Kir-like
家族)和 3 个转运体家族(KUP/HAK/KT、HKT 和 CPA 家
族)[46]。AKT1 被认为是 Shaker 家族最重要的钾离子运输
通道 , 它在钾离子吸收过程中首先在拟南芥根表皮细胞
中表达 , 进而在钾离子从土壤到根表皮细胞的运输中发
挥重要功能[46]。同时, 还有一些 K+转运体基因能够在低
钾条件下被诱导表达, 例如 AtHAK5、AtKEA5、AtKUP3、
AtCHX13、AtCHX17[47]。在本研究中 , 在低钾条件下 ,
SiNAC45转基因拟南芥中 HAK1和 AKT1的表达量明显高
于野生型拟南芥, 表明 SiNAC45 通过提高 HAK1 和 AKT1
在植物根部的表达来促进植物对钾离子的吸收 , 从而在
低钾胁迫下提高 SiNAC45转基因植株对低钾的耐性。
据报道 , 大多数 ABA 响应基因的启动子区都包含
ABRE元件[48]。OsNAC5和 OsNAC6启动子区域包含 ABA
响应元件 ABRE (ACGTG/TC), OsNAC5和 OsNAC6可以
通过 ABRE响应 ABA[48]。启动子分析结果表明, SiNAC45
的启动子区包含 7个 ABRE元件(表 2), 同时, SiNAC45能
够被 ABA诱导表达, 在 48 h时表达量提高了大约 6倍(图
2-A), 说明 SiNAC45也是通过 ABRE元件响应 ABA处理
的(图 6)。基因功能分析结果显示, SiNAC45在种子萌发期
降低了植物对 ABA 的敏感性, 而在幼苗期却没有表现这
一特点(图 6), 说明 SiNAC45 基因可能在种子萌发期负向
调控植物 ABA信号途径。关于 SiNAC45提高转基因植物
对低钾胁迫的耐性是否与该基因对 ABA的响应相关还有
待进一步分析。本研究初步阐明了谷子 SiNAC45 在低钾
胁迫响应过程中发挥重要作用, 同时负调植物对 ABA 的
反应 , 这些研究结果为我们进一步了解谷子的抗逆机制
提供了新的证据。
References
[1] Olsen A N, Ernst H A, Leggio L L, Skriver K. NAC transcription
factors: structurally distinct, functionally diverse. Trends Plant
Sci, 2005, 10: 79–87.
[2] Ooka H, Satoh K, Doi K, Nagata T, Otomo Y. Comprehensive
analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis
thaliana. DNA Res, 2003, 10: 239–247
[3] Souer E, van Houwelingen A, Kloos D, Mol J, Koes R. The no
apical meristem gene of petunia is required for pattern formation
in embryos and flowers and is expressed at meristem and primor-
dia boundaries. Cell, 1996, 85: 159–170
[4] Le D T, Nishiyama R, Watanabe Y, Mochida K, Yamaguchi-
Shinozaki K. Genome-wide survey and expression analysis of the
plant-specific NAC transcription factor family in soybean during
development and dehydration stress. DNA Res, 2011, 18:
263–276
[5] Singh A K, Sharma V, Pal A K, Acharya V, Ahuja P S. Ge-
nome-wide organization and expression profiling of the NAC
transcription factor familyin potato (Solanum tuberosum L.).
DNA Res, 2013, 20: 403–423
[6] Oliveira T M, Cidade L C, Gesteira A S, Coelho Filho M A,
Soares Filho W S. Analysis of the NAC transcription factor gene
family in citrus reveals a novel member involved in multiple
abiotic stress responses. Tree Genet Genomics, 2011, 7:
1123–1134
[7] Puranik S, Sahu P P, Mandal S N, Parida S K, Prasad M. Com-
prehensive genome-wide survey, genomic constitution and ex-
pression profiling of the NAC transcription factor family in fox-
tail millet (Setaria italica L.). PLoS One, 2013, 8: 645–694
[8] Su H, Zhang S, Yuan X, Chen C, Wang X. Genome-wide analysis
and identification of stress-responsive genes of the NAM-ATAF1,
2-CUC2 transcription factor family in apple. Plant Physiol Bio-
chem, 2013, 71: 11–21
[9] Wang N, Zheng Y, Xin H, Fang L, Li S. Comprehensive analysis
of NAC domain transcription factor gene family in Vitis vinifera.
Plant Cell Rep, 2013, 32: 61–75
[10] Riechmann J L, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang C Z, Keddie J,
Adam L, Pineda O, Ratcliffe O J, Samaha R R, Creelman R,
Pilgrim M, Broun P, Zhang J Z, Ghandehari D, Sherman B K, Yu
G L. Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative
analysis among eukaryotes. Science, 2000, 290: 2105–2110
[11] Ooka H, Satoh K, Doi K, Nagata T, Otomo Y, Murakami K, Ma-
tsubara K, Osato N, Kawai J, Carninci P, Hayashizaki Y, Suzuki
K, Kojima K, Takahara Y, Yamamoto K, Kikuchi S. Comprehen-
sive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabi-
dopsis thaliana. DNA Res, 2003, 10: 239–247
[12] Puranik S, Sahu P P, Srivastava P S, Prasad M. NAC proteins:
regulation and role in stress tolerance. Trends Plant Sci, 2012, 17:
1360–1385
[13] Fang Y, You J, Xie K, Xie W, Xiong L. Systematic sequence
analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive
genes of NAC transcription factor family in rice. Mol Genet
Genomics, 2008, 280: 547–563
[14] Badis G, Berger M F, Philippakis A A, Talukder S, Gehrke A R.
Diversity and complexity in DNA recognition by transcription
factors. Science, 2009, 324: 1720–1723
[15] Luscombe N M, Thornton J M. Protein-DNA interactions: amino
acid conservation and the effects of mutations on binding speci-
ficity. J Mol Biol, 2002, 320: 991–1009
[16] Jensen M K, Kjaersgaard T, Nielsen M M, Galberg P, Petersen K,
O’Shea C, Skriver K. The Arabidopsis thaliana NAC transcrip-
tion factor family: structure-function relationships and determi-
nants of ANAC019 stress signaling. Biochem J, 2010, 426:
183–196
[17] Duval M, Hsieh T F, Kim S Y, Thomas T L. Molecular charac-
terization of AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain
superfamily. Plant Mol Biol, 2002, 50: 237–248
[18] Tran L S, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson S D, Fujita Y, Ma-
ruyama K, Fujita M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki
K. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible
NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-
element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter.
Plant Cell, 2004, 16: 2481–2498
[19] Hegedus D, Yu M, Baldwin D, Gruber M, Sharpe A, Parkin I,
Whitwill S, Lydiate D. Molecular characterization of Brassica
napus NAC domain transcriptional activators induced in response
to biotic and abiotic stress. Plant Mol Biol, 2003, 53: 383–397
[20] Ashley M K, Grant M, Grabov A. Plant responses to potassium
第 9期 王二辉等: 谷子转录因子基因 SiNAC45在拟南芥中对低钾及 ABA的响应 1453
deficiencies: a role for potassium transport proteins. J Exp Bot,
2006, 57: 425–436
[21] Lopez-Bucio J, Cruz-Ramirez A, Herrera-Estrella L. The role of
nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin
Plant Biol, 2003, 6: 280–287
[22] Gierth M, Maser P, Schroeder J I. The potassium transporter
AtHAK5 functions in K+ deprivation-induced high-affinity K+
uptake and AKT1 K+ channel contribution to K+ uptake kinetics
in Arabidopsis roots. Plant Physiol, 2005, 137: 1105–1114
[23] Shin R, Schachtman D P. Hydrogen peroxide mediates plant root
response to nutrient deprivation. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,
101: 8827–8832
[24] Fu H H, Luan S. AtKUP1: a dual-affinity K+ transporter from
Arabidopsis. Plant Cell, 1998, 10: 63–73
[25] Anderson J A, Huprikar S S, Kochian L V, Lucas W J, Gaber R F.
Functional expression of a probable Arabidopsis thaliana potas-
sium channel in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci
USA, 1992, 89: 3736–3740
[26] Hosy E, Vavasseur A, Mouline K, Dreyer I, Gaymard F, Porée F,
Boucherez J, Lebaudy A, Bouchez D, Very A A, Simonneau T,
Thibaud J B, Sentenac H. The Arabidopsis outward K+ channel
GORK is involved in regulation of stomatal movements and plant
transpiration. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 5549–5554
[27] Rigas S, Debrosses G, Haralampidis K, Vicente-Agullo F,
Feldmann K A, Grabov A, Dolan L, Hatzopoulos P. TRH1 en-
codes a potassium transporter required for tip growth in Arabi-
dopsis root hairs. Plant Cell, 2001, 13: 139–151
[28] Beehtold N, Ellis J, Pelletier G. In plant Agrobacterium mediated
gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants.
Life Sci, 1993, 316: 1194–1199
[29] Yoo S D, Cho Y H, Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a
versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat
Prot, 2007, 2: 1565–1572
[30] Zhang Z L, Xie Z, Zou X, Casaretto J, Ho T H, Shen Q J. A
rice WRKY gene encodes a trans-criptional repressor of the
gibberellin signaling pathway in aleurone cells. Plant Physiol,
2004, 134: 1500–1513
[31] Yu D, Chen C, Chen Z. Evidence for an important role of WRKY
DNA binding proteins in the regulation of NPR1 gene expression.
Plant Cell, 2001, 13: 1527–1540
[32] Baker S S, Wilhelm K S, Thomashow M F. The 5-region of
Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that con-
fer cold, drought and ABA regulated gene expression. Plant
Mol Biol, 1994, 24: 701–713
[33] Urao T, Yamaguchi-Shinozaki K, Urao S, Shinozaki K. An
Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress
and its gene product binds to the conserved MYB recognition
sequence. Plant Cell, 1993, 5: 1529–1539
[34] Simpson S D, Nakashima K, Narusaka Y, Seki M, Shinozaki
K, Yamaguchi-Shinozaki K. Two different novel cis-acting
elements of erd1, a clpA homologous Arabidopsis gene func-
tion in induction by dehydration stress and dark-induced se-
nescence. Plant J, 2003, 33: 259–270
[35] Abe H, Urao T, Ito T, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-
Shinozaki K. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2
(MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid
signaling. Plant Cell, 2003, 15: 63–78
[36] Terzaghi W B, Cashmore A R. Light-regulated transcription.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1995, 46: 445–474
[37] Zhang J Z, Creelman R A, Zhu J K. Using information from
Arabidopsis to engineer salt, cold, and drought tolerance in crops.
Plant Physiol, 2004, 135: 615–621
[38] Umezawa T, Fujita M, Fujita Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shino-
zaki K. Engineering drought tolerance in plants: discovering and
tailoring genes to unlock the future. Curr Opin Biotechnol, 2006,
17: 113–122
[39] Collinge M, Boller T. Differential induction of two potato genes,
Stprx2 and StNAC, in response to infection by Phytophthora in-
festans and to wounding. Plant Mol Biol, 2001, 46: 521–529
[40] Hegedus D, Yu M, Baldwin D, Gruber M, Sharpe A, Parkin I,
Whitwill S, Lydiate D. Molecular characterization of Brassica
napus NAC domain transcriptional activators induced in response
to biotic and abiotic stress. Plant Mol Biol, 2003, 53: 383–397
[41] Xie Q, Sanz-Burgos H, Guo J A, García C, Gutiérrez. GRAB
proteins, novel members of the NAC domain family, isolated by
their interaction with a geminivirus protein. Plant Mol Biol, 1999,
39: 647–656
[42] Lu P L, Chen N Z, An R, Su Z, Qi B S, Ren F, Chen J, Wang X C.
A novel drought-inducible gene, ATAF1, encodes a NAC family
protein that negatively regulates the expression of stress-respon-
sive genes in Arabidopsis. Plant Mol Biol, 2007, 63: 289–305
[43] Fang Y, You J, Xie K, Xie W, Xiong L. Systematic sequence
analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive
genes of NAC transcription factor family in rice. Mol Genet Ge-
nomics, 2008, 280: 547–563
[44] Nakashima K, Tran L S, Van Nguyen D, Fujita M, Maruyama K,
Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki
K. Functional analysis of a NAC-type transcription factor Os-
NAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene ex-
pression in rice. Plant J, 2007, 51: 617–630
[45] Hu H, You J, Fang Y, Zhu X, Qi Z, Xiong L. Characterization of
transcription factor gene SNAC2 conferring cold and salt toler-
ance in rice. Plant Mol Biol, 2008, 67: 169–181
[46] Sentenac H, Bonneaud N, Minet M, Lacroute F, Salmon J M,
Gaymard F, Grignon C. Cloning and expression in yeast of a
plant potassium ion transport system. Science, 1992, 256:
663–665
[47] Kim E J, Kwak J M, Uozumi N, Schroeder J I. AtKUP1: an
Arabidopsis gene encoding high-affinity potassium transport ac-
tivity. Plant Cell, 1998, 10: 51–62
[48] Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Transcriptional regu-
latory networks in cellular responses and tolerance to dehy-
dration and cold stresses. Annu Rev Plant Biol, 2006, 57:
781–803