全 文 ：基金项目：国家自然科学基金项目(No. 30623012)
收稿日期：2014-06-05 接受日期：2014-08-17
拟南芥RabD2b保守半胱氨酸的缺失或突变影响其定位和功能
王芳 刘超 吴江生 刘克德*
华中农业大学植物科学技术学院，武汉 430070
*通讯作者，kdliu@mail.hzau.edu.cn
摘 要 Rab蛋白羧基末端含有保守的半胱氨酸残基，是蛋白质翻译后进行异戊二烯化修饰的位点。本
研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变型RabD2b为对象，用定点突变的方法，获得AtRabD2b羧基末端
第199位和200位保守半胱氨酸残基共同缺失的突变基因AtRabD2bΔCC，及第199位保守半胱氨酸残基突
变为丝氨酸的基因AtRabD2bC199S。将突变基因瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)叶片或稳定转化拟南芥，
发现两种突变蛋白都定位在细胞质中，而野生型AtRabD2b蛋白则主要定位在高尔基体上。酵母温敏突
变体 ypt1产生的温度致死表型能够通过转化AtRabD2b获得恢复，而突变后的AtRabD2b均丧失了恢复
功能。结果表明，拟南芥AtRabD2b羧基末端单个保守半胱氨酸残基的突变或两个保守半胱氨酸的缺失
都会影响其亚细胞定位和功能发挥。本研究为深入开展植物Rab蛋白的异戊二烯化修饰机制提供参考
资料。
关键词 AtRabD2b，保守半胱氨酸，异戊二烯化修饰，定位，功能
Membrane Localization and Function of Arabidopsis RabD2b was
Influenced by the Lacking or Mutation of the Conserved Cystein
Residues
WANG Fang LIU Chao WU Jiang-Sheng LIU Ke-De*
College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
* Corresponding author, kdliu@mail.hzau.edu.cn
Abstract Rab proteins have the conserved cystein residues at C terminus, which are the prenylational
modification site after protein translation. In this study, we obtained Arabidopsis RabD2b mutant alleles with
either lacking both two conserved cystein residues at 199 and 200 (AtRabD2bΔCC) or altering one conserved
cystein residue at 199 to serine residue (AtRabD2bC199S) by site mutation. When the mutated genes were
transiently transformed into tobacco(Nicotiana tabacum) leaves or stably transformed into Arabidopsis, it was
found that they were both targeted to the cytoplasm, while wild- type AtRabD2b was mainly localized on
Golgi stacks. The lethal phenotype at certain temperature of Yeast Ypt1, a temperature-sensitive mutant stain,
could be recovered by the transformation of AtRabD2b. However, two mutant AtRabD2b proteins both lost
the complementary ability. These results suggested that the mutation of single conserved cystein residue or
lacking of the two conserved cystein residues at C terminus affected the localization and function of
AtRabD2b. The results provide the reference data for further study on the mechanism of plant Rab
prenylational modification.
Keywords AtRabD2b, Conserved cystein residues, Prenylation, Localization, Function
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2015, 23(1): 12~19
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.01.002
小G蛋白(small GTP-binding protein)是一种小
分子量(21~30 kD)的单体鸟苷酸结合蛋白，普遍存
在于真核生物细胞中。所有的小G蛋白都从属于
Ras超基因家族。Rab是Ras超基因家族中最大的
一个蛋白家族，定位在特定的细胞器膜上，通过与
三磷酸鸟苷酸(guanosine diphosphate, GTP)或二磷
酸鸟苷酸(guanosine-5′-triphosphate, GDP)的结合转
换，调节细胞内不同细胞器间的囊泡运输过程
(Nielsen et al., 2008; Agarwal et al., 2009)。根据其
结构和功能的保守性，拟南芥(Arabidopsis thaliana)
Rab GTPase又分为AtRabA~AtRabH 8个亚家族，
其中AtRabD亚家族有AtRabD1、AtRabD2a、AtRa-
bD2b和AtRabD2c 4个成员(Pinheiro et al., 2009)。
AtRabD的氨基酸序列与酵母的Ypt1和哺乳动物
的Rab1都有很高的同源性。Ypt1和Rab1主要调
节蛋白质早期分泌途径中从内质网到高尔基体的
囊泡运输过程 (Segev et al., 1988, Plutner et al.,
1991)。Wang等(2012)研究发现AtRabD2b定位在
细胞的高尔基体等点状细胞器结构中，转化酵母温
敏突变体 ypt1后能够互补 ypt1的生长缺陷，推测
AtRabD2b在植物体内行使类似Ypt1的囊泡运输
功能。
大多数Rab蛋白的羧基末端都含有两个保守
的半胱氨酸(cysteine, C)残基，和蛋白质翻译后进
行的异戊二烯化修饰有关。Rab蛋白通常以CXC，
CC，CCX，CCXX和CCXXX(X代表任意氨基酸)的
序列形式存在(Calero et al., 2003)。新合成的Rab
蛋白弥散在细胞质中，不具有功能活性。Rab GG-
TaseⅡ (geranylgeranyl transferase-Ⅱ)和 REP(Rab
escort protein)形成的复合体能够催化类异戊二烯
基团香叶酰香叶酰分子共价结合在Rab蛋白羧基
末端的两个保守半胱氨酸残基上，使其产生厌水的
分子结构，从而锚定到特定的细胞器膜上，行使囊
泡运输的功能(Leung et al., 2006)。目前已有研究
表明，酵母Ypt1蛋白羧基末端两个保守的半胱氨
酸残基缺失或者其中一个半胱氨酸残基突变均导
致Ypt1的定位从高尔基体转移到细胞质，正常的
囊泡运输功能也受到影响(Calero et al., 2003)。哺
乳动物的Rab5a和Rab27a的正确膜定位也依赖于
蛋白质翻译后的异戊二烯化修饰 (Gomes et al.,
2003)。相对来说，植物Rab蛋白在这方面的研究
较少，目前有研究表明，拟南芥RabH1b和RabF2b
羧基末端两个保守半胱氨酸突变为丝氨酸(Serine,
S)后，由细胞器膜特异定位转变为细胞质定位，但
定位改变是否进一步影响 Rab的功能还不清楚
(Kotzer et al., 2004; Johansen et al., 2009)。为了探
索植物Rab蛋白是否具有和动物及微生物一些Rab
蛋白类似的异戊二烯化修饰特点，其保守半胱氨酸
突变是否影响其亚细胞定位及功能，本研究以拟南
芥RabD2b为研究对象，分析了AtRabD2b羧基末
端保守的半胱氨酸突变或缺失对AtRabD2b定位和
功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料及其生长条件
哥伦比亚生态型(Columbia)拟南芥(Arabidopsis
thaliana)种子点播在营养土(蛭石∶腐植土＝1∶1)中，
置于(20±2) ℃，16 h光照/8 h黑暗，150 µmol/(m2·s)
照度的培养箱中生长。烟草(Nicotiana tabacum)的
种植条件同拟南芥。
1.1.2 菌株及质粒
菌株：大肠杆菌 (Escherichia coli)菌株 DH5α、
DB3.1和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌
株GV3101均为本研究室保存；野生型酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)菌株NSY125和 ypt1温敏
突变型酵母菌株ASY01由中国热带农科院热带作
物生物技术研究所张家明教授(Zhang et al., 2006)
馈赠。
质粒：pGEM-T载体购自Promega(美国)；Golgi
标记载体GmMan1-CFP购自拟南芥生物研究中心
(Nelson et al., 2007)。包含 AtRabD2b 全长 CDS
(coding DNA sequence)序列的 pT-D2b为本实验室
构建并保存；亚细胞定位载体pEarleygate104和BP
反应载体 pDONR221为加拿大农业部南方植物保
护和食品研究中心崔玉海研究员馈赠；酵母菌转化
载体pYX142由张家明教授馈赠。
1. 2 方法
1.2.1 亚细胞定位载体的构建
以 pT-D2b质粒DNA为模板，用含有 attb1和
attb2接头的引物 attb1-RabD2bF和attb2-RabD2bR、
attb1- RabD2bF 和 attb2- RabD2bC199SR，以及 attb1-
RabD2bF和 attb2-RabD2bΔCC R(引物序列见表 1)分
拟南芥RabD2b保守半胱氨酸的缺失或突变影响其定位和功能
Localization and Function of Arabidopsis RabD2b was Influenced by Lacking or Mutation of Conserved Cystein Residues 13
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
别扩增野生型 AtRabD2b、突变型 AtRabD2bC199S和
AtRabD2bΔCC的 CDS 序列。PCR 反应体系为：1×
PCR buffer、MgCl2 (25 mmol/L) 1.5 μL、dNTPs(10
mmol/L) 0.5 μL、正反向引物 (10 μmol/L) 各 1.25
μL、Taq DNA聚合酶 1.5 U、模板约 50 ng，加水至
25 μL；反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃
30 s，72 ℃ 1 min扩增30个循环；72 ℃延伸7 min，
4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂
盒(上海捷瑞)纯化后，分别与 pDONR221和 pEar-
leygate104发生BP和LR重组反应，BP和LR反应
体系参照 Invitrogen(美国)试剂盒方案进行。LR反
应产物转化DH5α后挑取阳性质粒用HindⅢ酶切
并测序鉴定，获得 p104-D2b、p104-D2bC199S和 p104-
D2bΔCC。
1.2.2 农杆菌介导的烟草瞬时表达和亚细胞定位
观察
通过电转化法分别将亚细胞定位载体转入农
杆菌GV3101。挑取单菌落，接种到 3 mL含有 50
mg/L kanamycin、50 mg/L rifampicin 和 50 mg/L
gentamycin抗生素的LB培养基中，28 ℃过夜培养
后收集菌体；菌液浸染烟草叶片的方法参照Wang
等(2012)的方案进行。将浸染后的烟草叶片浇水
后置于暗光处室温培养48~72 h。剪取浸染部分叶
片制备组织切片，在激光共聚焦显微镜 (Leica
DMIRE2, Germany)下观察并拍照。黄色荧光
(YFP)和青色荧光(CFP)的激发光波长分别设置为
514和 405 nm，发射波长范围分别为 505~530和
450~470 nm。
1.2.3 拟南芥的稳定转化和亚细胞定位观察
拟南芥的稳定转化采用沾花法进行(Clough,
Bent, 1998)。T0代转基因种子用 75%酒精消毒 1
min后，在50% 84消毒液中处理8 min，用ddH2O清
洗 3次，播种在含有 50 mg/L Basta的MS培养基
中。对初步筛选获得的阳性幼苗的根尖部位制备
组织切片并进行激光共聚焦显微镜观察，YFP和
CFP的观察波长同上。
1.2.4 酵母菌表达载体的构建
以pT-D2b质粒DNA为模板，用含有EcoRⅠ和
XhoⅠ酶切位点的引物 RabD2bEF和 RabD2bXR
(表 1)扩增AtRabD2b的CDS序列。PCR反应体系
和反应条件同1.2.1。AtRabD2bC199S和AtRabD2bΔCC序
列 的 扩 增 引 物 则 分 别 为 RabD2bEF 和
正向引物(5~3)
Forward prime
attb1-RabD2bF: GGGGACA
AGTTTGTACAAAAAAGC
AGGCTTAATGAATCCTGA
ATATGACTATC(attb1 adapter)
RabD2bEF: CGAGAATTCA
TGAATCCTGAATATGACT
ATCTGT(EcoRⅠrestriction site)
反向引物(5~3)
Reverse prime
attb2-RabD2bR: GGGGACCACTTTGT
ACAAGAAAGCTGGGTATCAAGAA
GAACAACAGCCTG(attb2 adapter)
attb2-RabD2bC199SR: GGGGACCACTTT
GTACAAGAAAGCTGGGTATCAAG
AAGAACAAGAGCCTG(attb2 adapter)
attb2-RabD2bΔCCR: GGGGACCACTTT
GTACAAGAAAGCTGGGTATCAAG
AAGAGCCTGATTGCTG(attb2 adapter)
RabD2bXR: GAGCTCGAGTCAAGAA
GAACAACAGCCTG(XhoⅠrestriction
site)
RabD2bC199XR: GAGCTCGAGTCAAG
AAGAACAAGAGCCTG(XhoⅠ restric-
tion site)
RabD2bΔ CCXR: GAGCTCGAGTCAAG
AAGAGCCTGATTGCTG(XhoI restric-
tion site)
产物大小/bp
Production length
669
669
663
627
627
621
用途
Purpose
构建AtRabD2b亚细胞定位载体
Construction of the vector for
AtRabD2b subcellular localization
构建AtRabD2bC199S亚细胞定位载体
Construction of the vector for
AtRabD2bC199Ssubcellular localization
构建AtRabD2bΔCC的亚细胞定位载体
Construction of the vector for
AtRabD2bC199Ssubcellular localization
构建AtRabD2b的酵母表达载体
Construction of the yeast expression
vector forAtRabD2b
构建AtRabD2bC199S的酵母表达载体
Construction of the yeast expression
vector forAtRabD2bC199S
构建AtRabD2bΔCC的酵母表达载体
Construction of the yeast expression
vector forAtRabD2bΔCC
表 1 本研究所用引物序列
Table 1 The primers used in the study
14
RabD2bC199XR，RabD2bEF和 RabD2bΔCCXR(表 1) 。
PCR产物纯化后,用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,然后与
用 EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切后的 pYX142线状载体连
接，转化大肠杆菌DH5α。用碱裂解法提取阳性克
隆的质粒，并进行酶切鉴定和测序验证，获得转化
载体 pYX142- D2b、pYX142- D2bC199S 和 pYX142-
D2bΔCC。
1.2.5 酵母转化实验
温敏突变型酵母菌株ASY01的感受态制备及
转化参考 Clontech公司 (美国)的酵母操作手册
(Yeast Protocols Handbook, PT3024-1)进行。待酵母
菌长出后，随机挑取单克隆接种到SD-Leu(6.7 g/L
YNB、20 g/L葡萄糖和不含Leu的氨基酸混合物)液
体培养基中，振荡培养24 h后，取少量液体培养物在
SD-Leu固体培养基上划线，并置于26和37 ℃培养
箱中观察生长情况。NSY125和转化了pYX142空
载体的ASY01分别作为阳性和阴性对照。
2 结果与分析
2.1 AtRabD2b保守半胱氨酸残基缺失或突变对
亚细胞定位的影响
2.1.1 突变型AtRabD2b瞬时转化烟草的亚细胞
定位观察
为了检测AtRabD2b亚细胞定位是否受到羧基
末端两个保守半胱氨酸残基的影响，本研究采用定
点突变的方法将AtRabD2b第 199和 200位的两个
保守半胱氨酸残基缺失，获得突变序列 AtRa⁃
bd2bΔCC，该突变预期产生一种不能被异戊二烯化修
饰的突变蛋白。另外，通过定点突变还产生了
AtRabD2b第199位保守的半胱氨酸残基突变为丝
氨酸(Serine, S)的突变序列 AtRabd2bC199S，获得一种
只有在第 200位的半胱氨酸残基进行了异戊二烯
化修饰的突变蛋白。通过 BP和 LR重组反应将
AtRabD2b编码序列和两个突变序列分别克隆到载
体 pEarleygate104上，构建了野生型或者突变型
AtRabD2b与黄色荧光蛋白(YFP)的羧基端融合的
亚细胞定位载体 p104-D2b、p104-D2bC199S和 p104-
D2bΔCC。3个重组载体经HindⅢ单酶切后产生异于
对照质粒 pEarleygate104的酶切图谱，而且酶切片
段大小与预测的相符(图 1)，测序进一步证实载体
上插入的外源片段没有发生碱基突变并且与YFP
的羧基端进行了正确的融合。
前期研究将 p104-D2b转化烟草叶片进行瞬时
表达，结果表明，AtRabD2b主要定位在包含高尔基
体的点状结构上(Wang et al., 2012)。本研究中，将
新构建的两个载体p104-D2bC199S和p104-D2bΔCC分别
在烟草叶片中瞬时表达，转化48~72 h在荧光共聚
焦显微镜下观察浸染叶片的表皮细胞。和野生型
AtRabD2b的点状结构定位不同 (图 2A~C)，表达
YFP-AtRabD2bC199S(图 2D~F)和YFP-AtRabD2bΔCC(图
2G~I)的烟草表皮细胞的黄色荧光主要弥散在细胞
质中，表明突变后的AtRabD2b改变了Rab蛋白的
正常定位。
2.1.2 拟南芥稳定转化突变型AtRabD2b的亚细胞
定位观察
进一步将3个重组载体p104-D2b、p104-D2bC199S
和p104-D2bΔCC分别稳定转化野生型拟南芥，3种类
型的转基因T0代种子经Basta筛选后，每种分别选
取6株阳性幼苗，剪取根尖部分在激光共聚焦显微
镜下观察。在所有阳性幼苗的根尖细胞都观察到
了黄色荧光，推测转化的外源基因在转基因植株中
进行了有效表达。观察p104-D2b拟南芥阳性转化
植株发现黄色荧光主要集中在根尖细胞的点状结
构上(图3A)，与前面瞬时转化烟草后观察的结果一
致。而AtRabD2bC199S和AtRabD2bΔCC的定位则明显不
同，主要分布在细胞质中(图 3B和 3C)。结果进一
步证实AtRabD2b羧基末端保守半胱氨酸的突变或
缺失都会对蛋白定位产生影响。
10
1
0.75
0.50
kb M 1 2 3 4
图 1 p104-D2b、p104-D2bC199S和 p104-D2bΔCC重组载体的
HindⅢ酶切检测
Figure 1 Identification of the recombinant plasmids p104-
D2b, p104-D2bC199S and p104-D2bΔCC digested by HindⅢ
M：分子量标准；1：HindⅢ酶切 pEarleyGate104；2~4：HindⅢ
酶切p104-D2b、p104-D2bC199S和p104-D2bΔCC
M: DNA marker; 1: pEarleyGate104 digested by HindⅢ; 2~4:
p104-D2b, p104-D2bC199S and p104-D2bΔCC digested by HindⅢ,
respectively
拟南芥RabD2b保守半胱氨酸的缺失或突变影响其定位和功能
Localization and Function of Arabidopsis RabD2b was Influenced by Lacking or Mutation of Conserved Cystein Residues 15
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图 2 野生型和突变型AtRabD2b在烟草表皮细胞的亚细胞定位
Figure 2 The subcellular localization of wild-type andmutant AtRabD2b in transiently transformed tobacco epidermal cells
A、D和G：AtRabD2b、AtRabD2bC199S和 AtRabD2bΔCC转化烟草后检测到的黄色荧光定位；B、E和H：高尔基体标记蛋白Gm-
Man1转化烟草后检测到的青色荧光定位；C、F和 I：分别为A和B，D和E，G和H进行叠加后的荧光图。C中箭头表示
AtRabD2b定位的点状结构和高尔基体重叠
A, D and G: The detected localization of yellow fluorescence in tobacco leaf epidermal cells expressing AtRabD2b, AtRa⁃
bD2bC199S and AtRabD2bΔCC, respectively; B, E and H: The detected localization of cyan fluorescence in tobacco leaf epidermal
cells expressing GmMan1, a Golgi marker protein; C, F and I: A merge of picture A and B, picture D and E, picture G and H, re-
spectively. Arrow in the picture of C indicates that the localized punctate structures of AtRabD2b are overlapped with Golgi-asso-
ciated structures
AtRabD2b
AtRabD2bC199S
AtRabD2bΔCC
GmMan1-CFPYFP Merge
A B C
D E F
G H I
5 µm 5 µm 5 µm
5 µm 5 µm 5 µm
5 µm 5 µm 5 µm
图 3 野生型和突变型AtRabD2b在稳定转化的拟南芥根尖细胞的亚细胞定位观察
Figure 3 The subcellular localization of wild-type and mutant AtRabD2b in root tip cells of stably transformed Arabi⁃
dopsis plants
A：野生型AtRabD2b定位在拟南芥根尖细胞的点状结构中；B和C：AtRabD2bC199S和AtRabD2bΔCC分别弥散在拟南芥根尖细胞
的细胞质中
A: Wild-type AtRabD2b is sublocalized on the punctate structures in root tip cells of Arabidopsis; B and C: Mutated AtRabD2bC199S
and AtRabD2bΔCC are both diffused in the cytoplasm
A B C
5 µm 5 µm 5 µm
16
2.2 保守半胱氨酸缺失或突变对AtRabD2b功能的
影响
Rab蛋白正常功能的发挥与其特异的膜定位
密切相关。羧基末端保守半胱氨酸的缺失和突变
不仅改变了酵母Ypt1的正确定位，而且影响了其
正常功能(Calero et al., 2003)。Wang等(2012)研究
表明拟南芥 AtRabD2b 转化酵母温敏突变体
ASY01后，能够互补 Ypt1突变产生的生长缺陷。
本研究检测了两种突变型AtRabD2b对 Ypt1互补
效应的影响。通过PCR扩增野生型和两种突变型
AtRabD2b的编码序列后，将其克隆到酵母转化载
体 pYX142的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间。用EcoR
Ⅰ和XhoⅠ双酶切检测重组质粒，酶切电泳图 4显
示所有重组载体都含有与预期大小一致的外源基
因片段。测序进一步证实了外源片段的碱基没有
发生突变，因此获得了酵母菌重组表达载体
pYX142-D2b、pYX142-D2bC199S和pYX142-D2bΔCC。
将 上 述 表 达 载 体 pYX142- D2b、pYX142-
D2bC199S和 pYX142-D2bΔCC分别转化酵母菌ASY01
进行组成性表达。ASY01菌株的Ypt1蛋白第 136
位氨基酸序列由A突变为D，抑制了Ypt1的蛋白分
泌功能，导致该酵母菌在非限制性条件下(26 ℃)能
够正常生长，而在限制性温度(37 ℃)下生长受到抑
制。AtRabD2b转化ASY01后，转化子在 26 ℃和
37 ℃均能正常生长，说明AtRabD2b互补了Ypt1的
缺陷表型(图 5)，与前面的研究结果一致(Wang et
al., 2012)。而转化了AtRabD2bC199S和AtRabD2bΔCC的
转化子仅能在 26 ℃条件下正常生长，在 37 ℃产生
致死现象，表明突变蛋白均丧失了互补Ypt1突变表
型的能力。该研究结果表明，AtRabD2b羧基末端
保守半胱氨酸突变或者缺失不仅改变了其正确定
位，而且对其在细胞内的正常功能有影响。
3 讨论
细胞内细胞器之间的物质交换主要是由一些
小的囊泡调节。Rab蛋白负责调控囊泡的出芽、运
输及囊泡与受体膜的融合等过程 (Ali et al.,
2004)。通过与GTP或GDP的结合，Rab蛋白在活
性与非活性形式之间进行循环，从而发挥分子开关
kb M 1 2 3
10
1
0.75
0.50
图 4 重组酵母表达载体的EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定
Figure 4 Identification of recombinant yeast expression
vectors digested with EcoRⅠand XhoⅠ
M：分子量标记；1~3：EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 pYX142-D2b、
pYX142-D2bC199S和pYX142-D2bΔCC
M: DNA marker; 1~3: pYX142- D2b, pYX142- D2bC199S and
pYX142-D2bΔCC were digested with EcoRⅠand XhoⅠ, respec-
tively
拟南芥RabD2b保守半胱氨酸的缺失或突变影响其定位和功能
Localization and Function of Arabidopsis RabD2b was Influenced by Lacking or Mutation of Conserved Cystein Residues
图 5 野生型及突变型AtRabD2b对酵母温敏突变体ypt1的功能互补测验
Figure 5 Functional complementary analysis of wild-type and mutant alleles of AtRabD2b to yeast temperature-sensi⁃
tive mutant ypt1
A：所有酵母转化子均能在26 ℃正常生长；B：AtRabD2b转化子在37 ℃条件下生长良好，而AtRabD2bC199S和AtRabD2bΔCC转化
子的生长受到抑制；C：显示A和B两个图中转化子对应的名称。野生型NSY125菌株作为正(+)对照，含有pYX142载体的
ASY01菌株作为负对照(-)
A: All the yeast transformants grew well at 26 ℃; B: AtRabD2b yeast transformant grew well in 37 ℃, while the growth of AtRa⁃
bD2bC199S and AtRabD2bΔCC yeast transformant was inhibited. C: Name of the corresponding yeast transformants in A and B pic-
tures. Wild-type yeast strain NSY125 is a positive control (+), and the ASY01 stain transformant introduced with pYX142 is a
negative control (-)
26 ℃ 37 ℃
A B C
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的功能。活性形式的Rab定位在特定的细胞器膜
上，能够募集相应的效应蛋白并激活信号的传递，
因此Rab蛋白功能的正确发挥与其特异的膜定位
密切相关(Woollard et al., 2008)。目前已知 Rab 4
个保守的鸟嘌呤结合结构域和效应因子结构域上
重要氨基酸位点的突变会影响Rab的膜定位，如烟
草Rab2(NtRab2)蛋白G4鸟嘌呤结构域处保守的氨
基酸天冬酰胺(asparagine, N)突变为异亮氨酸(iso-
leucine, I)后，突变蛋白由特异的高尔基体定位变为
细胞质弥散定位(Cheung et al., 2002)。除此之外，
Rab蛋白羧基端还含有保守的半胱氨酸结构域，与
蛋白质翻译后进行的异戊二烯化修饰有关，酵母和
动物Rab蛋白的研究证实保守半胱氨酸进行的异
戊二烯化修饰是Rab蛋白正确膜定位的前提条件
(Calero et al., 2003; Gomes et al., 2003)。本研究通
过突变拟南芥RabD2b蛋白的半胱氨酸残基，获得
不能被异戊二烯化修饰或仅有单个半胱氨酸残基
被异戊二烯化修饰的AtRabD2b突变蛋白，发现两
种突变蛋白均影响了AtRabD2b的定位和功能，揭
示了AtRabD2b保守半胱氨酸的重要性，为深入研
究植物Rab蛋白的异戊二烯化修饰机制提供理论
依据。
除了Ran家族成员，小G蛋白其他家族成员都
存在翻译后的脂修饰过程 (Leung et al., 2006 )。脂
修饰促使其产生厌水的蛋白结构，从而帮助小G蛋
白从细胞质移动到特异的细胞膜表面发挥功能
(Casey, Seabra, 1996)。异戊二烯化修饰是脂修饰
中最为常见的一种方式，主要是将 15个或者 20个
C长度的焦磷酸盐共价结合到小G蛋白羧基末端
的保守结构域上(Lane, Beese, 2006)，。大多数Rab
蛋白的羧基末端含有两个保守的半胱氨酸残基，均
能够共价结合 20个C长度的焦磷酸盐，从而完成
翻译后的异戊二烯化修饰过程。修饰后的Rab蛋
白比修饰前多了2个长的亲脂尾巴，易于插入细胞
器膜的脂质双分子层，从而形成稳定的膜定位结
构 (Leung et al., 2006)。本研究中AtRabD2b去除
两个保守半胱氨酸残基后，突变蛋白定位由特异的
高尔基体膜定位变为细胞质定位，而且突变蛋白也
丧失了互补ypt1的突变表型的能力，说明保守半胱
氨酸残基对AtRabD2b的定位和功能都具有重要的
作用。
有少数Rab蛋白的羧基端只含有 1个保守的
半胱氨酸残基，通常以 CXXX的形式出现，如
Rab8a拥有CVLL这样的保守羧基末端，此种Rab
蛋白仅被单个香叶酰香叶酰分子修饰，但也能够锚
定到细胞器膜上发挥正常功能 (Leung et al.,
2006)。本研究利用定点突变将第 199位的保守半
胱氨酸残基突变，获得1个单异戊二烯化修饰的突
变蛋白，发现AtRabD2b的定位由高尔基体特异定
位转变为细胞质定位，与前面研究中的酵母Ypt1、
拟南芥AtRabF2b和AtRabH1b突变后蛋白定位的
改变类似(Calero et al., 2003; Kotzer et al., 2004; Jo-
hansen et al., 2009)；另外，突变蛋白的功能也发生
了改变，说明仅存的第200位的单个保守半胱氨酸
残基不足以维持AtRabD2b的正常功能。一些Rab
蛋白只需要单个异戊二烯化修饰，而另一些则必须
进行双异戊二烯化修饰才能进行正确的定位，可能
与其进行修饰时参与的修饰酶和修饰蛋白不同有
关，如Rab8a是Rab GGTaseⅠ(geranylgeranyl trans-
ferase-Ⅰ)和REP的潜在底物，而双异戊二烯化修
饰的Rab蛋白大多需要Rab GGTaseⅡ和REP的共
同修饰，但详细的作用机制还不清楚，因此有必要
深入研究AtRabD2b异戊二烯化修饰的机制，进而
推进植物Rab蛋白功能的研究。
4 结论
本研究以拟南芥AtRabD2b为研究对象，通过
定点突变获得其在异戊二烯化修饰的保守半胱氨
酸位点发生突变或缺失的突变基因AtRabD2bC199S和
AtRabD2bΔCC，并研究了突变对其亚细胞定位及功能
的影响。结果表明，突变后的两个蛋白均改变了
AtRabD2b的正常定位，并丧失了互补酵母温敏突
变体Ypt1的功能。研究结果为进一步深入揭示植
物Rab蛋白异戊二烯化修饰的详细机制提供了基
础资料。
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拟南芥RabD2b保守半胱氨酸的缺失或突变影响其定位和功能
Localization and Function of Arabidopsis RabD2b was Influenced by Lacking or Mutation of Conserved Cystein Residues
(责任编辑 任立刚)
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